免疫標(biāo)記的應(yīng)用與評價.ppt

免疫標(biāo)記的應(yīng)用與評價,上海交通大學(xué) 瑞金臨床醫(yī)學(xué)院,免疫標(biāo)記的應(yīng)用,干細(xì)胞的確定CD34/CD38/CD90 HPC/PBSC定量分析 1.移植治療的日益普及 2.移植門檻的降低 3.干細(xì)胞采集的確定 4.有效干細(xì)胞的確定要求(CD34、CD90、CD38等),CD34+的分析： 未動員前外周血中CD34+細(xì)胞14%，CD34+/CD38-細(xì)胞1/2500，CD34+/CD38-/CD90+細(xì)胞1/10000。 各家單抗不同、操作不一，結(jié)果難以比較。 內(nèi)毒素、單純化療（骨髓抑制）、細(xì)胞因子、化療聯(lián)合細(xì)胞因子 等的動員。,淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞確定和定量分析 淋巴細(xì)胞分化增殖異常的信號 淋巴細(xì)胞與髓系細(xì)胞的鑒別 混合性白血病和未確定性(型)白血病的診斷 造血干細(xì)胞病變的信號 疾病的預(yù)后判斷,T細(xì)胞標(biāo)記 T細(xì)胞及其亞群 T祖細(xì)胞（pro-T）的表型為CD34+、TdT+、CD10+、CD7+、未成熟T細(xì)胞標(biāo)志CD3、CD4和CD8。在T細(xì)胞發(fā)育過程中，CD7是最早出現(xiàn)的T細(xì)胞標(biāo)志，且貫穿表達(dá)在整個T細(xì)胞分化發(fā)育過程中。胸腺細(xì)胞要分化發(fā)育為有功能的成熟T細(xì)胞，細(xì)胞表面標(biāo)志需經(jīng)歷一定的變化過程。,從CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR-（即CD4、CD8雙陰性）CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+（即CD4、CD8雙陽性），最后發(fā)育成CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+和CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+單陽性的兩群成熟胸腺細(xì)胞，然后進(jìn)入外周淋巴器官和血液，執(zhí)行免疫功能。,但在正常外周血中通常存在CD3+、CD4+、CD8-（TH/TI），CD3+、CD4-、CD8+（TS/TC），CD3+ CD4+ CD8+和CD3+ CD4- CD8-四種表型不同的T細(xì)胞，它們分別占T細(xì)胞總數(shù)的60%70%，20%30%，1%3%，1%10%。前三種表型細(xì)胞的TCR主要為TCR，而CD4- CD8- T細(xì)胞主要表達(dá)TCR，他們都執(zhí)行細(xì)胞免疫功能。,CD2是綿羊紅細(xì)胞受體和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-2（LFA-2），表達(dá)于人95%T細(xì)胞、50%70胸腺細(xì)胞和大顆粒淋巴細(xì)胞（LGLNK）的表面。CD3是T細(xì)胞表面抗原，表達(dá)于成熟胸腺細(xì)胞、靜息和激活的的外周血T細(xì)胞，是鑒定T細(xì)胞的重要標(biāo)志，其胞漿和膜CD3是早期和普通型T細(xì)胞白血病的主要分型標(biāo)記。,CD5、CD7是T細(xì)胞白血病較特異的標(biāo)記，也是髓系白血病時最常見的伴隨標(biāo)記。CD15、CD45則是白細(xì)胞的共同標(biāo)記抗體，在淋巴瘤的診斷中有一定的價值。而CD25和CD28主要分布于活化T淋巴細(xì)胞表面，為活化T淋巴細(xì)胞標(biāo)志。胸腺細(xì)胞、靜止T細(xì)胞、靜止B細(xì)胞以及NK細(xì)胞表面無表達(dá)。主要用于淋巴細(xì)胞疾病的免疫分型。外周血淋巴細(xì)胞CD25+、CD28+占54%86%,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和II類人類白細(xì)胞抗原（HLA-DR）的陽性表達(dá)對早期T細(xì)胞白血病的診斷有重要價值。TCR、的基因重排檢測有利于惡性T細(xì)胞疾病細(xì)胞異?？寺〈嬖诘拇_定。 另外，8090和95以上的NK細(xì)胞表達(dá)CD16和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定義NK細(xì)胞。,B細(xì)胞標(biāo)記,B細(xì)胞 B細(xì)胞的分化主要分為B祖細(xì)胞、前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、活化B細(xì)胞和漿細(xì)胞6個階段。 （1）B祖細(xì)胞（pro-B）：此期最早識別的B細(xì)胞特異性抗原是CD19，同時表達(dá)CD34、細(xì)胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。 （2）前B細(xì)胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出現(xiàn)CyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74，c+（胞漿IgM重鏈）。,（3）未成熟（早期）B細(xì)胞（immature B cell）：CD9、CD10消失，出現(xiàn) SIgM、CD22。CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表達(dá)增加。其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相繼出現(xiàn)。 （4）成熟B細(xì)胞（mature B cell）：SIgM和IgD同時表達(dá)，并出現(xiàn)CR、FcR和絲裂原受體，上述B細(xì)胞抗原繼續(xù)存在。,（5）活化B細(xì)胞（activated B cell）：成熟B細(xì)胞被抗原或絲裂原刺激后，成為活化B細(xì)胞，繼之增生和分化。在此過程伴隨表達(dá)B細(xì)胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相關(guān)抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38等。膜結(jié)合型Ig逐漸減少，分泌型Ig逐漸增加，并可發(fā)現(xiàn)Ig基因重鏈類型轉(zhuǎn)換。 （6）漿細(xì)胞（plasma cell）：激活B細(xì)胞進(jìn)一步分化成為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞，這時獲得PC-1、PCA-1和CD138漿細(xì)胞特異抗原，CD85表達(dá)增加，CD38抗原再出現(xiàn)。而SIg和上述B抗原消失。CD79仍可存在于胞質(zhì)中。,B細(xì)胞上的CD抗原分為：B細(xì)胞限制性（特異性）抗原： CD19、CD20、CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它們的表達(dá)只限于B細(xì)胞上，在鑒別細(xì)胞系上是十分重要的標(biāo)志。B細(xì)胞相關(guān)性抗原： CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。而B細(xì)胞表面的受體SIg，是B細(xì)胞特異性識別抗原的受體，也是B細(xì)胞重要的特征標(biāo)志。,CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B細(xì)胞白血病和淋巴瘤最常用的標(biāo)記抗體。對中國人而言，CDl9是特異性和敏感性最高的。CD19是一種早期的、譜系特異的泛B細(xì)胞表面抗原，從最早期B細(xì)胞前體細(xì)胞階段即表達(dá)，持續(xù)存在直至B細(xì)胞終末階段，分化為漿細(xì)胞時丟失。CD19存在于90外周血、脾臟、淋巴結(jié)或扁桃體中的B細(xì)胞和近5的骨髓細(xì)胞。在造血系統(tǒng)CD19只表達(dá)于正常和惡性B細(xì)胞。外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板表面不表達(dá)CD19。CD24對B細(xì)胞白血病細(xì)胞表達(dá)的敏感性接近CD19，且有較高的特異性。CD20和CD22與CD19和CD24有相同的特異性，但敏感性不夠，CD20的表達(dá)往往伴隨性CD19的陽性而出現(xiàn)。,CD10、TdT都是早期B細(xì)胞的標(biāo)記，其中CD10的表達(dá)可出現(xiàn)在90%的B系統(tǒng)ALL的原始細(xì)胞上。一般來說，這類白血病患者有超過一半，甚至三分之二以上，在免疫表型中出現(xiàn)淋巴細(xì)胞分化的明顯不協(xié)調(diào)，如，CD22陽性與CD10表達(dá)同時出現(xiàn)在ALL白血病細(xì)胞上。而免疫球蛋白重鏈（IgH）的基因重排更是B細(xì)胞異?？寺⌒栽錾臉?biāo)記。異常增生克隆性T細(xì)胞也有15%20%呈現(xiàn)IgH的基因重排。,髓系細(xì)胞標(biāo)記,這類抗體包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。這些免疫標(biāo)記種類繁雜，缺乏特異性和敏感性（與淋巴細(xì)胞標(biāo)記抗體相比）。很多情形下，上述標(biāo)記也出現(xiàn)在正常的髓細(xì)胞表達(dá)上。,3.髓系標(biāo)記 從髓系祖細(xì)胞終末分化的成熟細(xì)胞（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞）間各階段細(xì)胞特征性標(biāo)志還不十分清楚。 根據(jù)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的髓系抗原表達(dá)試將其大致分為七種類型 : （1）粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上都有較強(qiáng)表達(dá)的抗原有：CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。其中CD13在原粒細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)比膜上早，在AML診斷上十分重要。 （2）以粒細(xì)胞為主，但也存在于單核細(xì)胞的抗原有：CD15和CD65。CD65是特異性髓系抗原，強(qiáng)表達(dá)在成熟粒細(xì)胞，弱表達(dá)在單核細(xì)胞上。 （3）基本表達(dá)在粒細(xì)胞上的抗原有：CD16b和CD66。,（4）以單核細(xì)胞為主，但也表達(dá)在粒細(xì)胞的抗原有：CD14和CD33。CD14主要強(qiáng)表達(dá)在單核-巨噬細(xì)胞，弱表達(dá)在粒細(xì)胞上。CD33抗原分布只限于造血系統(tǒng)內(nèi)，表達(dá)在髓系祖細(xì)胞CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相應(yīng)的白血病細(xì)胞上。約80%AML原粒細(xì)胞表達(dá)CD33抗原，而終末分化的粒細(xì)胞CD33抗原弱表達(dá)。CyCD33先于mCD33表達(dá)，故在AML-M0診斷上CyCD33加CyCD13十分有用。 （5）基本只表達(dá)在單核細(xì)胞上的抗原有：CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目前發(fā)現(xiàn)可靠的檢測造血系統(tǒng)內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的特異標(biāo)志，用CD68單抗可將AML-M1M3與AML-M4及AML-M5區(qū)別開來。,（6）造血干、祖細(xì)胞抗原有：CD34和CD90。CD34和CD90雖列在髓系抗原中，但都屬于造血干、祖細(xì)胞抗原 。CD34除表達(dá)在早期造血干、祖細(xì)胞外，還表達(dá)在約40%的AML和60%的ALL上，這些CD34+的白血病細(xì)胞可能來自具有多系性分化能力的分化不良的前身細(xì)胞。 （7）其他髓系相關(guān)抗原：這些抗原主要存在于其他系細(xì)胞上，但在某些髓系細(xì)胞上也有表達(dá)，如：CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。,巨核細(xì)胞系 在巨核細(xì)胞系發(fā)育過程中依次出現(xiàn)PPO、CD41a（b/a）、CD41b（b）和CD61（a）、CD42（b）。還可表達(dá)CD36（強(qiáng)）。血小板具有豐富的胞內(nèi)顆粒，正常情況下血小板處于靜止?fàn)顟B(tài)。目前研制出的抗血小板單抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、 CD42b、CD61，主要都針對靜止的血小板。當(dāng)血小板被激活時，血小板中顆粒內(nèi)容物釋放，整合到活化的血小板質(zhì)膜內(nèi)，成為一些激活抗原，如CD62 （P-選擇素）、CD63及CD107a和CD107b。 紅細(xì)胞系 血小板GPb （CD36強(qiáng)）、血型糖蛋白A、H。,4.干祖細(xì)胞系 CD34抗原選擇性地表達(dá)在不成熟的造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞上，是一個階段特異而非系特異的抗原。多能造血干細(xì)胞（CFU-GEMM）和定向造血干細(xì)胞（CFU-GM，CFU-Meg、BFU-E、BFU-Eo、CFU-Bas）、T祖細(xì)胞（pro-T）、B祖細(xì)胞（pro-B）都在CD34+群內(nèi)。CD34+抗原在早期造血祖細(xì)胞內(nèi)呈高水平表達(dá)，隨著細(xì)胞成熟其表達(dá)呈進(jìn)化性下降，繼而消失。目前CD34已作為能識別人類最早造血干、祖細(xì)胞的重要標(biāo)志。現(xiàn)知更早期的干細(xì)胞為CD34-。,CD34+、CD38-細(xì)胞在形態(tài)上缺乏分化特點(diǎn)，是更幼稚、能維持長期造血的啟動細(xì)胞（LTC-IC）。LTC-IC細(xì)胞以CD34+、CD45RO+、HLA-DR-為主，多處于G0和G1期。CD34+、CD38+細(xì)胞則大多處于造血祖細(xì)胞階段，可形成各系造血集落，但不能維持長期造血。故CD38抗原是造血干細(xì)胞向多系定向分化的標(biāo)志之一，并隨一定的分化過程表達(dá)上調(diào)。鑒于CD34抗原可以識別出造血干、祖細(xì)胞，結(jié)合其它相關(guān)分化抗原的表達(dá)可以作為造血細(xì)胞不同發(fā)育階段的標(biāo)志。如CD34+、CD33+細(xì)胞群為多能干細(xì)胞向髓系定向的標(biāo)志。CD34+、CD19+多為多能干細(xì)胞向B系定向的祖細(xì)胞。而CD34+、TdT+、CD10+、CD7+則被認(rèn)為是向T系定向的祖細(xì)胞。,最近發(fā)現(xiàn)CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖細(xì)胞標(biāo)志，故現(xiàn)人們多把CD34-、CD90+，Lin-細(xì)胞視為造血干細(xì)胞的重要標(biāo)志。,CD15則在分化較好的AML中表達(dá)；血型糖蛋白A表達(dá)在除紅系祖細(xì)胞外的紅系細(xì)胞上，占FAB M6患者的40%左右，CD71可彌補(bǔ)血型糖蛋白A的不足，在爆式紅系細(xì)胞集落形成單位（BFU-E）和紅系細(xì)胞集落形成單位（CFU-E）階段的祖細(xì)胞亦可表達(dá)陽性；CD41、CD42和CD61是常用的原始巨核細(xì)胞標(biāo)記，但CD61往往隨CD41、CD42的陽性而表達(dá)。另外，CD56作為神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（NCAM）通常在NK細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá)。在13%41%的AML中，CD15表達(dá)陽性；在分化的單核細(xì)胞和t（8;21）、+8等核型改變時，也呈陽性表達(dá)。,MPO、HLA-DR、TdT和溶菌酶抗體在髓系細(xì)胞上也應(yīng)用極廣。其中，除原始單核細(xì)胞白血病、巨核細(xì)胞白血病和紅系白血病外，其他髓系白血病細(xì)胞都有可能陽性；HLA-DR除早幼粒細(xì)胞白血病外，其他髓系白血病均可呈陽性；TdT僅表達(dá)在極微分化的早期髓系細(xì)胞上；溶菌酶可部分彌補(bǔ)CD14、CD36對原始單核細(xì)胞的不敏感。,特殊檢驗(yàn)的應(yīng)用,慢淋問題(活化的淋巴細(xì)胞標(biāo)記) 惡組問題(附帶的T/B細(xì)胞標(biāo)記) 慢性白血病的標(biāo)記要慎重,Acute myeloid leukaemia,Acute myeloid leukaemia with recurrent genetic abnormalities Acute myeloid leukaemia with multilineage dysplasia Acute myeloid leukaemia and myelodysplastic syndrome, therapy-related Acute myeloid leukaemia not otherwise categorized,Acute myeloid leukaemia,Acute myeloid leukaemia,Acute myeloid leukaemia,The blast % is lowered from 30% (FAB) to 20% (WHO) Median age of onset = 60 yrs Incidence 4 10 / 100,000 Etiology,Myeloblasts versus lymphoblasts,Acute myeloid leukaemia,Acute lymphoblastic leukaemia,Acute myeloid leukaemia: cytochemistry,Myeloperoxidase Sudan Black B Non-specific esterase a-naphthyl butyrate a-naphthyl acetate,Cytochemistry: MPO,Cytochemistry: NSE,Cytochemistry,Acute myeloid leukaemia: role of immunophenotyping,Distinction of minimally differentiated AML from acute lymphoblastic leukaemia Recognition of AML-M7 Recognition of specific AML sub-categories (e.g CD56+ve AML) Diagnosis of biphenotypic leukaemia However, immunophenotyping is not mandatory in typical cases of AML, unlike in ALL where a phenotypic diagnosis is needed in every case,Acute myeloid leukaemia: role of immunophenotyping,Panel of monoclonal antibodies in classification of acute leukaemia,Haemopoietic precursors: CD34, HLA-DR, Tdt, CD45 B-lineage: CD19, CD20, CD22, CD79a T-lineage: CD2, CD3, CD5, CD7 Myeloid: CD13, CD33, CD117, anti-MPO Megakaryocytic: CD41, CD61,Acute myeloid leukaemia with recurrent genetic abnormalities,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO Acute myeloid leukaemia with abnormal bone marrow eosinophils and inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11 Acute promyelocytic leukaemia (AML with t(15;17)(q22;q12); PML/RARa and variants Acute myeloid leukaemia with 11q23 (MLL) abnormalities,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,t(8;21) is the commonest translocation in AML Associated with AML-M2 morphology Tumour masses (granulocytic sarcoma),Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Morphology Large blasts, heavily granulated Frequent Auer rods Variable dysplasia in granulocytic series Rare cases with blast count 20% Immunophenotype CD13+ CD33+ anti-MPO+ CD19+ CD34+ CD56,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Detection of fusion genes by FISH,Detection of fusion genes by FISH,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Prognosis Good response to chemotherapy and high complete response rate Long term disease free survival Adverse factors additional chromosomal changes e.g. 9q- CD56 +ve,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11,Granuolocytic and monocytic features AML-M4 (acute myelomonocytic leukaemia) morphology Abnormal eosinophils with coarse basophilic granules,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11,Cytochemistry Abnormal eosinophils are CAE +ve Immunophenotype Granulocytic and monocytic markers Co-expression of CD2 in blast population Prognosis Favourable,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11,Acute promyelocytic leukaemia,AML with t(15;17)(q22;q12); PML/RARa and variants Characteristic morphology Associated with disseminated intravascular coagulation,Acute promyelocytic leukaemia,Acute promyelocytic leukaemia,Acute promyelocytic leukaemia,Immunophenotype CD33+ CD13+ HLA-DR and CD34 negative Co-expression of CD2 and CD9 Genetics t(15;17)(q22;q12) Variants: t(11;17)(q23;q12) PLZF/RARa; t(5;17)(q32;q12) NPM/RARa; t(11;17)(q13;q12) NuMA/RARa,Acute promyelocytic leukaemia,Acute promyelocytic leukaemia,Treatment All-trans retinoic acid (ATRA) Arsenic for relapse cases RARa variants: resistant to ATRA Prognosis Favourable when treated optimally with ATRA followed by anthracyclines,Acute myeloid leukaemia with 11q23 abnormalities,Infant leukaemia Therapy related AML after exposure to DNA topoisomerase II inhibitors Acu