實驗五、氨基酸的分離鑒定--濾紙層析法.ppt

實驗一、氨基酸的分離鑒定,紙層析法,一、實驗目的,通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理及操作技術。,二、實驗原理,紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。利用不同物質在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得到分離。 展層劑由有機溶劑與水組成。在紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相，當有機相沿紙流動經(jīng)過層析斑點時，層析點上的溶質就在有機相和水相之間進行分配。當有機相不斷流動時，溶質就沿著有機相流動方向移動，不斷進行分配，溶質中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率不同，因而彼此分開。,各組分由于移動速度不同，物質被分離后在層析紙上的位置也不同，可用Rf 值來表示： 原點到層析點中心距離 Rf 原點到溶劑前沿的距離 在一定的條件下某物質的Rf值是常數(shù)，可作為定性分析的依據(jù)。 Rf 值大小與樣品物質的結構性質、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質量及展層方式、溫度、樣品溶液中的 雜質等因素有關。,物質結構與性質,物質的極性大小決定了物質在水和有機相之間的分配情況，其極性的大小主要取決于物質所具有的極性基團的性質和數(shù)量，在極性基團不改變情況下，非極性基團成分越多，則分子極性越低等。,同一物質在不同的溶劑系統(tǒng)中，Rf 值不同。在同一溶劑系統(tǒng)中，溶劑各組分比例不同時， Rf 值也有差別。溶劑系統(tǒng)選擇應注意以下原則： 1）通常選用與水部分混溶的有機溶劑或與水相混溶的其他溶劑作為展層劑。 2）溶劑系統(tǒng)應選相對穩(wěn)定二元或多元混合溶劑，各成分之間不起化學反應，揮發(fā)性太大的溶液不宜作溶劑。 3）樣品分離各組分一般Rf 值0.050.85之間，彼此間差值不應小于0.05，樣品與標樣差值0.05基本確認為同一種物質。 4）溶劑的規(guī)格應選用色譜純或分析純，必要時重新蒸餾。,溶劑系統(tǒng),展層方式,上行法 下行法 環(huán)形法 (輻射法）,三、器材,層析缸、毛細管、噴霧器、培養(yǎng)皿、層析濾紙,四、試劑,1、擴展劑：按體積4:1:3的正丁醇：冰醋酸：水混合后倒入分液漏斗中，充分振蕩，靜置后分層排出水相 50 ml /組 2、平衡劑：取漏斗中的擴展劑5ml 于燒杯中作平衡劑。 3、氨基酸：0.5%賴、脯、纈、苯丙、亮氨酸溶液及各組分的混合氨基酸各5ml。 4、顯色劑： 0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 200ml 全班,五、操作,1、取層析濾紙一張，在紙的一端距邊緣2-3cm處用鉛筆畫一條直線，在此線上每間隔2cm作一記號（即原點）如圖。 2、點樣：用鋼筆或毛細管將氨基酸樣品分別點在這6個位置上，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑不超3mm。點樣量應根據(jù)樣品的性質及濾紙的長度來決定，一般點樣量為530ug 。,溶劑前沿 層析點 原點,3、平衡：點樣好的濾紙卷成圓筒狀用線縫好與盛有平衡劑的小燒杯，置于密閉的層析缸中，平衡1-2小時。 4、擴展：將盛有約20ml左右擴展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中，密閉好層析缸。待溶劑上升到1520cm時即取出濾紙，立即用鉛筆描出溶濟前沿，吹風機或烘箱干燥。,圖1-2 濾紙縫合示意圖,5、顯色：用噴霧器均勻噴上0.1% 的茚三酮正丁醇溶液，干燥。 6、計算：用鉛筆描出各層析斑點的輪廓，并計算各氨基酸的Rf 值。,圖譜顯示,化學方法：顯色劑不與濾紙起反應，揮發(fā)性小，易于去除，含水量少。 物理方法 微生物方法 同位素和放射自顯影法,注意事項： 1、要保證層析濾紙不被污染，特別是從點樣線到溶劑前沿的部分。 2、各氨基酸樣品點樣時量要均勻。 3、在縫濾紙時，紙的兩邊不能接觸。 4、點樣的一端朝下，擴展劑的液面需