實(shí)驗(yàn)七聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù).ppt

實(shí)驗(yàn)七 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù),1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?2. 實(shí)驗(yàn)原理 3. 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 4. 實(shí)驗(yàn)步驟 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握PCR反應(yīng)的原理及技術(shù)。,實(shí)驗(yàn)原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）簡(jiǎn)稱PCR技術(shù)，是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。 利用PCR技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異的DNA序列的拷貝。PCR技術(shù)在分子克隆、遺傳病的基因診斷等方面得到廣泛的應(yīng)用。 PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。 PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。,PCR：變性退火延伸,PCR,反應(yīng)分為三步： 1.變性：在高溫條件下，DNA雙鏈解離形成單鏈DNA； 2.退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)引物與其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈； 3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。 以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，幾十個(gè)循環(huán)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)到1067個(gè)拷貝。,PCR技術(shù)的參數(shù)主要有7個(gè)： 聚合酶、引物、dNTPs、反應(yīng)buffer、二價(jià)離子、模板、一價(jià)離子。,實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑,（一）儀器 1. PCR儀 2. 臺(tái)式離心機(jī) 3. 微量取液器,（二）材料 模板DNA,（三）試劑 1. 10x PCR buffer 2. dNTPs 2.5mM 3. Taq 酶 5u/l 4. 引物1和2( 2mol/L) (T3,T7) 5. 模板,實(shí)驗(yàn)步驟,1. 在0.2ml Eppendorf管內(nèi)配制50l反應(yīng)體系 ddH2O： 33.5ul 10x PCR buffer： 5ul dNTPs（2.5mM）： 4ul 引物1 (2uM)： 1ul 引物2 (2uM)： 1ul MgCl2 3ul Taq 酶： 0.5ul 模板： 2ul 共50ul 體系,2. 按下述循環(huán)程序進(jìn)行擴(kuò)增 94 5分鐘，1個(gè)循環(huán)； 94 30秒，52 30秒，72 30秒，30個(gè)循環(huán)； 72 延伸10 分鐘。 4保溫。,3. 擴(kuò)增結(jié)束后取50l擴(kuò)增產(chǎn)物，利用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA擴(kuò)增情況,并切膠用于回收.,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論,PCR