GB4789.30-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗.pdf

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.302010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗 National food safety standard Food microbiological examination: Listeria monocytogenes 中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施GB 4789.302010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 4789.30-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗 。 本標(biāo)準(zhǔn)與 GB/T 4789.30-2008 相比，主要變化如下： 修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱； 刪除“第二法 全自動酶鏈熒光免疫分析儀篩選法”； 刪除“第三法 全自動病原菌檢測系統(tǒng)篩選法”。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄 A 為規(guī)范性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷年版本發(fā)布情況為： GB 4789.30-1994、GB/T 4789.30-2003、GB/T 4789.30-2008。GB 4789.302010 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的檢驗方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗。 2 設(shè)備和材料 除微生物實驗室常規(guī)無菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 2.1 冰箱：2 5 。 2.2 恒溫培養(yǎng)箱：30 1 、36 1 。 2.3 均質(zhì)器。 2.4 顯微鏡：10100。 2.5 電子天平：感量 0.1 g 。 2.6 錐形瓶：100 mL、500 mL。 2.7 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度） 。 2.8 無菌平皿：直徑 90 mm。 2.9 無菌試管：16 mm160 mm.。 2.10 離心管：30 mm100 mm。 2.11 無菌注射器：1 mL。 2.12 金黃色葡萄球菌（ATCC25923） 。 2.13 馬紅球菌（Rhodococcus equi） 。 2.14 小白鼠：16 g18 g。 2.15 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。 3 培養(yǎng)基和試劑 3.1 含 0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE） ：見附錄 A 中 A.1。 3.2 含 0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE） ：見附錄 A 中 A.2。 3.3 李氏增菌肉湯 LB（LB1，LB2） ：見附錄 A 中 A.3。 GB 4789.302010 2 3.4 1 %鹽酸吖啶黃（acriflavine HCl）溶液：見附錄 A 中 A.3.2.1。 3.5 1 %萘啶酮酸鈉鹽（naladixic acid）溶液：見附錄 A 中 A.3.2.1。 3.6 PALCAM 瓊脂：見附錄 A 中 A.4。 3.7 革蘭氏染液：見附錄 A 中 A.5。 3.8 SIM 動力培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.6。 3.9 緩沖葡萄糖蛋白胨水甲基紅（MR）和 V-P 試驗用：見附錄 A 中 A.7。 3.10 5 %8 %羊血瓊脂：見附錄 A 中 A.8。 3.11 糖發(fā)酵管：見附錄 A 中 A.9。 3.12 過氧化氫酶試驗：見附錄 A 中 A.10。 3.13 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基。 3.14 生化鑒定試劑盒。 GB 4789.302010 3 4. 檢驗程序 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗程序見圖 1。 圖 1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗程序 5 操作步驟 5.1 增菌 以無菌操作取樣品 25 g（mL）加入到含有 225 mL LB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì) 1 min2 min；或放入盛有 225 mL LB1增菌液的均質(zhì)杯中，8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min。 于 30 1 培養(yǎng) 24 h， 移取 0.1 mL， 轉(zhuǎn)種于 10 mL LB2增菌液內(nèi)， 于 30 1 培養(yǎng) 18 h24 h。 5.2 分離 取 LB2 二次增菌液劃線接種于 PALCAM 瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上，于 36 1 培養(yǎng)24 h48 h，觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在 PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈， 有些菌落有黑色凹陷； 典型菌落在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說明進(jìn)行判定。 5.3 初篩 自選擇性瓊脂平板上分別挑取 5 個以上典型或可疑菌落，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于 36 1 培養(yǎng) 24 h；同時在 TSA-YE 平板上劃線純化，于 30 1 培養(yǎng) 24 h48 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。 30 1 ，18 h24 h 30 1 ，24 h 檢樣 25 g(mL)樣品+LB1增菌液 225 mL，均質(zhì) 0.1 mL+10 mL LB2增菌液 36 1 ，24 h48 h 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基PALCAM 瓊脂接種木糖、鼠李糖，36 1 ，24 h；同時于TSA-YE 平板劃線純化，30 1 ，24 h48 h木糖，鼠李糖鑒定結(jié)果報告GB 4789.302010 4 5.4 鑒定 5.4.1 染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小為（0.4 m0.5 m）（0.5 m2.0 m） ；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運動。 5.4.2 動力試驗：李斯特氏菌有動力，呈傘狀生長或月牙狀生長。 5.4.3 生化鑒定：挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，進(jìn)行過氧化氫酶試驗，過氧化氫酶陽性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗和 MR-VP 試驗。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表 1。 5.4.4 溶血試驗：將羊血瓊脂平板底面劃分為 20 個25 個小格，挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落刺種到血平板上， 每格刺種一個菌落， 并刺種陽性對照菌(單增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌)，穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂，36 1 培養(yǎng) 24 h48 h，于明亮處觀察，單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌無溶血環(huán)，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生大的透明溶血環(huán)。 5.4.5 協(xié)同溶血試驗 (cAMP)：在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌， 挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不要觸及平行線，于 30 1 培養(yǎng) 24 h48 h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強(qiáng)，斯氏李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)，而伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌的接種端溶血增強(qiáng)。 5.5 可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)等對5.3中3個5個純培養(yǎng)的可疑菌落進(jìn)行鑒定。 表 1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區(qū)別 菌種 溶血反應(yīng) 葡萄糖 麥芽糖 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七葉苷單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 (L. monocytogenes) / 格氏李斯特氏菌 (L. grayi) / 斯氏李斯特氏菌 (L. seeligeri) / 威氏李斯特氏菌 (L. welshimeri) / V 伊氏李斯特氏菌 (L. ivanovii) / 英諾克李斯特氏菌 (L. innocua) / V 注：陽性；陰性；V 反應(yīng)不定。 5.6 小鼠毒力試驗（可選擇） 將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于 TSB-YE 中，于 30 1 培養(yǎng) 24 h，4 000 r/min 離心 5 min，棄上清液， 用無菌生理鹽水制備成濃度為 1010 CFU/mL 的菌懸液， 取此菌懸液進(jìn)行小鼠腹腔注射 3 只5 只，每只 0.5 mL，觀察小鼠死亡情況。致病株于 2 d5 d 內(nèi)死亡。試驗時可用已知菌作對照。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌對小鼠有致病性。 6 結(jié)果與報告 綜合以上生化試驗和溶血試驗結(jié)果，報告 25 g（mL）樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。 GB 4789.302010 5 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 A.1 含 0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE) A.1.1 成分 胰胨 17.0 g 多價胨 3.0 g 酵母膏 6.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸氫二鉀 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.27.4 A.1.2 制法 將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.2 含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE) A.2.1 成分 胰胨 17.0 g 多價胨 3.0 g 酵母膏 6.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸氫二鉀 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 瓊脂 15.0 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.27.4 A.2.2 制法 將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.3 李氏增菌肉湯(LB1，LB2) A.3.1 成分 胰胨 5.0 g 多價胨 5.0 g 酵母膏 5.0 g 氯化鈉 20.0 g 磷酸二氫鉀 1.4 g 磷酸氫二鈉 12.0 g 七葉苷 1.0 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.27.4 GB 4789.302010 6 A.3.2 制法 將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.3.2.1 李氏液 (LB1)225 mL 中加入： 1 % 萘啶酮酸 (用 0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液配制) 0.5 mL 1 % 吖啶黃 (用無菌蒸餾水配制) 0.3 mL A.3.2.2 李氏液 (LB2)200 mL 中加入： 1 % 萘啶酮酸 0.4 mL 1 % 吖啶黃 0.5 mL A.4 PALCAM A.4.1 成分 酵母膏 8.0 g 葡萄糖 0.5 g 七葉甙 0.8 g 檸檬酸鐵銨 0.5 g 甘露醇 10.0 g 酚紅 0.1 g 氯化鋰 15.0 g 酪蛋白胰酶消化物 10.0 g 心胰酶消化物 3.0 g 玉米淀粉 1.0 g 肉胃酶消化物 5.0 g 氯化鈉 5.0 g 瓊脂 15.0 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.27.4 A.4.2 制法 將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.4.2.1 PALCAM 選擇性添加劑 多粘菌素 B 5.0 mg 鹽酸吖啶黃 2.5 mg 頭孢他啶 10.0 mg 無菌蒸餾水 500 mL A.4.2.2 制法 將 PALCAM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶化后冷卻到 50 ， 加入 2 mL PALCAM 選擇性添加劑， 混勻后傾倒在無菌的平皿中，備用。 A.5 革蘭氏染色液 A.5.1 結(jié)晶紫染色液 A.5.1.1 成分 結(jié)晶紫 1.0 g 95乙醇 20.0 mL 1草酸銨水溶液 80.0 mL A.5.1.2 制法 GB 4789.302010 7 將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。 A.5.2 革蘭氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化鉀 2.0 g 蒸餾水 300 mL A.5.2.2 制法 將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 300 mL。 A.5.3 沙黃復(fù)染液 A.5.3.1 成分 沙黃 0.25 g 95乙醇 10.0 mL 蒸餾水 90.0 mL A.5.3.2 制法 將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。 A.5.4 染色法 A.5.4.1 將純培養(yǎng)的單個可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1 min，水洗。 A.5.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗。 A.5.4.3 滴加 95乙醇脫色，約 15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。 A.5.4.4 滴加復(fù)染液，復(fù)染 1 min，水洗、待干、鏡檢。 A.6 SIM 動力培養(yǎng)基 A.6.1 成分 胰胨 20.0 g 多價胨 6.0 g 硫酸鐵銨 0.2 g 硫代硫酸鈉 0.2 g 瓊脂 3.5 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.2 A.6.2 制法 將上述各成分加熱混勻，調(diào)節(jié) pH，分裝小試管，121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.6.3 試驗方法 挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落穿刺接種到 SIM 培養(yǎng)基中，于 30 培養(yǎng) 24 h48 h，觀察結(jié)果。 A.7 緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR 和 VP 試驗用) A.7.1 成分 多胨 7.0 g 葡萄糖 5.0 g 磷酸氫二鉀 5.0 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.0 A.7.2 制法 溶化后調(diào)節(jié) pH，分裝試管，每管 1 mL，121 高壓滅菌 15 min，備用。 GB 4789.302010 8 A.7.3 甲基紅（MR）試驗 A.7.3.1 甲基紅試劑 A.7.3.1.1 成分 甲基紅 10 mg 95 %乙醇 30 mL 蒸餾水 20 mL A.7.3.1.2 制法 10 mg 甲基紅溶于 30 mL 95 %乙醇中，然后加入 20 mL 蒸餾水。 A.7.3.1.3 試驗方法 取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于本培養(yǎng)基，36 1 培養(yǎng) 2 d5 d。滴加甲基紅試劑一滴，立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性，黃色為陰性。 A.7.4 V-P 試驗 A.7.4.1 6 % -萘酚-乙醇溶液 成分及制法：取 -萘酚 6.0 g，加無水乙醇溶解，定容至 100 mL。 A.7.4.2 40 %氫氧化鉀溶液 成分及制法：取氫氧化鉀 40 g，加蒸餾水溶解，定容至 100 mL。 A.7.4.3 試驗方法 取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于本培養(yǎng)基，36 1 培養(yǎng) 2 d4 d。加入 6% -萘酚-乙醇溶液 0.5 mL 和40 %氫氧化鉀溶液 0.2 mL，充分振搖試管，觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色，如為陰性，應(yīng)放在 36 1 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 再進(jìn)行觀察。 A.8 血瓊脂 A.8.1 成分 蛋白胨 1.0 g 牛肉膏 0.3 g 氯化