IPTG誘導外源基因表達

IPTG誘導表達原理及操作步驟E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達 。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動。當有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經(jīng)b半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應用。材料1、誘導表達材料( 1 ) LB （LuriaBertani）培養(yǎng)基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0適用范圍：大腸桿菌( 2 ) IPTG 貯備液2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 m 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，20 保存。( 3 ) l 凝膠電泳加樣緩沖液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （電泳級）0.1 溴酚藍10 甘油2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料1 ）酶溶法（1）裂解緩沖液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF）。（3）10 mg / mL 溶菌酶。（4）脫氧膽酸。（5）1 mg / mL DNase I。2 ）超聲破碎法 ( 1 ) TE 緩沖液。 ( 2 ) 2SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 溴酚藍20 甘油實驗方案1、外源基因的誘導表達 (1）用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。 (2）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應的宿主菌。 (3）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，確定無誤后進行下一步。 (4）如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 培養(yǎng)數(shù)小時，使培養(yǎng)液的OD600達0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ；如果表達載體的原核啟動子為tac 等，則37 培養(yǎng)細菌數(shù)小時達到對數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h 。 (5）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 L 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化1 ）細菌的裂解常用方法有： 高溫珠磨法； 高壓勻漿； 超聲破碎法； 酶溶法； 化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法 、 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用，后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；-1,3 -葡聚糖酶；-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。主要步驟為： 4 ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導表達的細菌培養(yǎng)液（100mL）。棄上清，約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液，懸浮沉淀。目的蛋白的誘導表達和純化(1)菌在含氨芐青霉素（100 mg/L）的LB培養(yǎng)基中37 振搖培養(yǎng)過夜(2)按10%的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮 LB培養(yǎng)基，250 rpm, 37搖菌至A600=1(3)加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37繼續(xù)通氣培養(yǎng)45 h(4)分別于2h、4h各取1.5 mL菌液，7734g離心30s收集菌體(5)菌體加入H2O 60 L，劇烈振蕩混勻，再加入4樣品緩沖液20 L，100，5 min；7734g離心5 min；(6) %SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，考馬斯亮藍染色后觀察誘導結(jié)果(7)大規(guī)模培養(yǎng)細菌,誘導表達目的蛋白,離心,收集菌體,將菌體重懸于lysis buffer,超聲破菌(8)離心后將上清和沉淀分別制樣，進行SDSPAGE(9)可溶的目的蛋白直接應用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱進行親和層析純化. 以包涵體形式存在的表達產(chǎn)物. 用N十二烷基肌氨酸鈉將沉淀蛋白質(zhì)變性過夜，經(jīng)緩慢透析去除N十二烷基肌氨酸鈉，令蛋白復性后，用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱對目的蛋白進行親和層析純化(10)先以 5 10個柱體積 (CV) PBS緩沖液平衡柱, 流速 1.5 ml/min;樣品液 10 ml上樣, 流速為 0.5 ml/min, 用 5 10 CV緩沖液洗脫未結(jié)合的物質(zhì); 5 CV的洗脫液洗脫目標蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脫液。 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定表達產(chǎn)物, 檢測表達產(chǎn)物的分子量及純化效果。重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達及純化將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21 中, 選取多個重組菌落接種 LB液體培養(yǎng)基中 37 振搖培養(yǎng)過夜,按 1100 比例轉(zhuǎn)入新鮮 LB培養(yǎng)基, 培養(yǎng)至 OD值為 1.0 時, 加入終濃度為 1.0 mmol/L的 IPTG繼續(xù)誘導培養(yǎng) 3 h。離心, 收集菌體。將誘導后的菌體重懸于 lysis buffer, 超聲破碎后離心去沉淀, 收集樣品液。 GSTrapFF 柱親和層析純化重組蛋白。 先以 5 10個柱體積 ( CV) PBS緩沖液平衡柱, 流速 1.5 ml/min;樣品液 10 ml 上樣, 流速為 0.5 ml/min, 用 5 10 CV緩沖液洗脫未結(jié)合的物質(zhì); 5 CV的洗脫液洗脫目標蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脫液。 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( SDS-PAGE) 鑒定表達產(chǎn)物, 檢測表達產(chǎn)物的分子量及純化效果。鋪板培養(yǎng)12h后挑取陽性克隆 ,37、300g培養(yǎng)至菌液A260=0.6時 , 加入終濃度為1mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導蛋白表達。分別于2h、4h各取菌液100L, 離心收集細菌沉淀 , 行SDS-PAGE電泳 , 考馬斯亮藍染色后觀察誘導結(jié)果。大量菌液37 1mmol/L IPTG誘導表達4h后回收細菌沉淀。將誘導的蛋白用純化包涵體的方法進行初步純化 , 然后進行SDS-PAGE電泳 , 回收包涵體.將切下的目的蛋白條帶用電洗脫方法回收。GST親和層析原理谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（Glutathion S-transferases，簡稱GSTs，EC2.5.1.18）廣泛存在于動物和人體的各種組織，是由多個基因編碼的、具有多種功能的一組同功酶，分子量為23-29KD。GST蛋白能與親和介質(zhì)上的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價親和，再用還原性谷胱甘肽競爭GST上的結(jié)合位點將GST蛋白洗脫下來，從而達到純化的目的。1ml樹脂大約可結(jié)合5-8 mg融合蛋白，并可反復使用數(shù)次。試劑IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖苷）：2g IPTG 溶解入10ml 水，過濾除菌，分裝，-20保存。Lysis buffer （50ml）1)2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris，pH8.0 3)90ml distilled water .操作步驟1)挑一個克隆至2ml LB液中（Amp+ ）2)37振搖至OD600值約為0.6 3)將2ml菌液加入100 ml LB中 4)37振搖至OD600值約為0.6 5)加入IPTG至終濃度為1mM 6)繼續(xù)搖34h 7)離心（5000 rpm，5min，4）8)用10柱體積的lysis buffer懸浮細菌 9)超聲破碎細胞 10)離心（12,000rpm,15min,4），取上清 11)用濾紙過濾 12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽瓊脂糖beads于層析柱 13)5柱體積的lysis buffer洗層析柱 14)樣品過柱 15)5柱體積的lysis buffer洗層析柱 16)3柱體積的elution buffer洗脫蛋白