微生物遺傳變異與菌種選育.pptVIP

第六章 微生物的遺傳變異與菌種選育,在應(yīng)用微生物加工制造和發(fā)酵生產(chǎn)各種食品的過程中，要想有效地大幅度提高產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量和花色品種,首先必須選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種，才能達到目的。而優(yōu)良菌種的選育是在微生物遺傳變異的基礎(chǔ)上進行的。遺傳和變異是相互關(guān)聯(lián)，同時又相互矛盾對立的兩個方面，在一定條件下，二者是相互轉(zhuǎn)化的。認識和掌握微生物遺傳變異的規(guī)律是搞好菌種選育和關(guān)鍵。,本章主要內(nèi)容,微生物遺傳變異的基本原理 關(guān)于微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)及其存在形式。 關(guān)于微生物基因突變的基本原理（類型、特點和機制）。 關(guān)于微生物基因重組的基本原理（方式和特點）。 微生物菌種的選育 關(guān)于野生型微生物菌菌株分離、篩選與純化。 關(guān)于微生物的誘變育種的工作程序和方法步驟。 關(guān)于營養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選方法和具體應(yīng)用。 原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的操作程序。 基因工程育種技術(shù)的操作步驟和取得的成就。 微生物菌種退化的原因；掌握菌種復(fù)壯的方法、防止菌種退化的措施以及菌種保藏的方式和原理。,第一節(jié) 微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),證明核酸是遺傳變異物質(zhì)基礎(chǔ)的經(jīng)典實驗 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗 噬菌體的感染實驗 煙草花葉病毒的拆開與重組實驗,肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗,噬菌體的感染實驗,1952 年侯喜(A. Hershey)和蔡斯(M. Chase)利用示蹤元素，對大腸桿菌 T2 噬菌體進行了這類實驗。 先用含有 35S 和 32P 兩種元素的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，然后讓 T2 噬菌體侵染培養(yǎng)后的大腸桿菌，從而使 T2 噬菌體打上 35S 和 32P 的標(biāo)記。 讓這種 T2 噬菌體侵染不含標(biāo)記元素的大腸桿菌，并在 T2 噬菌體完成了吸附和侵入后， 強烈攪拌洗滌，以便使吸附在菌體外表的 T2 噬菌體蛋白質(zhì)外殼脫離細胞并均勻分布，再進行離心沉淀，分別測定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部 35S 都在上清液中，而幾乎全部 32P 和細菌一起出現(xiàn)在沉淀物中。,煙草花葉病毒的拆開與重組實驗,1956 年，美國的法朗克-康勒特(Fraenkel-Conrat) 將煙草花葉病毒拆成RNA(因該病毒不含DNA)和蛋白質(zhì)，并分別對煙草進行感染實驗； 結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有 RNA能感染煙草，并在感染后的寄主中分離到完整的具蛋白質(zhì)外殼的煙草花葉病毒。 后來他又將甲、乙兩種變種的煙草花葉病毒拆開，在體外分別將甲病毒的 RNA和乙病毒的蛋白質(zhì)結(jié)合，將乙病毒的RNA 和甲病毒的蛋白質(zhì)結(jié)合進行重組。 接著他把這些經(jīng)過重組的病毒分別感染煙草。結(jié)果從寄主分離所得的病毒蛋白質(zhì)均取決于相應(yīng)病毒的 RNA。證明了核酸(RNA)是煙草花葉病毒的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。,二、遺傳物質(zhì)在細胞中的存在方式,（一）細胞水平 從細胞水平來看，細胞核；除此之外，在細胞質(zhì)中存在著一些能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)，一般稱這部分DNA 為質(zhì)粒。 （二）亞細胞核水平 真核微生物的細胞核有核膜包圍，形成具有完整形態(tài)、在光學(xué)顯微鏡下清晰可見的細胞核，核內(nèi)DNA 與組蛋白結(jié)合在一起構(gòu)成染色體。 （三）分子水平 DNA（ RNA）在DNA 大分子上存在著決定某些遺傳性狀的特定區(qū)段，即所謂基因一個基因含若干核苷酸堿基組成的三聯(lián)密。 四種核苷酸，按其排列組合方式的不同，可編出三聯(lián)密碼 4364個，用于決定組成蛋白質(zhì)的20 種氨基酸順序。起始密碼（AUG）和終止密碼（UAA、UGA和UAG）。,第二節(jié) 微生物的基因突變,一、基因突變的類型 基因突變的類型是多種多樣的，按突變體表型不同，可分為以下幾種類型： （1）形態(tài)突變型。 （2）條件致死突變型。 （3）營養(yǎng)缺陷突變型。 （4）抗性突變型。 （5）抗原突變型。 （6）其他突變型。,二、基因突變的特點 整個生物界，由于它們遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)是相同的，因此顯示在遺傳變異的本質(zhì)上都具有相同的規(guī)律，這在基因突變的水平上尤其突出。 （1）不對應(yīng)性。 （2）自發(fā)性。 （3）稀有性。 （4）獨立性。 （5）誘變性。 （6）穩(wěn)定性。 （7）可逆性。,三 、基因突變的機理 （一）誘發(fā)突變及其機理 1 堿基對的置換 直接引起置換的誘變劑 （亞硝酸類、烷化劑類） 間接引起置換的誘變劑 （堿基類似物） 2 移碼突變 3 染色體畸變 （二）自發(fā)突變的機制 1 背景輻射和環(huán)境中多因素低劑量的誘變效應(yīng) 2 微生物自身代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng) 3 互變異構(gòu)效應(yīng) 4 環(huán)狀突出效應(yīng),堿基對的置換,堿基對的置換可分成兩個亞類：一類是DNA 鏈上的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換，稱為轉(zhuǎn)換；另一類是DNA 鏈上的一個嘌呤被另一個嘧啶或是一個嘧啶被另一個嘌呤所置換，稱為顛換 A：T T：A A T C：G G：C C G 雙鏈DNA 單鏈DNA （實線代表轉(zhuǎn)換，虛線代表顛換）,直接引起置換的誘變劑,亞硝酸是一種對含有氨基的堿基對直接作用而誘發(fā)堿基對轉(zhuǎn)換的誘變劑。它能使堿基中的氨基氧化脫氨，從而使腺嘌呤（A）變成次黃膘呤（H），胞嘧啶（C）變成尿嘧啶（U）， 而后由于H 和C 配對，U 與A 配對，因此當(dāng)DNA 再次復(fù)制時，A:T 就轉(zhuǎn)換為 G:C，而G:C 就轉(zhuǎn)換為 A:T。,H:C H:C-G:C H:CG:C A:T H:T-A:T 亞硝酸類引起的堿基對置換,烷化劑是誘變育種極其重要的一類誘變劑，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)都帶有一個或多個活性烷基。所有這些物質(zhì)通過烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶與DNA 作用，特別是經(jīng)常形成烷化鳥嘌呤。 烷化作用導(dǎo)致基因突變的機制尚未定論。 堿基類似物作用，引起堿基配對的錯誤。 烷基在鳥嘌呤 引起脫嘌呤作用，使鳥嘌呤從DNA 鏈上脫落下來，進而引起DNA 復(fù)制時堿基對的缺失和置換。,間接引起置換的誘變劑,A:BU /G:BrU G:BrU -G:C 5-BU A:T- A:BU- A:T (a) G:BrU /A:BU A:BU-A:T 5-BrU G:C-G:BrU -G:C (b) 5-溴尿嘧啶的誘變效應(yīng) a.5-BU以酮式摻入； b.5-BrU以烯醇式摻入,5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、-氨基嘌呤（-AP）及 6-氮嘌呤（6-NP）等。它們的作用是通過活細胞的代謝活動摻入到DNA 分子中后，引起堿基對的置換，因此是間接的。在這些堿基類似物中，最常被應(yīng)用的是 5-溴尿嘧啶（5-BrU）和-氨基嘌呤（-AP）。 5-BrU是T 的代謝類似物。 5-BrU 以酮式狀態(tài)時可以替代 T，與A配對； 5-BrU 以烯醇式狀態(tài)時替代C與G配對；5BrU 可以通過烯醇式和酮式結(jié)構(gòu)的變化； 引起堿基對置換。,移碼突變,移碼突變 這是指由一種誘變劑而引起DNA 分子中的一個或少數(shù)幾個堿基插入或缺失，從而使該部位后面全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄錯誤的一類突變。 吖啶類染料及其化合物是移碼突變的有效誘變劑，例如三氨基吖啶，吖啶黃，吖啶橙，5-氨基吖啶。 吖啶類化合物的誘變機制目前還不很清楚?，F(xiàn)普遍認為，由于吖啶類化合物是一種平面型三環(huán)分子結(jié)構(gòu)，與一個嘌呤:嘧啶堿基對相似，因此能夠嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開，從而在DNA 復(fù)制過程中，會使鏈上插入或缺失一個堿基，結(jié)果引起移碼突變。,染色體畸變,染色體畸變是指由誘變劑引起DNA 分子的大損傷，它包括染色體結(jié)構(gòu)上的缺失、重復(fù)、易位及倒位等。 紫外線、X 射線、射線等射線及亞硝酸、烷化劑等均能引起染色體畸變，尤其是紫外線能引起DNA 分子多處較大的損傷。 紫外線主要通過在同鏈DNA 相鄰的嘧啶間或在互補雙鏈間形成以共價鍵結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體， 微生物能以多種方式去修復(fù)被紫外線損作后的 DNA，主要方式有兩種： （1）光復(fù)活作用。 由于微生物中一般都存在著光復(fù)合作用，因此，用紫外線照射菌液時都須在紅光下進行操作處理微生物，而后在暗室或用黑布包起來培養(yǎng)。 （2） 暗修復(fù)作用。也稱切除修復(fù)作用。 X 射線和 射線為電離輻射，含有很高的能量，能產(chǎn)生電離作用，因而能直接或間接地改變DNA 結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是堿基的化學(xué)鍵，脫氧核糖的化學(xué)鍵和糖酸相連接的化學(xué)鍵斷裂；,第三節(jié) 微生物的基因重組,基因重組又稱為遺傳重組，它是指把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的過程。 重組是分子水平上的概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交，而一般所說的雜交是細胞水平上的概念。 雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交一種形式。真核微生物中的有性雜交，準性生殖以及原核微生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和溶原轉(zhuǎn)變等都是基因重組在細胞水平上的反映。,一、原核微生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transtormation）,受體菌直接吸收來自供體菌的DNA 片段，通過交換組合把它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。供體菌的DNA 片段稱為轉(zhuǎn)化因子。 只有處于感受態(tài)的細菌才能接受轉(zhuǎn)化因子，進行轉(zhuǎn)化作用。,轉(zhuǎn)化過程大致是這樣的： 從供體菌提取出轉(zhuǎn)化因子雙鏈DNA片段； 雙鏈DNA 片段與感受態(tài)受體菌的細胞表面特定位點結(jié)合； 在結(jié)合位點上，雙鏈DNA 中的一條單鏈逐步降解，同時另一條鏈逐步進入受體細胞。 進入受體細胞的DNA 單鏈與受體菌染色體組上同源區(qū)段配對，而受體菌染色體組的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被進入受體細胞的DNA 單鏈所取代，于是形成了雜種DNA 區(qū)段； 受體菌染色體進行復(fù)制，其中雜種區(qū)段被分離成兩個，一個恢復(fù)，一個形成一個轉(zhuǎn)化子。,一、原核微生物的基因重組（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction ）,通過缺陷型噬菌體或溫和型噬菌體為媒介，將供體細菌細胞中DNA 片段攜帶到受體細菌細胞中，從而使受體細菌獲得供體細菌的某些遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。 根據(jù)媒介噬菌體的不同，轉(zhuǎn)導(dǎo)分普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩類。,1普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 由缺陷型噬菌體誤包（而非整合）供體細菌DNA 中的任何一部分片段（包括核外遺傳物質(zhì)在內(nèi)）后，當(dāng)它再次感染受體細菌時，使后者獲得了這部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。它的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為 105108。 2局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) 由溫和噬菌體侵染而形成的某一溶源細菌群被誘導(dǎo)裂解時，其中極少數(shù)個體的DNA 可能與噬菌體DNA 發(fā)生若干特定基因的交換，從而被整合到噬菌體的基因組上，當(dāng)該噬菌體再次感染受體細菌時，就使受體細菌獲得了這一特定遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，它的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為 10-6。,一、原核微生物的基因重組（三）接合（conjugation ）,通過供體細菌和受體細菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA 的過程，稱為接合（有時也稱雜交）。 在細菌中，接合現(xiàn)象研究最清楚的是大腸桿菌。發(fā)現(xiàn)能夠進行接合現(xiàn)象的大腸桿菌有雄性與雌性之分，而決定它們性別的是由是否存在 F 因子所決定。 F 因子又稱致育因子，是一種質(zhì)粒，分子量為 5107 道爾頓； 雌性細菌不含F(xiàn) 因子，稱為F - 菌株， 雄性細菌含有游離存在的F 因子，稱為F + 菌株， 當(dāng)雄性細菌細胞中所含的F 因子被整合在細胞核的DNA 上，不呈游離狀態(tài)存在稱為Hfr 菌株（高頻重組菌株）； 有時被整合在細胞核DNA 上的F 因子，從DNA上面脫落下來，呈游離存在，但在脫落時，F(xiàn) 因子有時能帶一小段細胞核 DNA。我們將這種含有游離存在的但又帶有一小段細胞核DNA 的F 因子的細菌稱為 F菌株。,一、原核微生物的基因重組（四）溶源性轉(zhuǎn)變,宿主菌在感染溫和噬菌體后，由于噬菌體DNA整合到核DNA后，導(dǎo)致宿主菌某些新的遺傳性狀表達，即所謂溶源性轉(zhuǎn)變。 這是一種與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似但又有本質(zhì)不同的現(xiàn)象。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)在本質(zhì)上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶有任何供體菌的基因，其次這種噬菌體是正常的完整的，而不是異常情況下產(chǎn)生的缺陷型噬菌體。 溶源轉(zhuǎn)變的典型例子是不產(chǎn)毒素的白喉棒狀桿菌（Lorynebatcerium diphthariac）菌株被噬菌體侵染而發(fā)生溶源化時，會變成產(chǎn)毒素的致病菌株。其他如沙門氏菌、紅霉菌、鏈霉菌等也具有溶源轉(zhuǎn)變的能力。,二、真核微生物的基因重組（一）有性雜交,在微生物的有性繁殖過程中，不同的性細胞間的接合，并隨之發(fā)生染色體的重組，從而產(chǎn)生新遺傳型后代的現(xiàn)象，稱有性雜交。 凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能進行有性雜交。 有性雜交在生產(chǎn)實踐中被廣泛用于優(yōu)良品種的培育。例如用于酒精發(fā)酵的酵母菌和用于面包發(fā)酵的酵母菌同屬一種啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的兩個不同菌株，面包酵母的特點是對麥芽糖及葡萄糖的發(fā)酵力強，產(chǎn)生 CO2 多，生長快；而酒精酵母的特點是產(chǎn)酒率高而對麥芽糖、葡萄糖的發(fā)酵力弱，所以釀酒廠生產(chǎn)酒精后的酵母，不能供面包廠作引子用。通過兩者的雜交，就得到了既能生產(chǎn)酒精，又能將其殘余菌體用作面包廠和家用發(fā)面酵母的優(yōu)良菌種。,二、真核微生物的基因重組（二）準性生殖,準性生殖是一種類似于有性生殖但比它更為原始的一種生殖方式。是由兩個非異配型核的細胞接合后，形成異核體細胞，兩核能發(fā)生低頻率的接合與交換，產(chǎn)生具有新性狀的個體。其主要過程包括以下基本過程： 1菌絲聯(lián)結(jié) 發(fā)生在一些形態(tài)上沒有區(qū)別的，但在遺傳性狀上可以有差別的兩個同種親本的體細胞（單倍體）間。 2形成異核體 兩個單倍體細胞經(jīng)聯(lián)結(jié)后，使原有的兩個單倍體核集中到同一個細胞中，形成雙相的異核體。異核體能夠獨立生活。 3核融合 在異核體中的雙核融合，產(chǎn)生雙倍體雜合子核。核融合后產(chǎn)生雜合子核的頻率也是極低的，如構(gòu)巢曲霉和米曲霉為 10-510 -7 。 4體細胞重組和單倍體化 雙倍體的雜合子極不穩(wěn)定，在進行有絲分裂過程中，極少數(shù)核中的染色體會發(fā)生染色體交換和單倍體化，從而形成了極個別的具有新遺傳性狀的單倍體雜合子。,第四節(jié) 微生物的菌種選育,在微生物工業(yè)應(yīng)用中， 微生物菌種工作主要包括以下四方面： 菌種的分離篩選：挑選符合生產(chǎn)要求的菌種，這是選種工作的任務(wù)。 菌種培育： 改良已有菌種的生產(chǎn)性能，使產(chǎn)品的質(zhì)和量不斷提高，或使它更適應(yīng)于工藝的要求，這是育種工作的任務(wù)。 菌種的保藏： 一切生產(chǎn)菌種都要使它避免死亡和生產(chǎn)性能的下降，這是菌種保藏工作的任務(wù)。 退化菌種的復(fù)壯： 如果發(fā)現(xiàn)菌種的生產(chǎn)性能下降，就要設(shè)法使它恢復(fù)，這便是菌種復(fù)壯工作的任務(wù)。,一、從自然界中分離篩選菌種的方法步驟,（一）誘變育種的一般步驟和方法 出發(fā)菌株 同步培養(yǎng) 使菌細胞處于相同或接近的生理狀態(tài) 單細胞（或單孢子）菌懸液的制備 單細胞或單孢子的意義 酵母或霉菌孢子106 /ml 、細菌108 /ml 誘變劑的選擇及其劑量的確定 以致死率為9099 為宜 誘變處理 物理誘變劑 化學(xué)誘變劑,確定出發(fā)菌株 菌種的純化選優(yōu) 出發(fā)菌株的性能鑒定 同步培養(yǎng) 制備單細胞（或單孢子）懸液 活菌濃度測定 誘變劑的選擇與確定誘變劑量的預(yù)試驗 誘變處理 平板分離 計形態(tài)變異的菌落數(shù)，計算突變率 挑取疑似突變菌落純培養(yǎng) 突變體的初步篩選 用簡單快捷的方法 重復(fù)篩選 搖瓶發(fā)酵試驗 選出突變體（根據(jù)情況進行生產(chǎn)試驗或重復(fù)誘變處理）,二、微生物的誘變育種,二、微生物的誘變育種,（二）變異菌株的初步篩選,紙片培養(yǎng)顯色法,透明圈法,瓊脂塊培養(yǎng)法,1 篩選用培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基：凡是能滿足某種野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基；常以-表示； 在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質(zhì)如蛋白胨、酵母膏等，以滿足該微生物的各種營養(yǎng)缺陷型菌株都能生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基，常用+表示； 在基本培養(yǎng)基中只是有針對性地加入某一種或某幾種營養(yǎng)缺陷成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)基，補充培養(yǎng)基可按所加入營養(yǎng)成分相應(yīng)地用A、B等來表示。,（三）營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及其應(yīng)用,二、微生物的誘變育種,2營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法 （1）誘變劑處理 （2）淘汰野生型菌株 抗生素法 菌絲過濾法 （3）檢出營養(yǎng)缺陷型 （4）鑒定營養(yǎng)缺陷型,檢出營養(yǎng)缺陷型,鑒定營養(yǎng)缺陷型, 含營養(yǎng)缺陷型菌株的基本培養(yǎng)基平板的制備。 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)類別的鑒定。 缺陷型菌株單一營養(yǎng)因素的鑒定。,20種氨基酸的排列編組,原生質(zhì)體融合育種,細胞（A+B） 細胞（AB+） 脫壁處理 脫壁處理 原生質(zhì)體（A+B） 原生質(zhì)體（AB+） 混合 加融合劑 原生質(zhì)體融合 涂平板（原生質(zhì)體再生） 形成菌落 檢出重組子菌落（A+B+）,轉(zhuǎn)基因工程菌株的構(gòu)建,1提取目的基因 用密度梯度離心方法分別從供體細胞中提取所需要的DNA即目的基因和作為載體的細菌質(zhì)?；蚴删w核酸，目的基因也可通過化學(xué)方法人工合成。 2處理目的基因 根據(jù)基因工程的“設(shè)計藍圖”的要求，在從供體細胞中提取出的目的基因中加入專一性很強的限制性核酸內(nèi)切酶進行處理，從而獲得帶有特定基因并暴露出粘性末端的DNA單鏈部分。必要時這種粘性末端也可用人工方法合成。 對作為載體的細菌質(zhì)粒或噬菌體DNA可采用與處理目的基因同一種類的限制性核酸內(nèi)切酶進行處理，使其形成并暴露出與目的基因相應(yīng)的粘性末端。 3體外重組 將上述分別處理過的目的基因和細菌質(zhì)粒DNA片段（或噬菌體核酸）放在試管中，在較低溫度（56）下混合“退火”。由于這兩種DNA是用同一種限制性核酸內(nèi)切酶進行處理，具有相同的粘性末端，因此相互之間能夠形成氫鍵，這就是所謂“退火”。而相鄰的核苷酸，在DNA連接酶的作用下也能形成磷酸二酯鍵，這樣就完成