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第四章 酶 工 程 制 藥,國際酶工程學(xué)會(huì)（1971年）定義： 酶工程是研究和開發(fā)酶的生產(chǎn)、酶的分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應(yīng)器、酶與固定化酶的應(yīng)用等的工程科學(xué)。,酶工程制藥主要包括藥用酶的生產(chǎn)和酶法制藥兩方面的技術(shù)。,藥用酶是指可用于預(yù)防和治療疾病的酶。,酶法制藥是指利用酶的催化作用而制造出具有藥用功效的物質(zhì)的技術(shù)過程.,藥用酶：,酶法制藥：,第一節(jié) 概述,酶是生物催化劑。是由活細(xì)胞產(chǎn)生的以蛋白質(zhì)為主要成分的生物催化劑，它能催化各種生物化學(xué)反應(yīng)。,一、酶的催化特性,催化劑的共同點(diǎn) 量少高效； 只加速可逆反應(yīng)的進(jìn)程，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。 都是通過降低反應(yīng)分子的活化能來加快化學(xué)反應(yīng)的速度。 酶的特性 高效催化 高度專一 條件溫和,1、酶的專一性強(qiáng),酶的專一性（specificity)：是指一種酶只能催化一種或一類結(jié)構(gòu)相似的底物進(jìn)行某種類型的反應(yīng)。,絕對專一性(absolute specificity)：只能作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進(jìn)行一種專一的反應(yīng)，生成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物 。 立體結(jié)構(gòu)特異性(stereo specificity)：作用于立體異構(gòu)體中的一種。 相對專一性(relative specificity)：作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵。,根據(jù)酶對其底物結(jié)構(gòu)選擇的嚴(yán)格程度不同，酶的專一性可大致分為以下2種類型：,酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高 1081020倍，比一般催化劑高1071013倍。 酶和一般催化劑加速反應(yīng)的機(jī)理都是降低反應(yīng)的活化能(activation energy)。酶比一般催化劑更有效地降低反應(yīng)的活化能。,3、酶的作用條件溫和,酶的催化不需要較高的反應(yīng)溫度。 酶的催化作用一般都在常溫、常壓、pH近乎中性的溫和條件下進(jìn)行，不需高溫高壓和極端pH條件。,二、影響酶催化作用的主要因素,1、酶濃度對酶促反應(yīng)的影響,在有足夠底物和其他條件不變的情況下： v = k E,酶促反應(yīng)的速度與酶濃度成正比,2、底物濃度對酶促反應(yīng)的影響,一級反應(yīng) v = k S,零級反應(yīng) v = k E,混合級反應(yīng),當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。,隨著底物濃度的增高,反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。,當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度,反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng),3、pH對酶促反應(yīng)的影響,1.最適pH,2.有效pH,表現(xiàn)出酶最大活力的pH值,在一定的pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定的,pH對酶作用的影響機(jī)制： 1.環(huán)境過酸、過堿使酶變性失活； 2.影響酶活性基團(tuán)的解離； 3.影響底物的解離。,雙重影響 溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低 。,4、溫度對酶促反應(yīng)的影響,最適溫度 (optimum temperature)： 酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。其不是酶的特征性常數(shù),5、激活劑對酶促反應(yīng)的影響,激活劑 使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)。其中大部分是一些無機(jī)離子和小分子簡單有機(jī)物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等； 無機(jī)離子對酶的激活作用： （1）與酶分子肽鏈上的側(cè)鏈基團(tuán)相結(jié)合，穩(wěn)定酶催化作用所需的構(gòu)象。 （2）作為底物與酶蛋白之間聯(lián)系的橋梁。 （3）可能作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分，協(xié)助酶的催化作用。,使用激活劑注意,激活劑對酶的作用具有一定的選擇性，使用不當(dāng)，會(huì)適得其反，激活劑之間有時(shí)存在拮抗現(xiàn)象。 激活劑的濃度有一定的范圍，超出此范圍，會(huì)得到相反的效果。,6、抑制劑對酶促反應(yīng)的影響,使酶的必需基團(tuán)或活性部位中的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶失活的物質(zhì)，稱為抑制劑（I）。,（1）. 不可逆抑制作用：抑制劑與酶的結(jié)合（共價(jià)鍵）是不可逆的。,+ I EI,ESH +ICH2COOH ESCH2COOH + HI,抑制作用特點(diǎn)：不可逆性抑制，抑制劑濃度越高，抑制作用時(shí)間越長，抑制作用越強(qiáng)。,（2）可逆抑制作用：抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。,抑制程度是由酶與抑制劑之間的親和力大小、抑制劑的濃度以及底物的濃度決定。,E,v,1,2,3,1. 反應(yīng)體系中不加I。,2.反應(yīng)體系中加入一定量的不可逆抑制劑。,3.反應(yīng)體系中加入一定量的可逆抑制劑。,I ,I ,競爭性抑制作用：抑制劑和底物競爭與酶結(jié)合。,特點(diǎn)： 1）抑制劑和底物競爭酶的結(jié)合部位。 2）抑制程度取決于I和S的濃度以及與酶結(jié)合的 親和力大小。 3）競爭性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)十分相似。,+ I EI,非競爭性抑制作用：底物和抑制劑同時(shí)與酶結(jié)合，但形成的EIS不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。,特點(diǎn)： 1）隨著抑制劑濃度I的增加，抑制作用增強(qiáng)。 2）底物濃度的增減對抑制作用不產(chǎn)生影響。 3）抑制劑不改變酶對底物的親和力。,反競爭性抑制作用：I與酶和底物的中間復(fù)合物結(jié)合而不與游離酶結(jié)合，從而抑制酶活性。,特點(diǎn)： 1）隨著抑制劑濃度I的增加，抑制作用增強(qiáng)。 2）底物濃度的增減對抑制作用不產(chǎn)生影響。 3）抑制不改變酶對底物的親和力。,三、酶的分類與命名,（一）、酶的命名,1、習(xí)慣名：命名原則如下 （ 1.）根據(jù)酶的底物命名。 （2.）根據(jù)所催化的反應(yīng)的性質(zhì)命名。 （3.）有的酶結(jié)合上述兩個(gè)原則命名。 （4.）在這些基礎(chǔ)上有時(shí)還加上酶的來源或酶的其它特點(diǎn)。,2、系統(tǒng)名：要求能確切表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的性質(zhì)，包括兩部分，即底物名稱及反應(yīng)類型，底物間用“：”分開，若底物之一是水則可略去不寫。,ATP+CH3COOH ADP+CH3C,O,P,其系統(tǒng)名為：ATP：乙酸磷酸轉(zhuǎn)移酶,（二）、酶的分類,根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)分為六大類 1、氧化還原酶類：催化氧化還原反應(yīng)，涉及H 和電子的轉(zhuǎn)移。如脫氫酶類。 2、轉(zhuǎn)移酶類：催化分子間功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。如轉(zhuǎn)氨酶類。,3水解酶類：催化水解反應(yīng)。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。 4裂合酶類：催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)的酶。如醛縮酶脫氨酶 脫羧酶,5異構(gòu)酶類：催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變。 6、合成酶：與ATP 分解相偶聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)。如天冬酰胺合成酶 丙酮酸羧化酶,在每一大類酶中，又根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)分為若干亞類，然后再把屬于某一亞類、亞亞類的酶按順序排好，這樣把已知的酶分門別類地排成一個(gè)表，叫做酶表。 類 亞類 亞亞類 序號(hào),如 EC1.1.1.27 為乳酸：NAD+氧化還原酶 EC1.1.1.37 為蘋果酸：NAD +氧化還原酶 EC1.1.1.1 為乙醇：NAD +氧化還原酶,一些酶的命名舉例,四、酶活力及其測定,酶的定量并非對其蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，而是對它的催化能力進(jìn)行定量。,所以，酶的定量就是測定酶的活力，也即測定酶促反應(yīng)的速度。,1. 酶活力及測定,酶活力 是酶促反應(yīng)的能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化的某一化學(xué)反應(yīng)速度的快慢，即酶催化的反應(yīng)速度越快，酶活力越高，反之則表示該酶活力低。,酶活力測定,酶活力測定包括兩個(gè)階段。首先要在一定條件下，將酶與其作用底物混合均勻，反應(yīng)一段時(shí)間，然后再測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物變化的量。,步驟：,（1）根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配置成一定濃度的底物溶液。,（2）根據(jù)資料或試驗(yàn)結(jié)果，確定酶催化反應(yīng)的溫度、pH值等條件。,（3）在一定的條件下，將一定量的酶液與一定量的底物溶液混合均勻，記錄開始的時(shí)間。,（4）反應(yīng)到一定的時(shí)間，取出適量的反應(yīng)液運(yùn)用各種適合的生化檢測技術(shù)，測定產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。, 反應(yīng)時(shí)間一到，立即取出一定量的反應(yīng)液，置于沸水浴中，加熱使酶失活。 立即加入適宜的酶變性劑，如三氯醋酸等，使酶變性失活。 立即加入酸或堿溶液，使反應(yīng)液的pH值迅速遠(yuǎn)離酶促反應(yīng)的最適pH值，從而終止反應(yīng)。 將取出的反應(yīng)液立即置于冰粒堆或冰鹽溶液中，使反應(yīng)液的溫度迅速降低到10以下。,常用的終止酶反應(yīng)的方法：,2. 酶活力單位,酶活力單位(1961年)：在特定條件下，每分鐘催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位，用U表示。 特定條件是指：溫度可采用25或其他選用的溫度，其它條件均采用最適條件。,3. 酶的比活力,指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù),比活力是酶制劑純度的常用指標(biāo) 比活力越大，表示酶越純。,第二節(jié) 藥 用 酶 的 生 產(chǎn),一、藥用酶的種類,1、 蛋白酶:,蛋白酶目前可用作：,(1)消化劑,(2)消炎劑,(3)治療高血壓, -淀粉酶水解淀粉生成糊精，是國際上廣泛使用的消化藥。最早采用米曲霉生產(chǎn)的復(fù)合 -淀粉酶，其中還含有蛋白酶、脂肪酶等多種酶。但由于米曲霉 -淀粉酶的適宜pH值為4.56.0所以在胃中易受胃酸破壞。用黑曲霉酸性淀粉酶作為消化藥，不易受胃酸破壞，效果會(huì)更好。,2 、-淀粉酶,脂肪酶催化脂肪水解生成甘油和脂肪酸，可 作為消化劑使用。 假單胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂白和乳糜微粒，可用于預(yù)防和治療高血脂病。,3、 脂肪酶,該酶水解右旋糖酐生成小分子產(chǎn)物，對齲齒有 顯著的預(yù)防效果 。 齲齒是一種常見的口腔疾病，其病因是由于口腔中的細(xì)菌將蔗糖合成結(jié)構(gòu)類似右旋糖酐的粘性多糖，粘附在牙齒表面，引起細(xì)菌滋生，而使牙齒受到損壞。將右旋糖酐酶應(yīng)用到牙膏，可有效防治齲齒的產(chǎn)生。,4 、右旋糖酐酶,溶菌酶具有抗菌，消炎，鎮(zhèn)痛等療效， 是一種廣泛應(yīng)用的藥用酶 。 溶菌酶作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，使其受到 破壞，而使病原菌、腐敗性細(xì)菌等溶解死亡。 溶菌酶與抗生素聯(lián)合使用，可顯著提高 抗生素的療效.,5、 溶菌酶,SOD催化超氧負(fù)離子（O-2）進(jìn)行氧化還 原反應(yīng)生成氧和雙氧水。（2 O-2+2H+H2O2+O2） 由于SOD能清除體內(nèi)的超氧負(fù)離子，具有抗氧化、抗輻射、抗衰老的功效，保護(hù)機(jī)體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等免遭超氧負(fù)離子的破壞，對紅斑狼瘡、皮膚炎、結(jié)腸炎、白內(nèi)障、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氧中毒等疾病有顯著療效，對輻射有防護(hù)作用。,6、 超氧化物歧化酶(SOD),Asn Asp+NH3 抗癌藥物 癌細(xì)胞不含天冬酰胺合成酶,本身不能 合成L-天冬酰胺，而外源的L-Asn又被加入 的L-天冬酰胺酶分解掉，因此，蛋白質(zhì)的合 成受阻，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。,7、L-天冬酰胺酶,鏈激酶：-溶血性鏈球菌產(chǎn)生的一種蛋白酶，可 催纖維蛋白酶原，激活成纖維蛋白酶而 將纖維蛋白水解使血栓溶解。 尿激酶：從尿液中分離得到的一種蛋白酶，具有溶 解血栓的療效，其副作用比鏈激酶小。 納豆激酶：由納豆桿菌或枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種 蛋白酶，具有溶解血栓的功效，可以口服。,8、溶栓酶,9、乳糖酶,乳糖酶又稱-半乳糖苷酶，它催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖。 乳糖酶可用于治療乳糖酶缺乏癥。,運(yùn)用各種生化分離技術(shù)，從動(dòng)物、植物及微生物等的含酶細(xì)胞、組織或器官中提取、分離和純化各種藥用酶的方法稱為提取法。,二、 藥用酶的生產(chǎn)方法,1、 提取法：,利用各種動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得人們所需的酶的方法稱為生物合成法。 主要是利用微生物細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。,2 、生物合成法：,化學(xué)合成法是60年代中期出現(xiàn)的新技術(shù)。 1965年，我國人工合成胰島素的成功，開辟 了蛋白質(zhì)化學(xué)合成的新紀(jì)元。,3 、化學(xué)合成法:,1969年，美國首次用化學(xué)合成法得到 含有124個(gè)氨基酸的核糖核酸酶。,化學(xué)合成法合成的成本高昂，且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶, 至今停留在實(shí)驗(yàn)室階段。,通過篩選、誘變或采用基因工程、 細(xì)胞工程等技術(shù)而獲得。,三 、藥用酶生產(chǎn)細(xì)胞的選擇,用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞必須具備的條件：,1、 酶的產(chǎn)量高,2、 容易培養(yǎng)和管理 適應(yīng)性較強(qiáng)，易于生長繁殖，便于管理。 3、 產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 不易退化，能穩(wěn)定地用于生產(chǎn)。 4 利于酶的分離純化 胞外酶,5 、安全可靠,常用的產(chǎn)酶微生物有：,枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,大腸桿菌（Escherichia coli）,黑曲霉（Aspergillus niger）,米曲霉（Aspergillus orizae）,木霉（Trichoderma）,青霉（penicillium）,根霉（Rhizopus）,毛霉（Mucor）,鏈霉菌（Streptomyces）,啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,假絲酵母（Candida）,對于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物，可使產(chǎn)酶量顯著提高 。,四、 提高藥用酶產(chǎn)量的措施,1 、添加誘導(dǎo)物：,不同的酶有各自不同的誘導(dǎo)物。然而有時(shí)一種誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)生成同一酶系的若干種酶，如-半乳糖苷可同時(shí)誘導(dǎo)-半乳糖苷酶、透過酶和-半乳糖乙?；?種酶(協(xié)同誘導(dǎo))。 同一種酶往往有多種誘導(dǎo)物，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可根據(jù)酶的特性、誘導(dǎo)效果和誘導(dǎo)物的來源等方面進(jìn)行選擇。,（1）酶作用的底物：乳糖誘導(dǎo)-半乳糖苷酶 青霉素誘導(dǎo)青霉素酶 （2）酶的反應(yīng)產(chǎn)物：半乳糖醛酸誘導(dǎo)果膠酶 纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶 沒食子酸誘導(dǎo)單寧酶,誘導(dǎo)物的種類：,酶的最有效的誘導(dǎo)物。 如：IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）對-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍；蔗糖甘油單棕櫚酸酯對蔗糖酶的誘導(dǎo)效果比蔗糖高幾十倍等。,（3）酶的底物類似物:,分解代謝物阻遏 阻遏作用 產(chǎn)物反饋?zhàn)瓒?末端產(chǎn)物 阻遏物 酶催化反應(yīng)產(chǎn)物 分解代謝物 控制阻遏濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施。,2 、控制阻遏物濃度,末端產(chǎn)物阻遏：可通過控制末端產(chǎn)物的濃度使阻遏解除。,酶催化反應(yīng)產(chǎn)物阻遏：可通過控制酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的濃度使阻遏解除。,解除：,分解代謝物阻遏，可通過下列方法解除： 控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度補(bǔ)料分次流加碳源 添加一定量的CAMP。,陽離子型 離子型 陰離子型 表面活性劑 兩性離子型 非離子型,3、 添加表面活性劑,由于離子型表面活性劑有些對細(xì)胞有毒害作用，不能用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)。,非離子型表面活性劑，如Tween、Triton等，可積聚在細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞的通透性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的產(chǎn)量。 此外，添加表面活性劑有利于提高某些酶的穩(wěn)定性和催化能力。,產(chǎn)酶促進(jìn)劑：是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理 并未闡明清楚的物質(zhì)。 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑往往對提高酶產(chǎn)量有顯著效果。,4、 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑,五、 藥用酶的分子修飾,1、 酶分子修飾：,通過各種方法使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生 某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程稱為酶分子修飾。,提高酶活力，增加酶的穩(wěn)定性，消除或降低酶的抗原性。,2、 酶分子修飾的目的：,通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法稱為金屬離子置換修飾，簡稱為離子置換法。,3、酶分子修飾技術(shù)(方法),(1)金屬離子置換修飾：,金屬離子置換修飾法只適用于本來在結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的酶。,用于酶修飾的金屬離子，往往是二價(jià)金屬離子，如：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。,酶液+EDTA等金屬螯合劑EDTA-金屬螯劑用透析、超濾、分子篩等方法除去失活酶液+其他金屬離子酶活力升高，穩(wěn)定性增強(qiáng)。,金屬離子置換修飾過程：,例：,鋅型蛋白酶鈣型蛋白酶，酶活力提高2030%； -淀粉酶的鎂型、鋅型鈣型，穩(wěn)定性增強(qiáng)，酶活力提高3倍以上。,利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾法。,(2)大分子結(jié)合修飾:,右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等，這些大分子在使用前一般需經(jīng)過活化，然后在一定條件下與酶分子以共價(jià)鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。,大分子修飾劑：,大分子結(jié)合修飾的作用：,水溶性大分子通過共價(jià)鍵與酶分子結(jié)合后， 可使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，使酶的活性 中心更有利于和底物結(jié)合，并形成準(zhǔn)確的催化 部位，從而使酶活力得以提高。 . 例：每分子胰蛋白酶用11分子的右旋糖酐修飾后， 酶活力可提高30%等。,、通過修飾提高酶活力：,酶的穩(wěn)定性用半衰期來表示。 酶的半衰期：是指酶的活力降低到原來一半時(shí)所 經(jīng)過的時(shí)間。,、通過修飾增加酶的穩(wěn)定性：,用可溶性大分子與酶結(jié)合進(jìn)行酶分子修飾，可在酶的外圍形成保護(hù)層，使酶的空間構(gòu)象免受其他因素的影響，從而增加酶的穩(wěn)定性，延長其半衰期。,、通過修飾降低或消除抗原性,抗體與抗原之間的特異結(jié)合是由于它們之間特定的分子結(jié)構(gòu)所引起的。采用酶分子修飾方法使酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生某些改變，就有可能降低甚至消除其抗原性。 例：聚乙二醇結(jié)合修飾后的L-天冬酰胺酶， 其抗原性可完全消除。,要想獲得理想的修飾效果，必須確定最佳修飾劑的種類和濃度、溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間。,（3）肽鏈有限水解修飾,酶蛋白的肽鏈被水解后，可能會(huì)出現(xiàn)以下3種情況中的一種：,酶活性中心被破壞，失去催化功能； 肽鏈的一部分水解后，仍可維持活性中心的完整構(gòu)象，則酶的活力仍可保持或損失不多； 肽鏈的一部分水解除去以后，有利于活性中心與底物的結(jié)合，酶活力提高。,在后兩種情況下，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱為肽鏈有限水解 。,利用肽鏈的有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性和功能的方法，稱為肽鏈有限水解修飾。,肽鏈有限水解修飾：,有些酶原來不顯示酶活力或酶活不高，利用某些具有高度專一性的蛋白酶對它進(jìn)行肽鏈有限水解修飾，除去一部分肽段或若干個(gè)氨基酸殘基，就可使其空間構(gòu)象發(fā)生改變，有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，從而顯示出酶的催化活性或提高其酶活力。,肽鏈有限水解修飾作用：,、顯示或提高酶活力,有些酶原來具有抗原性，這除了酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 以外，還由于酶是大分子。 蛋白質(zhì)的抗原性與其分子大小有關(guān)，大分子的外源蛋白質(zhì)往往出現(xiàn)較強(qiáng)的抗原性，而小分子的肽鏈或蛋白質(zhì)，其抗原性較低或者無抗原性。所以，若將酶分子經(jīng)肽鏈有限水解，其分子量減小，就會(huì)在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性降低，甚至消失。,、降低抗原性：,酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)就是指組成蛋白質(zhì)的氨基 酸殘基上的功能團(tuán)。 通過改變酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)而使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而引起酶的特性和功能改變的方法稱為酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾。,(4)酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾：,氨基修飾劑：能使酶蛋白側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物。 主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、亞硝酸等。 羧基修飾劑：可與酶蛋白側(cè)鏈上的羧基反應(yīng)的小分子化合物。 主要有：乙醇-鹽酸試劑、水溶性的碳化二亞胺等 胍基修飾劑：可與酶蛋白側(cè)鏈上的胍基縮合生成穩(wěn)定雜環(huán)的 化合物。 一般是二羰基化合物。主要有：環(huán)己 二酮、乙二醛、苯乙二醛等。,常用的小分子側(cè)鏈基團(tuán)的修飾劑：,蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基側(cè)鏈中含有巰基。巰基在許多酶中充當(dāng)活性中心的催化基團(tuán)，巰基可與另一巰基形成二硫鍵，對維持酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用。 常用的有二硫蘇糖醇、疏基醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉等還原劑以及各種酰化劑、烷基化劑等。,巰基修飾劑：,蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上含有酚基。 酚基修飾法有：碘化法、硝化法和琥珀?；ǖ?。 經(jīng)酚基修飾劑修飾后，酚分子由于引入負(fù)電荷，因而增加了對帶正電荷的底物的結(jié)合力，有利于酶催化功能的發(fā)揮。,酚基修飾劑：,分子內(nèi)交聯(lián)劑：,用含有雙功能團(tuán)的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等與酶分子內(nèi)兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，在分子內(nèi)共價(jià)交聯(lián)，可使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定，從而也使酶的催化穩(wěn)定性增加。,（5）氨基酸置換修飾,通過氨基酸置換修飾，可以提高酶活力或增加酶的穩(wěn)定性，更有利于酶的應(yīng)用。,將肽鏈上的某一氨基酸進(jìn)行置換而引起酶蛋白空間構(gòu)象的某些改變，從而改變酶的某些特性和功能，這種修飾方法，稱為氨基酸置換修飾。,通過各種物理方法，使酶分子的空間 構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的某些特性和 功能的方法稱為物理修飾。,（6）物理修飾：,特點(diǎn)：不改變酶的組分和基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理方法的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。,第三節(jié) 藥 物 的 酶 法 生 產(chǎn),用在半合成抗生素生產(chǎn)上。催化青霉素或頭孢霉素水解生成6氨基青霉烷酸（6APA）或7氨基頭孢霉酸（7ACA）。又可催化?；磻?yīng)，由6APA合成新型青霉素或由7ACA合成新型頭孢霉素。,一、藥物的酶法生產(chǎn)中所用酶的種類,1、青霉素酰化酶：催化側(cè)鏈的水解和合成,化學(xué)反應(yīng)式,不同來源的青霉素?；笇囟群蚿H值的要求不同。同一來源的青霉素?；冈诖呋夥磻?yīng)和催化合成反應(yīng)時(shí)所要求的條件各不相同，尤其是pH條件相差較大，操作時(shí)要控制好。一般說來，催化水解反應(yīng)時(shí)，pH值為7.0 8.0,而催化合成反應(yīng)時(shí), pH值降低到5.0 7.0.,2、-酪氨酸酶,-酪氨酸酶可催化L-酪氨酸或鄰苯二酚生成二羥苯丙氨酸（DOPA，多巴）。,多巴：一種神經(jīng)傳遞介質(zhì)，治療帕金森 氏綜合癥（英國醫(yī)師Parkinson描述的一種大 腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變的老年性疾?。?。,-酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴的條件為： pH3.5-6.0，溫度30-55。另外，在催化轉(zhuǎn)化時(shí)要添加抗氧化劑，,核苷中的核糖被阿拉伯糖取代可以形成阿糖苷。阿糖苷具有抗癌和抗病毒的作用。其中阿糖腺苷療效顯著。 阿糖腺苷（腺嘌呤阿拉伯糖苷）可由核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷（尿嘧啶阿拉伯糖苷）轉(zhuǎn)化而成。而阿糖尿苷由尿苷（尿嘧啶核苷）通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)化而成。,3、核苷磷酸化酶：,無色桿菌（Acbrcmobacter lydicus）蛋白酶可以特異性地催化胰島素B鏈羧基末端（第30位）上的AA置換反應(yīng)，由豬胰島素（Ala-30） 人胰島素（Thr-30） ，以增加療效。,4、無色桿菌蛋白酶：,AA排列順序 A8 A9 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 豬 Thr Ser Ile Ala,5、5-磷酸二酯酶,5-磷酸二酯酶催化核糖核酸水解生成四種5-核苷酸，5-核苷酸用于心臟疾病、肝臟疾病等的治療。,PNP酶 nNDP+RNAn RNAn+1+pi,6、多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）,PNP酶催化核苷二磷酸聚合生成多聚核苷酸。,式中NDP為核苷二磷酸， RNAn和 RNAn+1分別為含有n和n+1個(gè)核苷酸的 多核苷酸。,若以肌苷二磷酸（IDP）和胞苷二磷酸（CDP）為底物，通過酶的作用，可生成聚肌胞。 聚肌胞是一種高效的干擾素誘導(dǎo)劑，對慢性肝炎、帶狀皰疹、角膜炎等均有一定的療效。 PNP酶可由大腸桿菌等多種菌株生產(chǎn)。,1、根據(jù)欲制造的藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇好原料、反應(yīng)步驟及所使用的酶或酶系。,二、酶的選擇與反應(yīng)條件的優(yōu)化,2、根據(jù)藥物的用途和要求，選擇的酶需經(jīng)過一定步驟進(jìn)行純化，以達(dá)到產(chǎn)品的要求。,3、根據(jù)酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，確定并優(yōu)化反應(yīng)的工藝條件，包括底物濃度、酶濃度、溫度、PH、激活劑的濃度等。,4、要求前體物質(zhì)達(dá)到一定的純度要求并廉價(jià)易得，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。,三、酶和菌體固定化,游離酶的不足：,（1）酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、PH值和無機(jī)離子等外界因素的影響下，容易變性失活。 （2）難于回收利用，不僅使成本較高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 （3）酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，不利于產(chǎn)物的提純和精制。,固定化酶（Immobilized Enzyme） : 固定在載體上，并在一定范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶稱為固定化酶。,將酶與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。,固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為 固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。,（一）酶和菌體固定化的方法,吸附法 包埋法 共價(jià)結(jié)合法 交聯(lián)法,吸附法,吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法。,物理吸附法(physical adsorption)是通過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附于不溶性載體的方法。 常用的載體有：高嶺土、皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微空玻璃等無機(jī)吸附劑，纖維素、膠原以及火棉膠等有機(jī)吸附劑。 離子結(jié)合法(ion binding)是指在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基間的相互作用而達(dá)到酶固定化的方法（離子鍵）。 最常用的交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。 離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。,根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)分為兩種：,吸附法的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時(shí)達(dá)到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 缺點(diǎn)：酶和載體的結(jié)合力不強(qiáng)，易脫落， 會(huì)導(dǎo)致催化活力的喪失和沾污反應(yīng)產(chǎn)物。,2、包埋法,將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。,凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化菌體。,（1）、凝膠包埋法,聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 它的機(jī)械強(qiáng)度高，并可以改進(jìn)酶脫落的情況，在包埋的同時(shí)使酶共價(jià)偶聯(lián)到高聚物上，可以減少酶的脫落。 海藻酸鈉也可以用來作為包埋載體，它從海藻中提取出來，可被多價(jià)離子Ca2+、Al3+凝膠化 ，操作簡單經(jīng)濟(jì)。 K-角叉萊膠（卡拉膠）冷卻成膠或與二、三價(jià)金屬離子成膠。包埋條件溫和無毒性，機(jī)械強(qiáng)度好。固定化的酶活回收率和穩(wěn)定性都比聚丙烯酰胺法好。 膠原和明膠也是常用的包埋載體。,2、微囊化包埋法,微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主要用于醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適于工業(yè)使用 。 微囊制備方法 （1）界面沉淀法是一種簡單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。 （2）界面聚合法是用化學(xué)手段制備微囊的方法。他所得的微囊外觀好，但不穩(wěn)定，有些酶還會(huì)因在包埋過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而失活。 （3）表面活性劑乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性劑使之乳化形成液膜達(dá)到包埋目的的一種方法。,包埋法的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：在于它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶結(jié)構(gòu)但是又較牢固的固定化方法。 缺點(diǎn)：是只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物網(wǎng)架擴(kuò)散，對那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。這是由于高聚物網(wǎng)架會(huì)對大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為改變，使活力降低。,共價(jià)結(jié)合法是目前研究中最為活躍的方