酶分子的修飾與應(yīng)用.ppt

第四章 酶分子的修飾與應(yīng)用,第一節(jié) 酶分子的主鏈修飾 第二節(jié) 酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾 第三節(jié) 酶的組成單位置換修飾 第四節(jié) 金屬離子置換修飾 第五節(jié) 酶分子的物理修飾 第六節(jié) 酶分子修飾的應(yīng)用,酶是具有完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。酶分子的結(jié)構(gòu)決定了酶的性質(zhì)和功能。當(dāng)酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，將會引起酶的性質(zhì)和功能的改變。 正是酶分子的完整結(jié)構(gòu)賦予酶分子以生物催化功能，使酶具有催化效率高、專一性強(qiáng)和作用條件溫和的特點(diǎn)。但是在另一方面，也使酶的分子結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性差、活性不夠高和可能具有抗原性等弱點(diǎn)使酶的應(yīng)用受到限制。為了克服酶的弱點(diǎn)，人們進(jìn)行了酶分子修飾方面的研究。,通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程稱為酶分子修飾。 意義：提高酶的活力；增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；降低或消除酶的抗原性。,第一節(jié) 酶分子的主鏈修飾,肽鏈?zhǔn)堑鞍酌傅闹麈湥缓塑账徭準(zhǔn)呛怂犷惷傅闹麈湣?利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法，稱為酶分子的主鏈修飾。 意義：提高酶的活力；增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；降低或消除酶的抗原性；并可以知道酶活性中心在主鏈上的位置，從而了解主鏈的不同位置對酶的催化功能的貢獻(xiàn)等。,一、主鏈的切斷修飾,主鏈被切斷后，可能出現(xiàn)下列三種情況。 （1）、若主鏈的斷裂引起酶活性中心的破壞，酶將喪失其催化功能，這種修飾主要用于探測酶活性中心的位置。 （2）、若主鏈斷裂后，仍然可以維持酶活性中心的空間構(gòu)象，則酶的催化功能可以保持不變或損失不多，但是其抗原性等特性將發(fā)生改變。這將提高某些酶特別是藥用酶的使用價(jià)值。,藥用酶大多數(shù)來自各種動物、植物或微生物，當(dāng)其進(jìn)入體內(nèi)后，對于機(jī)體來說，酶是一種外源物質(zhì)，在它的刺激下，體內(nèi)會運(yùn)用某些機(jī)制對其進(jìn)行排斥。除了酶分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以外，還由于酶是生物大分子，所以有些酶蛋白具有抗原性。酶蛋白的抗原性與其分子大小有關(guān)，大分子的酶蛋白往往有較強(qiáng)的抗原性，而小分子的蛋白質(zhì)或肽段的抗原性較低或無抗原性。若采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑阜肿拥碾逆溤谔囟ǖ奈稽c(diǎn)斷裂，其分子質(zhì)量減少，就可以在基本保持酶活力的同時(shí)使酶的抗原性降低或消失，這種修飾方法又稱為肽鏈有限水解修飾。例如木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解，除去其肽鏈的三分之二，該酶的活力基本保持，其抗原性性卻大大降低；又如，酵母的烯醇化酶經(jīng)肽鏈有限水解，除去由150個(gè)氨基酸殘基組成的肽段后，酶活力仍然可以保持，抗原性卻顯著降低。,若主鏈的斷裂有利于酶活性中心的形成，則可使酶分子顯示其催化功能或使酶活力提高。有些生物體可以通過生物合成得到不顯示酶催化活性的酶原，這些酶原分子經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎棧梢赞D(zhuǎn)化為具有催化活性的酶。,例如，胰蛋白酶原本來沒有催化活性，當(dāng)受到胰蛋白酶或腸激酶的修飾作用，從N_端除去一個(gè)六肽(ValAspAspAspAspLys)后，就顯示胰蛋白酶的催化功能， 某些RNA分子原本也不具有催化活性，經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎椬饔?，在適當(dāng)位置去除一部分核苷酸殘基以后，可以顯示酶的催化活性，成為一種核酸類酶。 有些酶原來活性較低，通過酶分子主鏈修飾可以顯著提高酶的催化活性例如，天冬氨酸酶通過胰蛋白酶修飾，從其羧基末端切除10個(gè)氨基酸殘基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5倍左右。,二、主鏈的連接修飾,將兩種或兩種以上的酶通過主鏈連接在一起，形成一個(gè)酶分子具有兩種或多種催化活性的修飾方法稱為酶的主鏈連接修飾。 在一個(gè)酶分子上具有兩種或多種催化活性的酶稱為多酶融合體。,第二節(jié) 酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾,采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法稱為側(cè)鏈基團(tuán)修飾。,意義,（1）、通過酶分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾，可以研究各種基團(tuán)在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響，并可以用于研究酶的活性中心的必須基團(tuán)。如果某基團(tuán)修飾后不引起酶活力的顯著變化，則可以認(rèn)為此基團(tuán)屬于非必須基團(tuán)。（2）、通過酶分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾，可以測定某一種基團(tuán)在酶分子中的數(shù)量，例如，采用三硝基苯磺酸測定氨基的數(shù)量；用對汞苯甲酸測定巰基的數(shù)量；用碳二亞胺測定羧基的數(shù)量；用四唑重氮鹽測定咪唑基的數(shù)量等。,（3）、酶分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾，在酶工程方面可以提高酶的活力、增加酶的穩(wěn)定性、降低酶的抗原性，并且可以引起酶催化特性和催化功能的改變，以提高酶的使用價(jià)值。（4）、酶分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾，還可以獲得自然界原來不存在的新酶種，例如，某些抗體酶和人工改造的核酸類酶。,酶有蛋白類酶和核酸類酶。它們的側(cè)鏈基團(tuán)不同，修飾方法也有所區(qū)別。 (1)蛋白類酶主要由蛋白質(zhì)組成，酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)，主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。,酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾可以采用各種小分子修飾劑，例如，氨基修飾劑、羧基修飾劑、巰基修飾劑、胍基修飾劑、酚基修飾劑、咪唑基修飾劑、吲哚基修飾劑等；也可以采用具有雙功能團(tuán)的化合物，如戊二醛、己二胺等進(jìn)行分子內(nèi)交聯(lián)修飾；還可以采用各種大分子與酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)形成共價(jià)鍵而進(jìn)行大分子結(jié)合修飾。其中酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)與水不溶性的大分子結(jié)合的，屬于酶的結(jié)合固定化方法，將在本書第五章闡述。本章主要介紹各種小分子化合物、雙功能團(tuán)化合物和水溶性大分子與酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用的修飾方法。,(2)核酸類酶主要由核糖核酸(RNA)組成。酶RNA的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成RNA的核苷酸殘基上的功能團(tuán)。RNA分子上的側(cè)鏈基團(tuán)較少，主要是核糖2-位置上的羥基(2OH)和嘌呤、嘧啶堿基上的氨基和羥基(酮基)。由于核酸類酶只有二十年的歷史，對核酸類酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾研究較少。然而，其分子上的氨基和羥基(酮基)經(jīng)過修飾后，也會引起核酸類酶的結(jié)構(gòu)改變，從而引起酶的特性和功能的改變。,如果通過核苷酸置換修飾，將核酸類酶的尿嘧啶置換為胸腺嘧啶；再通過側(cè)鏈基團(tuán)修飾，把核糖上的2一OH脫去以后，RNA就變成了單鏈DNA，有可能從中獲得有催化活性的單鏈DNA，即脫氧核酸類酶(deoxyribozyme，dribozyme)。在生理?xiàng)l件下DNA比RNA的穩(wěn)定性高106倍；磷酸二酯鍵比肽鍵的抗水解能力高100倍。所以脫氧核酸類酶的穩(wěn)定性較高，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。,閱讀：P128-131 了解幾種側(cè)鏈修飾,九、大分子結(jié)合修飾,采用水溶性大分子與酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾。 大分子結(jié)合修飾是目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法。采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇 (PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物(Ficoll)、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。 這些水溶性大分子在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后在一定條件下與酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。,1通過修飾提高酶活力,酶的催化功能本質(zhì)上是由其特定的空間結(jié)構(gòu)，特別是由其活性中心的特定構(gòu)象所決定的。水溶性大分子與酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)通過共價(jià)鍵結(jié)合后，可使酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活性中心更有利于與底物結(jié)合，并形成準(zhǔn)確的催化部位，從而使酶活力提高。,2、通過修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性,酶的穩(wěn)定性可以用酶的半衰期表示。酶的半衰期是指酶的活力降低到原來活力的一半時(shí)所經(jīng)過的時(shí)間。不同的酶有不同的半衰期，相同的酶在不同的條件下半衰期也不一樣。半衰期短，則穩(wěn)定性差。有些藥用酶在進(jìn)入體內(nèi)之后，往往穩(wěn)定性差，半衰期短。例如，超氧化物歧化酶(SOD)在人體血漿中的半衰期只有3060min，尿激酶在人體內(nèi)的半衰期僅為220 min。為此，如何增加酶的穩(wěn)定性、延長酶的半衰期，是酶工程研究的一個(gè)重要課題。,可以與酶分子結(jié)合的大分子有水溶性和水不溶性兩類。采用不溶于水的大分子與酶結(jié)合制成固定化酶后，其穩(wěn)定性顯著提高(參看本書第五章)。采用水溶性的大分子與酶共價(jià)結(jié)合進(jìn)行酶分子修飾，可以在酶分子外圍形成保護(hù)層，起到保護(hù)酶的空間構(gòu)象的作用，從而增加酶的穩(wěn)定性。,現(xiàn)以SOD為例說明如下。 SOD（EC1.15.1.1）催化超氧負(fù)離子（O2-）進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，生成氧和過氧化氫。具有抗氧化、抗輻射、抗衰老的功效，但是其在血漿中的半衰期僅為630min，經(jīng)過大分子修飾，其穩(wěn)定性顯著提高，半衰期延長70350倍，見下表。,天然SOD與修飾后SOD在人血漿中的半衰期,第三節(jié) 酶的組成單位置換修飾,酶蛋白的組成單位是什么？ 酶RNA的組成單位是什么？,酶蛋白的基本組成單位是氨基酸，將酶分子肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸的修飾方法，稱為氨基酸置換修飾。 酶RNA的基本組成單位是核苷酸，將酶分子核苷酸鏈上的某一個(gè)核苷酸換成另一個(gè)核苷酸的修飾方法，稱為核苷酸置換修飾。,一、酶分子組成單位置換修飾的作用,1通過修飾可以提高酶活力 例如，酪氨酸RNA合成酶可催化酪氨酸和與其相對應(yīng)的tRNA反應(yīng)生成酪氨酰tRNA，若將該酶第51位的蘇氨酸(Thr51)由脯氨酸置換，修飾后的酶對ATP的親和性提高近100倍，酶活力提高25倍。,2通過修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 例如，T4一溶菌酶分子中第3位的異亮氨酸(Ilu3)置換成半胱氨酸后，該半胱氨酸(Cys3)可以與第97位的半胱氨酸(Cys97)形成二硫鍵，修飾后的T4溶菌酶其活力保持不變，但該酶對熱的穩(wěn)定性卻大大提高。,3通過修飾可以使酶的專一性發(fā)生改變 例如，采用化學(xué)方法，將枯草桿菌蛋白酶活性中心上的絲氨酸置換成半胱氨酸后，酶對蛋白質(zhì)和多肽的水解活性消失，而出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物進(jìn)行水解反應(yīng)的活性。再如，L-19 IVS的催化中心為GGAGGG一系列，可以催化底物GGccucuAAAAAA與鳥苷酸(G)反應(yīng)，生成GGCCUCU和GAAAAAA兩種產(chǎn)物，采用定點(diǎn)突變方法，使活性中心上第2個(gè)鳥苷酸殘基置換成胞苷酸殘基(-GCAGGG-)，置換修飾后的酶對原底物無催化活性，而呈現(xiàn)出對底物GGCCUGUAAAAAA的催化活性。,第四節(jié) 金屬離子置換修飾,把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的功能和特性發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。,通過金屬離子置換修飾，可以了解各種金屬離子在酶催化過程中的作用，有利于闡明酶的催化作用機(jī)制，并有可能提高酶活力，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，甚至改變酶的某些動力學(xué)性質(zhì)。,有些酶分子中含有金屬離子，而且往往是酶活性中心的組成部分，對酶催化功能的發(fā)揮有重要作用。例如，a-淀粉酶中的鈣離子(Ca2+)，谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的鋅離子(Zn2+)，超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+，Zn2+)等。,若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。,金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。例如，鈣離子(Ca2+)，鎂離子(Mg2+)，錳離子(Mn2+)，鋅離子(Zn2+)，鈷離子(Co2+)，銅離子(Cu2+)，鐵離子(Fe2+)等。,在離子置換修飾過程中，首先在經(jīng)過分離純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。然后用一定量的另一種金屬離子加到酶液中，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。,1提高酶活力,有些酶通過金屬離子置換修飾后可以顯著提高酶活力。例如，a-淀粉酶分子中大多數(shù)含有鈣離子，有些則含有鎂離子或鋅離子等其他離子，所以一般的a-淀粉酶是雜離子型的。如果將其他雜離子都換成鈣離子，則可以提高酶活力并顯著增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。結(jié)晶的鈣型a-淀粉酶的活力比一般結(jié)晶的雜離子型a-淀粉酶的活力提高3倍以上，而且穩(wěn)定性大大增加。故此，在a-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)、保存和應(yīng)用過程中，添加一定量的鈣離子，有利于提高和穩(wěn)定a-淀粉酶的活力。再如，將鋅型蛋白酶的鋅離子除去，然后加進(jìn)鈣離子，置換成鈣型蛋白酶，其酶活力可以提高2030。,2增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 有些酶分子中的金屬離子被置換以后，其穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。例如，鐵型超氧化物歧化酶(Fe-SOD)分子中的鐵離子被錳離子置換，成為錳型超氧化物歧化酶(MnSOD)后，其對過氧化氫的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，對疊氮鈉(NaN3)的敏感性顯著降低。,3改變酶的動力學(xué)特性 有些經(jīng)過金屬離子置換修飾的酶，其動力學(xué)性質(zhì)有所改變。例如，?；被崴饷傅幕钚灾行暮袖\離子，用鈷離子置換后，其催化N-氯-乙酰丙氨酸水解的最適pH值從8.5降低為7.0。同時(shí)該酶對N-氯-乙酰蛋氨酸的米氏常數(shù)Km增大，親和力降低。,第五節(jié) 酶分子的物理修飾,通過各種物理方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱為酶分子的物理修飾。,通過酶分子的物理修飾，可以了解在不同物理?xiàng)l件下，特別是在高溫、高壓、高鹽、低溫、真空、失重、極端pH值、有毒環(huán)境等極端條件下，由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。極端條件下酶催化特性的研究對于探索太空、深海、地殼深處以及其他極端環(huán)境中，生物的生存可能性及其潛力有重要的意義，同時(shí)還有可能獲得在通常條件下無法得到的各種酶的催化產(chǎn)物。,通過酶分子的物理修飾，還可能提高酶的催化活性，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，或者是酶的催化動力