細(xì)胞培養(yǎng)基本知識基本技術(shù)ppt課件

細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識、細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識、 基本技術(shù)基本技術(shù) 主要內(nèi)容： 1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識 2、培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 3、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù) 一、一、 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 把取得的組織用機械或消化的方法分 散成單個細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸 液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長 繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特 性。 培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的特性1 -1 -生長方式及類型生長方式及類型 貼附型、懸浮型 培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的特性2 - 2 - 增殖特點增殖特點 體外培養(yǎng)的細(xì)胞既保持了一定的體內(nèi)細(xì) 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 點。 貼附-伸展 接觸抑制-增殖的密度抑制 貼附貼附- -伸展伸展 接觸抑制 當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞導(dǎo)致無處 可去而保持接觸時，細(xì)胞不再移動， 在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜活動將停止。 因此，一般正常細(xì)胞并不相互重疊于 其上生長。 細(xì)胞增殖密度抑制 當(dāng)細(xì)胞生長匯合形成單層時，細(xì)胞變得比 較擁擠，這時其分裂停止，這種細(xì)胞可在 靜止?fàn)顟B(tài)下維持存活一段時間，但不會繼 續(xù)分裂生殖。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，他們 的接觸抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以 增殖至較高的終末細(xì)胞密度。 培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的特性3 -3 -生長過程生長過程 單個細(xì)胞增殖：細(xì)胞周期細(xì)胞周期 高等生物體，細(xì)胞周期時間的長短變化主 要集中在G1期，S，G2和M期基本保持穩(wěn) 定。 Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h 一群細(xì)胞的增殖：細(xì)胞生長曲線 接種后，每天進(jìn)行檢測計數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為 縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)，繪制成曲線。 測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞 活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本 參數(shù)之一。 飽和密度：在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能達(dá) 到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群 體停止繁殖。 潛伏期/滯留期 指數(shù)增長期 平臺期/停滯期 退化或死亡 細(xì)胞系的生長過程細(xì)胞系的生長過程 細(xì)胞系：細(xì)胞系：原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即成為原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即成為 細(xì)胞系，可泛指一般可以傳代的細(xì)胞。細(xì)胞系，可泛指一般可以傳代的細(xì)胞。 細(xì)胞株：細(xì)胞株：通過篩選或克隆化，通過篩選或克隆化，從原代細(xì)胞或細(xì)胞 系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞。 細(xì)胞系亞系：細(xì)胞系亞系：由某一細(xì)胞系分離出來，在性狀由某一細(xì)胞系分離出來，在性狀 上與原細(xì)胞系不同的細(xì)胞系，稱該細(xì)胞系的亞系上與原細(xì)胞系不同的細(xì)胞系，稱該細(xì)胞系的亞系 有限細(xì)胞系：如果不能 繼續(xù)傳代或傳代有限， 可稱為有限細(xì)胞系。 連續(xù)細(xì)胞系：能夠連續(xù) 傳代的細(xì)胞叫做“連續(xù)細(xì) 胞系或無限細(xì)胞系?？?培養(yǎng)50代以上并無限培 養(yǎng)下去。 大多數(shù)的二倍體細(xì)胞為 有限細(xì)胞系。無限細(xì)胞 系大多已發(fā)生變異。 原代細(xì)胞：原代細(xì)胞：從機體取得組織材料，在體外培 養(yǎng)生長，到第一次傳代前。 傳代細(xì)胞：當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時 間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后傳代的細(xì)胞。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 方法： 將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放 入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點： 1、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物 的影響。 2、可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色等操作 ，以及永久保存。 3、增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。 培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法 方法：將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng) 板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)培養(yǎng)量較小也稱為 微量培養(yǎng)。 懸滴培養(yǎng)法懸滴培養(yǎng)法也稱植塊懸滴培養(yǎng)法，是最早 建立的體外培養(yǎng)技術(shù) 基本要點：將組織或器官植塊接種在一張蓋 玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使 植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再放置于一凹 形載片之上，最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。 1907 年 -Harrison用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個難題 蓋玻片覆蓋凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法基本步驟 1、在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿和 植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。 2、在凹載片周圍涂凡士林。將凹載片向 下壓向蓋玻片 3、將凹載片反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂溶蠟。 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1910 至 1923年 Carrel 和早期的組織培養(yǎng) 卡氏瓶培養(yǎng)法 1943年Earle、Dulbecco等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng) 法，首建長期傳代的L-細(xì)胞系。 1951年Gey首建人腫瘤細(xì)胞Hela細(xì)胞系。 從50年代末開始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入 了一個繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和 醫(yī)學(xué)研究各個領(lǐng)域。 無血清培養(yǎng) 無血清培養(yǎng)基:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在 體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含 個別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加 組分兩大部分。 觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時需要排除其他 生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子； 又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體 、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以 獲得它們的分泌產(chǎn)物。 往往針對性很強，價格偏高。 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不 同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng), 使細(xì)胞能 夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生 長, 構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。 普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失 了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動物實驗完全在 體內(nèi)進(jìn)行, 但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境 相互影響而變得復(fù)雜化, 難以研究單一過程，且難以研究中 間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動物實驗 之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn) 細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。 應(yīng)用： 軟骨和骨組織（軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞，再生損傷的軟骨、骨） 循環(huán)系統(tǒng)和心臟（有目的地改變血管形成） 目前常用的三維培養(yǎng)模型： 基質(zhì)覆蓋培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng) 微載體培養(yǎng) 預(yù)置支架培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 自發(fā)性細(xì)胞聚集 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的特點及應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的特點及應(yīng)用 優(yōu)點： 1）研究的條件可以人為控制 2）研究的樣本均一 3）研究內(nèi)容方便觀察、檢測、記錄 4）研究的費用相對于經(jīng)濟 缺點：體外培養(yǎng)的細(xì)胞不能完全等同于體 內(nèi)的細(xì)胞。 應(yīng)用應(yīng)用 病毒學(xué)：病毒鑒定，病毒抗原作用，疫苗生產(chǎn) 免疫學(xué)：雜交瘤-單克隆抗體 遺傳學(xué)：染色體分析 腫瘤學(xué)：篩選重要的抗腫瘤藥物 分化及發(fā)育：刺激使細(xì)胞群體發(fā)生改變 細(xì)胞毒實驗：藥效測試 臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù)：干細(xì)胞培養(yǎng)定向誘導(dǎo)分 化后移植；組織工程軟骨損傷修復(fù)；試管嬰兒 營養(yǎng)需要 環(huán) 境 要 求 無毒及無污染 二、培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件二、培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 1 1 、細(xì)胞的營養(yǎng)需求、細(xì)胞的營養(yǎng)需求 （1）氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子 （2）促生長因子等 完全培養(yǎng)基的組成： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95 血清 5一20 碳酸氫鈉 2.0 g/L 青、鏈霉素 各100單位毫升 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇 參考： (1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基 。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時咨詢。 (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種 細(xì)胞。 (3) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲 線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這 是最客觀的方法，但比較繁瑣。 常用的培養(yǎng)基種類 RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、 DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-F12 等 血清 熱滅活：56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清( 目前少用） 熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做 細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實驗，建議血清不要滅活 。 熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清質(zhì)量 。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降 低。 血清中的沉淀物 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成 ，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理 顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯 著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認(rèn)為血 清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細(xì)胞生長，但如 果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清 血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。 常用血清： 胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等， 以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)： 透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體 、病毒污染。 pH pH 調(diào)整液調(diào)整液 NaHCO3 NaHCO3 溶液（堿）溶液（堿） 常用濃度為常用濃度為7.5%7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高 壓滅菌，分裝，壓滅菌，分裝，44保存保存 HEPESHEPES（分子量（分子量238.31238.31）溶液）溶液 一種弱酸，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性 主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。 在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的 環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此 時可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加 HEPES 使用終濃度一般為使用終濃度一般為10-5010-50mmol/L 常配成常配成1M 1M 儲存液：用儲存液：用20ml 20ml 雙蒸水溶解雙蒸水溶解4.764.76克克HEPESHEPES，過濾，過濾 除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，44保存。保存。使用時可向100ml 培養(yǎng)液中加入2ml HEPESHEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L 抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可 能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。 最終使用濃度為每毫升100單位。 制備制備1000ml RPMI 16401000ml RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基 RPMI 1640 干粉培養(yǎng)基10.4g（1包） 超純水 400ml 磁力攪拌至完全溶解 加超純水定容至1000ml 在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有 0.22m 孔徑濾膜的過濾器除菌，分裝200ml/瓶 ，-20保存?zhèn)溆谩?用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的 小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。加青霉素 和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。 消化液消化液 分離組織和分散細(xì)胞 常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA) 單獨或混合使用 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的 肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞 骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過 一定限度會損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用 胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks D-Hanks 平平 衡鹽衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足溶液調(diào)成糊狀，再補足D-Hanks D-Hanks 平衡鹽平衡鹽 溶液（溶液（常用濃度為常用濃度為0.25% 0.25% ）攪拌混勻，置室）攪拌混勻，置室 溫溫 4 4 小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩 次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分 裝入瓶中，裝入瓶中， -20-20保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐Вㄒ悦夥纸馐?），）， 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶 液調(diào)液調(diào) pH pH 至至7.2 7.2 左右左右 胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶溶液配制 EDTAEDTA 4Na 4Na 溶液溶液 一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用， 而且毒性小，價格低廉，使用方便而且毒性小，價格低廉，使用方便 常用工作液濃度為常用工作液濃度為0.02%0.02%。 注意：使用注意：使用EDTA EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液 沖洗干凈，因殘留的沖洗干凈，因殘留的EDTA EDTA 會影響細(xì)胞生長會影響細(xì)胞生長 D-HanksD-Hanks 平衡鹽溶液平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)Solutions, D-HBSS) KClKCl0.40g0.40g KH2PO4KH2PO40.06g0.06g NaClNaCl8.00g8.00g NaCO3NaCO3 0.35g 0.35g Na2HPO4Na2HPO40.048g0.048g D-GlucoseD-Glucose1.00g1.00g Phenol RedPhenol Red0.01g0.01g 2、 環(huán)境要求 細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖的 生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性 （1）溫度 （2）氣相 （3） PH 溫度 體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要在保持一定恒溫的環(huán)境中才 能生長。在達(dá)到最適溫度（37）前，一般細(xì)胞 繁殖率因溫度的升高而增加，但是，溫度逐步升 高并超過最適溫度時，繁殖會被抑制。 當(dāng)溫度在25- 35，細(xì)胞的生長速度很慢，但能夠 生存；細(xì)胞在4也能存活數(shù)天；只要溫度不低于 0，細(xì)胞都能生存；加了保護(hù)劑還能放到液氮中 保存。 當(dāng)高溫時，在41- 42中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重， 43以上，則多數(shù)細(xì)胞死亡。 高溫比低溫對細(xì)胞的影響更為明顯。 氣相和PH 5% CO2 + 95%空氣混合氣體（O2）。 CO2既是細(xì)胞生長所需，同時又是細(xì) 胞代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的PH 有關(guān)。 最適PH 7.2 7.4 低于PH 6.8或高于PH7.6可能對細(xì)胞有 害，甚至死亡。 酚紅指示劑：黃 6.6 橙 8.0 紅 3、無毒無污染 無 毒：無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與 細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須 是無毒的。若具細(xì)胞毒性，細(xì)胞容 易導(dǎo)致死亡。因此，選用器皿和材 料時必須注意。 無污染污染 微生物的污染 不同細(xì)胞類型的交叉污染 細(xì)菌 霉菌 支原體 體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機體免疫系統(tǒng)，無防御能力， 一旦發(fā)生細(xì)菌等污染，細(xì)胞最終會死亡。 交叉污染容易使細(xì)胞系失去原有特性。 三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 1、原代細(xì)胞培養(yǎng) 2、傳代細(xì)胞培養(yǎng) 3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察 4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、運輸 無菌操作中的注意事項無菌操作中的注意事項 在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔 操作前,無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30 分 鐘滅菌，以75% 或70% ethanol 擦拭無菌操作臺 面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘 操作時，小心取用無菌之實驗物品，避免造成污 染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打 開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾 住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用 操作過程中注意，有菌意識，無菌操作！ 1、原代細(xì)胞培養(yǎng) 原理： 將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用 膠原酶）或組織貼壁法處理，得到單個細(xì)胞或細(xì)胞群， 置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖 。 儀器、材料及試劑： CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手 術(shù)器械、計數(shù)板、離心機、水浴箱（37） 1640/DMEM F12培養(yǎng)基（含10%血清）， 2%膠原酶II， PBS，酒精 組織消化法 1.準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺 面，紫外線消毒30分鐘。開始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2.處理組織：采集的標(biāo)本必須在4H內(nèi)完成。 取出6-10cm長臍帶，置于燒杯或平皿中，用 PBS液漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可 能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中 3060分鐘。 3.剪切：用手術(shù)剪將組織塊剪成23立方毫 米大小，然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成1立 方毫米的小塊，以便于消化。加入與組織塊 總量1：1的2%膠原酶II，然后一并倒入瓶中 ，封口。 4.消化：或用恒溫水浴，或置于37溫箱消 化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如 用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組 織塊的大小和組織的硬度而定。 37 空氣搖床100轉(zhuǎn)/min，1.5-2h 5.分離：待組織已分散成細(xì)胞團或單個細(xì) 胞，立即終止消化，并倒入至少5倍體積 的PBS稀釋消化液，隨即通過200目的不銹 鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。 2500rmp離心消化20分鐘，吸出上清，加 入8-10ml PBS，1000rmp離心5min，吸出 上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。 6. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞 密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入 培養(yǎng)瓶中。 7.換液：24-48H后觀察細(xì)胞是否貼壁，如 已有部分細(xì)胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。 2、傳代細(xì)胞培養(yǎng) 傳代前的準(zhǔn)備 1. 酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試管 ，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或板，計 時器，筆 2. 0.25%胰蛋白酶 3. 含血清培養(yǎng)基，PBS 傳代步驟（貼壁細(xì)胞）： 1. 鏡下觀察細(xì)胞生長至融合狀態(tài) 2. 吸出舊的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液或PBS清 洗兩次（切記要清洗干凈）。 3. 消化細(xì)胞：最常用的方法是在培養(yǎng)瓶中添 加1ml 0.25%含EDTA的胰酶，培養(yǎng)箱中37消 化5-15s?？筛鶕?jù)不同的細(xì)胞類型調(diào)整消化時 間及程度。 在電鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞之間 間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形即可。 4. 終止消化：立即加入含有血清的培 養(yǎng)基，用吸管吹打分散細(xì)胞，吹打動 作不可過猛，力度要適中，否則容易 損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。 5. 1000rmp離心5min，棄上清。 6. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì) 胞密度。 3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察 常規(guī)觀察： 培養(yǎng)液顏色（是否變黃） 生長增殖變化（經(jīng)歷到哪個時期，長滿否） 形態(tài)變化（透明度、折光性、細(xì)胞輪廓） 微生物污染（細(xì)菌、霉菌） 可用顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動態(tài) 細(xì)胞生長狀況的觀察 細(xì)胞計數(shù)：細(xì)胞計數(shù)：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定 一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì) 胞的細(xì)胞數(shù)目。 1. 將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板。 2. 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿 蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣 泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 3. 計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方 的。然后按公式計算： 細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù) /4104 說明：公式中除以4，因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： 1.0mm（長）1.0mm（寬）0.1mm（高）=0.1mm3 而 1ml=1000mm3 （注意：鏡下偶見有兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團，應(yīng)按單個細(xì)胞 計算，若細(xì)胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液 細(xì)胞生長曲線（細(xì)胞計數(shù)） 細(xì)胞周期（流式） 細(xì)胞分裂指數(shù)（細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù) ） 細(xì)胞貼壁率 4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及運輸 及時進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要： 細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性 都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境 條件的變化而不斷有新的變化。 細(xì)胞冷凍儲存在-70冰箱中可以保存3個月到 一年之久；細(xì)胞儲存在液氮中，溫度達(dá)-196 ，理論上儲存時間是無限的。 原理： 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融， 可以最大限度的保存細(xì)胞活力。 目前細(xì)胞凍存多采用二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，這兩 種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使 細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從 而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。 復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法。 這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免 由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞 造成損傷。 凍存步驟 1. 配制含10%DMSO或甘油、1020%血清 的凍存培養(yǎng)液； 2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶把單層生 長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直 接將細(xì)胞移至15ml離心管中； 3. 離心1000rpm，5min； 4. 去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制 好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞 均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞