實驗--MS培養(yǎng)基母液和常用試劑的配制.ppt

實驗1 胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 實驗內(nèi)容： 1-1 MS培養(yǎng)基母液和常用試劑的配制 1-2 胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制 1-3 胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo) 1-4 胡蘿卜愈傷組織繼代培養(yǎng)基的配制 1-5 胡蘿卜愈傷組織的繼代培養(yǎng) 實驗1-1 MS培養(yǎng)基母液 和常用試劑的配制 1 實驗?zāi)康?通過本次實驗，使學(xué)生能熟練準(zhǔn)確配制MS 培養(yǎng)基母液和組培室常用的化學(xué)試劑，鞏 固相關(guān)理論基礎(chǔ)知識。 2 實驗原理 培養(yǎng)基是植物離體培養(yǎng)組織和細(xì)胞賴以生 存的營養(yǎng)基質(zhì)。配制培養(yǎng)基時，為了減少 試劑稱取時的工作量和少量稱取時出現(xiàn)的 誤差，以及避免多種營養(yǎng)成分混合導(dǎo)致沉 淀產(chǎn)生或相互反應(yīng)而失去培養(yǎng)效果，預(yù)先 要將各種營養(yǎng)成分配制為一定倍數(shù)的培養(yǎng) 基母液，待使用時稀釋到要求的濃度。母 液的濃度為培養(yǎng)基濃度的10倍、20倍、50 倍、100倍等或更高。 3 主要實驗用具和儀器 冰箱、普通天平、分析天平、各種型號的 試劑瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、 燒杯、容量瓶、搪瓷杯、藥勺、稱量紙、 玻棒、標(biāo)簽紙、pH試紙（pH5.47.0）， 電磁爐等。 4 藥品和試劑 硝酸銨、硝酸鉀、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸 二氫鉀、碘化鉀、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸 鈉、硫酸銅、氯化鈷、乙二胺四乙酸二鈉 、硫酸亞鐵、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆素、煙酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧 乙酸)、NAA（-萘乙酸）、 6-BA （ 6- 芐基腺嘌呤）、 KT、濃鹽酸、氫氧化鈉、 濃硫酸、重鉻酸鉀、95%酒精、蒸餾水等 。 5 MS培養(yǎng)基母液和 常用試劑的配制流程 5.1培養(yǎng)基的成分 目前，不論液體培養(yǎng)還是固體培養(yǎng)，大多 數(shù)植物組織培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基都是由無 機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 和有機附加物等幾大類物質(zhì)組成。 5.2 培養(yǎng)基的配制方法 配制培養(yǎng)基的最簡單的方法是用市售培養(yǎng) 基干粉溶解在蒸餾水里，加上蔗糖、瓊脂 和其他必要的補加物，再加入蒸餾水使之 達(dá)到最終的容積。最后調(diào)節(jié)pH值，高壓滅 菌，于是制成所需要的培養(yǎng)基。 如果沒有培養(yǎng)基干粉，則可采用以下兩種 方法來配制： 一個是按照配方規(guī)定的數(shù)量分別稱量出各 種成分，分別使它們?nèi)芙庥谒?，然后再?它們混合在一起。 另一個是先配制一系列的濃縮貯備液（母 液），貯存在24冰箱內(nèi)，待配培養(yǎng)基 時取出，按比例稀釋配用。此法較為常用 。 5.3 MS 培養(yǎng)基母液的配制 母液的配制有兩種方法： 一種是配制成單一化合物母液。此法適合 配制多種培養(yǎng)基都需要的同一種母液。 另一種是配成幾種不同化合物的混合母液 。此法在大量配制同種培養(yǎng)基時省時省力 。由于MS 培養(yǎng)基較為常用，故配制MS 培 養(yǎng)基母液。 配好的母液應(yīng)放在試劑瓶中貯存。 在配制MS培養(yǎng)基母液時，為減少工作量可 以把幾種藥品（如培養(yǎng)基中的大量元素或 微量元素）配在同一母液中，但應(yīng)注意各 種化合物的組合以及加入的先后順序，以 免發(fā)生沉淀。 通常把每種試劑單獨溶解后再與別的也已 完全溶解的藥品混合，或者待前一種化合 物完全溶解后再加入后一種化合物?；旌?已溶解的各種礦質(zhì)鹽時還應(yīng)注意先后順序 ，力求把Ca2+與SO42- 和PO43-錯開，以免 形成硫酸鈣或磷酸鈣的不溶物。同時，要 慢慢地混合，邊混合邊攪拌。 5.3.1 大量元素母液的配制 MS培養(yǎng)基中的9種大量元素除C、H、O外 ，剩下的六種可由KNO3、NH4NO3、 CaCl2 2H20、MgSO4 7H2O、KH2PO4 幾種無機鹽來供應(yīng)，它們可配在同一母液 中（具體配制見下表）。配制的步驟為： 確定母液的濃度和體積計算各種化合物 用量稱量分別溶解混合定容裝 瓶貼標(biāo)簽放入冰箱保存。 注意： CaCl2 2H2O最后加入 母 液 種 類 成 分 規(guī)定 用量 /mg L-1 濃 縮 倍 數(shù) 稱取量 /mg 母液 定容 體積 /ml 配1L MS培養(yǎng) 基吸取 取量 /ml 大 量 元 素 KNO31900 20 38000 1000 50 NH4NO3165033000 CaCl2 2H204408800 MgSO4 7H2O3707400 KH2PO4 170 3400 5.3.2 微量元素母液的配制 MS培養(yǎng)基中的微量元素可由MnSO4 4H2O、ZnSO4 7H2O、H3BO3、KI、 Na2MoO4 2H2O、CuSO4 5H2O、CoCl2 6H2O幾種無機鹽來供應(yīng)，它們也可配在 同一母液中（具體配制見下表）。配制步 驟同大量元素（混合時不要求先后順序） 。 母 液 種 類 成 分 規(guī)定 用量 /mg L-1 濃 縮 倍 數(shù) 稱取 量/mg 母液 定容 體積 /ml 配1L 培養(yǎng) 基吸 取量 /ml 微 量 元 素 MnSO4 H2O16.9 200 3380 10005 ZnSO4 7H2O8.61720 H3BO36.21240 KI0.83166 Na2MoO4 2H2O0.2550 CuSO4 5H2O0.0255 CoCl2 6H2O 0.0255 5.3.3 有機成分母液的配制 MS培養(yǎng)基中所需的維生素和氨基酸等有機 成分母液應(yīng)分別單獨配制（具體配制見下 表）。配制的步驟為：確定母液的濃度和 體積計算各種化合物用量稱量溶解 定容裝瓶貼標(biāo)簽放入冰箱保存。 亦可配制成混合母液（不主張采用）。 母 液 種 類 成 分 規(guī)定 用量 /mg L-1 濃 縮 倍 數(shù) 稱 取 量 /mg 母液 定容 體積 /ml 配1L MS培 養(yǎng)基 吸取 量/ml 有 機 成 分 甘氨酸2.0 200 100 2505 鹽酸硫胺素0.15 鹽酸吡哆素0.525 煙酸0.525 肌醇1005000 5.3.4 鐵鹽母液的配制 鐵鹽母液宜單獨配制，其配制步驟為： 確定母液的濃度和體積計算各種化合物 用量稱量分別溶解混合煮沸數(shù)分 鐘調(diào)節(jié)pH值至5.8 定容裝瓶（棕色 ）貼標(biāo)簽放入冰箱保存。 用時每配l L培養(yǎng)基取該溶液5ml。 母 液 種 類 成 分 規(guī)定 用量 /mg L-1 濃 縮 倍 數(shù) 稱 取 量 /mg 母液 定容 體積 /ml 配1L MS培 養(yǎng)基 吸取 量 /ml 鐵 鹽 Na2EDTA 2H2O37.3 200 3730 5005 FeSO4 7H2O27.82780 5.3.5 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制 對于植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，配制成母液時， 通常用mgml-1或 ppm 較為方便，一般配 制成0.1-1mgml-1的母液，這樣的濃度便 于計算也可避免冷藏時形成結(jié)晶。 2,4-D/NAA用少量95酒精溶解，再加水定 容；6-BA/KT應(yīng)先溶于少量1 molL-1的HCl 中，再加水定容。 具體配制見下表： 母液 種類類 成 分 稱取量 (mg ) 母液定 容體積積 (ml ) 母液濃濃 度 (mg/ml) 生長長素 2,4-D501000.5 NAA501000.5 細(xì)細(xì)胞分 裂素 6-BA101000.1 KT101000.1 5.3.6 其它常用試劑的配制 鹽酸（lmolL-1 ）：用濃度36.5%、密度 1.19g/cm3的濃鹽酸配制 氫氧化鈉（lmolL-1 ）：用固體氫氧化鈉配 制 75%酒精(v/v) ：用95%的酒精來配制 稀鉻酸洗滌液：重鉻酸鉀50 g溶于1000 ml 蒸餾水中，冷卻后緩慢加入工業(yè)用硫酸90 ml。 配制好的各種母液應(yīng)分別貼上標(biāo)簽，寫明 母液名稱、配制倍數(shù)、配制者、配制日期 。 母液最好在24的冰箱中保存。尤其對 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)與有機類物質(zhì)要求較嚴(yán)。 貯存時間不宜過長，如發(fā)現(xiàn)有