人外周血淋巴細(xì)胞微核測(cè)定.ppt

人外周血淋巴細(xì)胞微核測(cè)定,一、目的要求 1、掌握人外周血淋巴細(xì)胞微核標(biāo)本制備方法。 2、熟悉人外周血淋巴細(xì)胞微核的形態(tài)特征。 3、了解微核的發(fā)生機(jī)制及微核檢測(cè)技術(shù)的用途。,二、實(shí)驗(yàn)原理: 人外周血淋巴細(xì)胞大都處于細(xì)胞周期的G0期，在含有PHA的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)后，原來處于G0期的淋巴細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，恢復(fù)分裂能力。在細(xì)胞分裂過程中，由于化學(xué)物質(zhì)或輻射作用影響，可以引起淋巴母細(xì)胞染色體損傷，致使染色體斷裂，無著絲粒的染色體斷片不能隨染色體移動(dòng)進(jìn)入子細(xì)胞核，結(jié)果在細(xì)胞質(zhì)中形成微核。本試驗(yàn)是一種體外測(cè)試有害因子遺傳毒性的方法，通過在人類外周血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中加入受試物，檢測(cè)細(xì)胞微核情況來評(píng)價(jià)受試物的遺傳毒性。同時(shí)也成為檢測(cè)致突變、致癌、致畸物質(zhì)對(duì)機(jī)體遺傳效應(yīng)的一種重要手段。,三、實(shí)驗(yàn)用品 （1）器材：離心管、注射器、培養(yǎng)瓶（10ml）、吸管、離心機(jī)、載玻片、冰箱、培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱。 （2）試劑：Giemsa染液、pH6.8磷酸緩沖液、RPMI1640培養(yǎng)液、PHA溶液、0.075molL KCl溶液、甲醇:冰醋酸固定液 （3）材料：人外周血、環(huán)磷酰胺溶液。,四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、按人類外周血染色體培養(yǎng)常規(guī)方法采血、接種，按組分別加入受試物（CP終濃度100ug/ml）培養(yǎng)72小時(shí)，收獲前不用加秋水仙素，收獲標(biāo)本，離心，去上清液。 2、低滲：加入0.075molL KCl溶液4m1?；靹蚝蠓湃?7恒溫水浴箱中低滲處理10分鐘。低滲時(shí)間可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞完整程度進(jìn)行調(diào)整。 3、預(yù)固定：低滲結(jié)束后加入甲醇冰乙酸（3:1）固定液lml，混勻后離心（1000rpm）5分鐘。 4、固定：棄上清液，加入5ml固定液，混勻后離心（1000rpm）5分鐘。棄上清液，留沉淀物?？砂幢痉椒ㄔ俟潭ㄒ淮?。 5、滴片：加入少量固定液混勻成細(xì)胞懸液，滴片。 6、染色：用Giemsa染液染色 10分鐘。自來水細(xì)水沖洗后，晾干。,7、觀察與計(jì)數(shù)：先以低倍鏡、高倍鏡粗檢，選擇細(xì)胞分散均勻，染色良好的區(qū)域，轉(zhuǎn)到油鏡下觀察轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，進(jìn)行微核的觀察和計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞比較，前者細(xì)胞較大，胞核明顯偏離中心，染色質(zhì)較細(xì)致疏松或呈網(wǎng)狀、核仁多，胞漿豐富，常見空泡和偽足。 微核的識(shí)別：微核是存在于已轉(zhuǎn)化的胞漿完整的淋巴細(xì)胞中的小核，其直徑為主核的13以下，形態(tài)為圓形或橢圓形，嗜色性和主核一致或略淺，必須與主核完全脫離。一個(gè)細(xì)胞中，不論出現(xiàn)一個(gè)微核或多個(gè)微核，均按一個(gè)有微核的細(xì)胞計(jì)數(shù)，微核細(xì)胞率以千分率表示，即1000個(gè)已轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞中有微核的細(xì)胞