植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.ppt

第十三章 植物遺傳轉(zhuǎn)化體系建立,第一節(jié) 植物基因轉(zhuǎn)化的受體體系 轉(zhuǎn)基因植物是指利用重組DNA技術(shù)將外源優(yōu)良目的基因整合到植物的基因組中，并使其得以表達(dá)，從而獲得具有新的遺傳性狀的植物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)是良好的受體體系，因此，建立了高效穩(wěn)定的受體體系，才能進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因的操作和應(yīng)用。,植物基因轉(zhuǎn)化的受體體系是指將用于基因轉(zhuǎn)化的外植體-利用組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑，建立高效、穩(wěn)定并能接受外源基因的整合以及對(duì)轉(zhuǎn)化篩選抗生素較敏感的再生系統(tǒng)。良好的基因轉(zhuǎn)化的受體體系的建立是成功實(shí)現(xiàn)觀賞植物遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，而合適的轉(zhuǎn)化受體體系要有高效穩(wěn)定的再生能力。,理想的受體材料是： 細(xì)胞既要能有效地接受外源目的基因，還應(yīng)由單細(xì)胞分化再生植株，減少假陽(yáng)性植株和嵌合體。目前常用的外植體有原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、胚狀體、葉圓盤、葉片、莖段、下胚軸、無(wú)性胚等。 其次，受體材料的特性，包括受體材料的生理狀態(tài)，受體的再生能力和再生途徑，體細(xì)胞無(wú)性系變異的發(fā)生等。,再次，適宜的誘導(dǎo)和篩選條件，如培養(yǎng)基種類和組成，篩選劑種類、濃度，篩選時(shí)間等都會(huì)影響到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的分化和抗性植株再生。 最后，觀賞植物基因轉(zhuǎn)化的受體體系要有較高的遺傳穩(wěn)定性，要求受體系統(tǒng)在接受外源DNA后不應(yīng)影響其正常的生長(zhǎng)、分裂、發(fā)育、分化，并能穩(wěn)定地將接受的外源DNA遺傳給后代，盡量減少變異。,一、直接分化受體體系 是外植體直接分化出不定芽獲得再生植株而建立的受體體系。 獲得再生植株的操作簡(jiǎn)單，周期短。 體細(xì)胞無(wú)性系變異小，獲得的再生植株其遺傳性質(zhì)十分穩(wěn)定，特別是由莖尖分生組織經(jīng)過(guò)直接分化建立的再生系統(tǒng)其遺傳穩(wěn)定性更佳。 但通常由外植體直接分化成芽難度較大，再生頻率較低。同時(shí)不定芽的再生常常起源于多細(xì)胞，容易存在嵌合體。,二、愈傷組織 愈傷組織受體體系是外植體經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織再獲得再生植株而建立的受體體系。 由分生細(xì)胞組成，易于接受外源目的DNA，轉(zhuǎn)化效率較高。 繁殖系數(shù)迅速增加，可以獲得大量的轉(zhuǎn)化植株。 適合于通過(guò)直接分化難以獲得再生植株的植物和相應(yīng)的外植體，特別是單子葉植物和木本植物。 愈傷組織通常是由多細(xì)胞組成的，易產(chǎn)生嵌合體；同時(shí)獲得的再生植株無(wú)性系變異較大，外源基因整合的穩(wěn)定性較差。,三、原生質(zhì)體 在進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化之前要盡可能選取與母本遺傳一致的外植體來(lái)建立有效的再生體系。原生質(zhì)體是植物遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最廣的、理想的受體材料之一。 特點(diǎn)有： 去除了細(xì)胞壁的阻礙，能夠直接高效地接受外源DNA并整合到染色體上。,原生質(zhì)體生理生化特性幾乎一致，便于在相對(duì)均勻、穩(wěn)定的同等條件下實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)化、鑒定。 原生質(zhì)體經(jīng)過(guò)培養(yǎng)易于形成基因型一致的細(xì)胞系，較易避免嵌合體的產(chǎn)生，性狀也易純化且穩(wěn)定遺傳。 受體體系可適合于多種轉(zhuǎn)基因方法。 但原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術(shù)要求高、過(guò)程復(fù)雜、周期長(zhǎng)，獲得再生植株的頻率較低；同時(shí)原生質(zhì)體培養(yǎng)形成的細(xì)胞無(wú)性系變異強(qiáng)烈，再生植株變異頻率較高，限制了原生質(zhì)體作為遺傳轉(zhuǎn)化受體的應(yīng)用。,四、懸浮細(xì)胞 基因轉(zhuǎn)化的受體體系的特點(diǎn)是： 生長(zhǎng)迅速，重復(fù)性好，易于接受外源DNA，轉(zhuǎn)化效率較高。 懸浮細(xì)胞主要是由單細(xì)胞、小細(xì)胞團(tuán)組成，可有效克服轉(zhuǎn)基因植株中存在的嵌合體現(xiàn)象。 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件易于控制，便于進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的篩選。 但建立良好的細(xì)胞懸浮系受植物基因型的影響較大，且耗時(shí)較長(zhǎng)，一般需要36個(gè)月時(shí)間。同時(shí)隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胚性懸浮細(xì)胞的再生能力會(huì)逐漸喪失，并導(dǎo)致突變體的產(chǎn)生。,五、胚狀體 體細(xì)胞胚發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)體細(xì)胞胚的產(chǎn)生起源于單細(xì)胞，能在突變體育種和基因重組育種中克服嵌合體現(xiàn)象。體細(xì)胞胚受體體系的特點(diǎn)是： 1.發(fā)育成胚狀體的胚性細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂特性和接受外源目的DNA的能力，是理想的基因轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)這些胚性細(xì)胞繁殖量大，同步性好，轉(zhuǎn)化效率高。,2.胚狀體的發(fā)生是單細(xì)胞起源，因此獲得的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少。 3.胚狀體具有兩極性，即在發(fā)育過(guò)程中能同時(shí)分化出芽和根，克服了某些植物由不定芽難以生根的缺陷。,4.與植物器官再生方式相比，胚狀體發(fā)生速度快、數(shù)量多、結(jié)構(gòu)完整、再生率高，胚狀體個(gè)體間的遺傳背景一致，不容易產(chǎn)生變異，使獲得的轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性好。 5.與周圍細(xì)胞存在隔離區(qū)，和培養(yǎng)物沒(méi)有維管束聯(lián)系，容易從培養(yǎng)物上剝離。 6.利用胚狀體可生產(chǎn)人工種子。,六、生殖細(xì)胞受體體系（種質(zhì)系統(tǒng)） 利用植物的生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)叫生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)，也稱種質(zhì)系統(tǒng)。 目前主要通過(guò)兩個(gè)途徑建立生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)。 1、利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)，通過(guò)誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞或愈傷組織，獲得單倍體植株，建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化受體體系。 2、直接利用花粉和卵細(xì)胞受精、發(fā)育過(guò)程進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，如花粉管通道法、花粉粒浸泡法、子房注射法等。,生殖細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的特點(diǎn)有： 生殖細(xì)胞再生能力強(qiáng)，接受外源目的基因的能力也強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率高。 生殖細(xì)胞是單倍體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的基因無(wú)顯隱性影響，能提高外源基因的表達(dá)效率，有利于性狀的選擇。通過(guò)加倍后能獲得純合的二倍體。 跟傳統(tǒng)的育種技術(shù)結(jié)合，能縮短復(fù)雜的育種純化過(guò)程，簡(jiǎn)化種質(zhì)創(chuàng)新程序。 易于獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。,第二節(jié) 植物基因轉(zhuǎn)化的方法 一、載體轉(zhuǎn)化方法 （一）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 根癌農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段可轉(zhuǎn)移的DNA （T-DNA），農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，而T-DNA插入外源DNA片段并不影響整合。,（二）植物病毒法 植物病毒作為潛在的轉(zhuǎn)化載體，具有易于浸染、拷貝數(shù)多和啟動(dòng)外源基因表達(dá)能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因而引起人們的極大興趣，其中最有希望的是花椰菜花葉病毒（CaMV），已有實(shí)驗(yàn)證明它能進(jìn)入宿主細(xì)胞并得以擴(kuò)增及傳播。,二、DNA理化轉(zhuǎn)移方法 不依賴于農(nóng)桿菌載體和其他生物媒體，將經(jīng)過(guò)特殊處理的裸露外源DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法叫DNA直接導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化技術(shù)根據(jù)原理可分為物理法和化學(xué)法2種。物理法是基于諸多物理因素對(duì)細(xì)胞膜的影響，或通過(guò)機(jī)械損傷直接將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞，；化學(xué)法借助于特定的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞 。,第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因植株再生及檢測(cè) 一、轉(zhuǎn)基因植株再生 植物轉(zhuǎn)基因方法眾多，轉(zhuǎn)基因植株的再生方法也