微生物的生長及影響因素.ppt

微生物的生長及影響因素,一、微生物的生長,個體生長：細胞體積增大，重量增加。 個體生長個體繁殖群體生長 除了特定的目的以外，在微生物的研究和應用中提到的“生長”，均指群體生長。,細菌的繁殖方式,Binary fission-growth cycle,二、微生物群體的生長規(guī)律,把少量純種單細胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中后，在適宜的條件下，它們的群體就會有規(guī)律的生長起來。以細胞數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標，以培養(yǎng)時間作橫坐標，就得到微生物的典型生長曲線。 根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)R不同，可分為： Lag phase（延滯期、調整期、適應期） Exponential phase（指數(shù)期、對數(shù)期） Stationary phase（穩(wěn)定期、平衡期） Death phase（衰亡期）,Growth cycle of populations in batch culture,1、延滯期,特點 生長速率常數(shù)R = 0 細胞形態(tài)變大或增長 細胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質呈堿性。 合成代謝活躍，易產(chǎn)生誘導酶。 對外界不良條件反應敏感 影響因素： 菌種特性 接種齡 接種量 培養(yǎng)基成分,（1）接種齡的影響,接種齡：種子的群體生長年齡，即它處在生長曲線的哪一個階段，這是一種生理年齡。 若以對數(shù)期接種齡的種子接種，則子代培養(yǎng)物的延滯期就短。 若以延滯期或衰亡期的種子接種，則子代培養(yǎng)物的延滯期就長。 若以穩(wěn)定期的種子接種，則延滯期居中。,（2）接種量的影響,一般說來，接種量大，則延滯期短，因此，在發(fā)酵工業(yè)上，為縮短不利于提高發(fā)酵效率的延滯期，一般采用10%的接種量。,（3）培養(yǎng)基成分的影響,接種到營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基中的微生物，要比接種到營養(yǎng)單調的組分培養(yǎng)基中的延滯期短。 在發(fā)酵生產(chǎn)中，常使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基的成分盡量接近。,2、對數(shù)生長期,特點： R最大，增代時間（代時G）或倍增時間最短。 細胞進行平衡生長，菌體內(nèi)各種成分最為均勻。 酶系活躍，代謝旺盛。 影響因素： 菌種特性 營養(yǎng)成分 營養(yǎng)物濃度 培養(yǎng)溫度,（1）營養(yǎng)成分的影響,同一種細菌，在營養(yǎng)物豐富的培養(yǎng)基中生長，其代時較短，反之則長。,（2）營養(yǎng)物濃度的影響,在營養(yǎng)物濃度很低的情況下，營養(yǎng)物的濃度才會影響生長速率；隨著營養(yǎng)物濃度的提高，生長速率不受影響，而只影響最終的菌體產(chǎn)量；進一步提高營養(yǎng)物濃度，則生長速率和菌體產(chǎn)量兩者均不受影響。 凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的營養(yǎng)物，稱為生長限制因子。,（3）培養(yǎng)溫度的影響,E.coli在不同溫度下的代時 溫度 代時（分） 溫度 代時（分） 10 860 35 22 15 120 40 17.5 20 90 45 20 25 40 47.5 77 30 29,特征參數(shù),繁殖代數(shù) n： x2=x12n n = 3.322 (lgx2 lgx1) 生長速率常數(shù) R：單位時間內(nèi)的繁殖代數(shù) R = n / (t2 t1) = 3.322 (lgx2 lgx1) / (t2 t1) 代時G：繁殖一代所需的時間 G = 1/ R = (t2 t1) / 3.322 (lgx2 lgx1),3、穩(wěn)定期,特點： R = 0，菌體產(chǎn)量達到最高點（細胞繁殖數(shù)=死亡數(shù)）。 細胞開始儲存糖原、異染顆粒和脂肪等儲藏物。 以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物的最佳收獲期。 穩(wěn)定期到來的原因： 營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡； 營養(yǎng)物的比例失調； 有害代謝產(chǎn)物累積； pH、氧化還原電勢等物化條件不適宜。,4、衰亡期,特點： 個體死亡速度 新生速度，群體呈現(xiàn)負生長； 細胞形態(tài)多樣； 細胞產(chǎn)生自溶； 產(chǎn)生或釋放抗生素； 芽孢桿菌中芽孢的釋放。 衰亡期到來原因： 環(huán)境條件越來越不利，從而引起細胞內(nèi)分解代謝大大超過合成代謝，導致菌體死亡。,生長曲線的應用,縮短延滯期，以縮短發(fā)酵周期 取對數(shù)生長期的種子接種 延長對數(shù)生長期，有利于形成大量的微生物細胞 采用連續(xù)培養(yǎng) 延長穩(wěn)定期，有利于代謝產(chǎn)物積累 根據(jù)細胞內(nèi)含物判斷菌齡； 根據(jù)生長期控制培養(yǎng)條件。,三、連續(xù)培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)：當微生物以單批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)到對數(shù)期的后期時，一方面以一定速度連續(xù)流進新鮮培養(yǎng)基，并立即攪拌均勻；另一方面，利用溢流的方式，以同樣的流速不斷流出培養(yǎng)物。這樣，培養(yǎng)物就達到動態(tài)平衡，其中的微生物可長期保持在指數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率上。,單批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)的關系,連續(xù)培養(yǎng)器的類型,內(nèi)控制（控制菌體濃度）：恒濁器 外控制（控制培養(yǎng)液流速，以控制生長速率）：恒化器 單級連續(xù)培養(yǎng)器 多級連續(xù)培養(yǎng)器 一般連續(xù)培養(yǎng)器 固定化細胞連續(xù)培養(yǎng)器 實驗室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器 發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐,按控制方式分,按培養(yǎng)器的級數(shù)分,按細胞狀態(tài)分,按用途分,恒濁器與恒化器,恒濁器（turbidostat）：根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細胞的連續(xù)培養(yǎng)器。 恒化器（chemostat）：一種設法使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)裝置。,恒化器,恒濁器與恒化器的比較 裝置 控制對象 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基流速 生長速率 產(chǎn)物 應用范圍 恒濁器 菌體密度 無限制 不恒定 最高速率 大量菌體 生產(chǎn)為主 （內(nèi)控制） 生長因子 或與菌體 相平行的 代謝產(chǎn)物 恒化器 培養(yǎng)基 有限制 恒定 低于 不同生長 實驗室 流速 生長因子 最高速率 速率菌體 為主 （外控制）,連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點,優(yōu)點 高效 自控 產(chǎn)品質量較穩(wěn)定 節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽 缺點 菌種易于退化 易遭雜菌污染 營養(yǎng)物的利用率低,四、影響微生物生長的主要因素,溫度 氧氣 pH 滲透壓 水活度,1、溫度,基本原理 溫度通過影響蛋白質、核酸等生物大分子的結構與功能以及細胞膜的流動性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。 過高的環(huán)境溫度會導致蛋白質或核酸的變性失活 過低的環(huán)境溫度會抑制酶活力，降低細胞的新陳代謝活動。 應用：高溫滅菌，低溫保藏菌種。,Heat denaturation of proteins,最低生長溫度：一般為-5-10，極端為-30 嗜冷菌：20 生長溫度 最適生長溫度 嗜溫菌：2045 嗜熱菌：45 最高生長溫度：一般為8095 最適生長溫度：分裂代時最短或生長速率最高時的培養(yǎng)溫度。 最適生長溫度發(fā)酵速度最高時的培養(yǎng)溫度代謝產(chǎn)物量最高時的溫度生長量最高時溫度,微生物各生理過程的不同最適溫度 菌 名 生長溫度 發(fā)酵溫度 累積產(chǎn)物溫度 嗜熱鏈球菌 37 47 37 乳酸鏈球菌 34 40 產(chǎn)細胞：2530 產(chǎn)乳酸：30 灰色鏈霉菌 37 28 北京棒桿菌 32 3335 丙酮丁醇梭菌 37 33 產(chǎn)黃青霉 30 25 20,Cardinal temperatures,Temperature classes,2、氧氣,根據(jù)微生物與氧的關系，可分為： 專性好氧菌：必需在有氧條件下生長 好氧菌 兼性厭氧菌：在有氧及無氧條件下均能生長，但在有氧條件下生 長得更好。 微好氧菌：生長需要少量的氧，過量的氧常導致這類微生物死 亡。 耐氧菌：生長不需要氧，但氧對其也無毒害。 厭氧菌 （專性）厭氧菌：只能生長在無氧條件下，氧劇毒 ，即使短期 接觸空氣，也會抑制其生長甚至致死。,(a)專性好氧菌；(b)厭氧菌；(c)兼性厭氧菌；(d)微好氧菌；(e)耐氧菌,厭氧菌的氧毒害機制,O2 + e O2 . 2 O2 . + 2H+ H2O2 + O2 NADH2 NAD,SOD,好氧生物及耐氧菌,2H2O,過氧化氫酶,好氧生物,過氧化物酶,耐氧菌,H2O + O2,3、 pH值,基本原理 使蛋白質、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，從而影響其生物活性； 引起細胞膜電荷變化，導致微生物細胞吸收營養(yǎng)物質能力改變； 改變環(huán)境中營養(yǎng)物質的可給性及有害物質的毒性。,pH：-lgH+，指外界環(huán)境的pH值。 嗜堿微生物 最適生長pH值偏于堿性 （如多數(shù)放線菌） 耐堿微生物 微生物 （如鏈霉菌） 嗜酸微生物 最適生長pH值偏于酸性 （多數(shù)真菌） 耐酸微生物 （乳酸桿菌）,不同微生物的生長pH范圍 微生物 pH值 最低 最適 最高 氧化硫硫桿菌 0.5 2.03.5 6.0 嗜酸乳桿菌 4.04.6 5.86.6 6.8 大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0 褐球固氮菌 4.5 7.47.6 9.0 一種亞硝化單胞菌 7.0 7.88.6 9.4 醋化醋桿菌 4.04.5 5.46.3 7.08.0 金黃色葡萄球菌 4.2 7.07.5 9.3 泥生綠菌 6.0 6.8 7.0 水生棲熱菌 6.0 7.57.8 9.5 黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0 一般放線菌 5.0 7.08.0 10.0 一般酵母菌 3.0 5.06.0 8.0,幾種抗生素產(chǎn)生菌的生長與發(fā)酵的最適pH,抗生素產(chǎn)生菌 生長最適pH 合成抗生素最適pH 灰色鏈霉菌 6.36.9 6.77.3 紅霉素鏈霉菌 6.67.0 6.87.3 產(chǎn)黃青霉 6.57.2 6.26.8 金霉素鏈霉菌 6.16.6 5.96.3 龜裂鏈霉菌 6.06.6 5.86.1 灰黃青霉 6.47.0 6.26.5,pH,微生物在生命活動過程中，會改變外界環(huán)境中的pH值。 糖類 發(fā)酵、氧化 有機酸 有機物 脂肪 水解 有機酸 培養(yǎng)基內(nèi) 蛋白質 脫羧 胺類 中性成分 (NH4)2SO4 NH4+選擇吸收 H2SO4 無機鹽 NaNO3 NO3-選擇吸收 NaOH,pH調節(jié)方法,過酸時：加NaOH、Na2CO3等堿中和 過堿時：加H2SO4、HCl等酸中和 加適當?shù)矗喝缒蛩亍aNO3、 過酸時 NH4OH或蛋白質等 “ 治本” 提高通氣量 過堿時 加適當碳源：糖、乳酸、甘油等 降低通氣量 加磷酸緩沖液（K2HPO4 KH2PO4） 加CaCO3或NaHCO3,外 源 調 節(jié),“治標”,內(nèi)源調節(jié),4、滲透壓,滲透壓：由于溶質濃度差而在細胞膜兩側造成的壓力差。滲透壓的大小與溶液中分子或離子的質點數(shù)有關。等重的物質，其分子或離子越小，則質點數(shù)越多，滲透壓越大。 低滲溶液：外界濃度細胞內(nèi)濃度，細胞失水，發(fā)生質壁分離。 絕大多數(shù)微生物在0.5%3%的鹽濃度范圍內(nèi)可正常生長，10%15%的鹽濃度能抑制大部分微生物的生長。,5、水活度aw,水活度aw：表示在天然環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水的含量。 自由水：微生物可利用。 細胞內(nèi)水分狀態(tài) 結合水：微生物不能利用。 aw定量：在相同溫度和壓力下，某溶液的蒸汽壓P與純水蒸汽壓P0之比，也等于溶液的百分相對濕度。 aw = P/ P0 = ERH/100 純水： aw = 1，無水： aw = 0， 0 aw1 各種微生物生長繁殖的aw值范圍：0.9980.6,微生物生長的最低aw,細菌 一般：0.900.98 嗜鹽菌：0.75 酵母菌 一般；0.870.91 高滲酵母：0.610.65 霉菌 一般：0.800.87 耐旱菌：0.650.75,若干事物的aw,新鮮水果：0.970.99 鮮肉（家畜）：0.97 面包：0.86 蔗糖飽和液：0.76 大米、面粉（含水量14%）：0.65 奶粉：0.2,6、化學因素對微生物的影響,常用的化學消毒劑主要有重金屬及其鹽類、有機溶劑（酚、醇、醛等）、鹵族元素及其化合物、染料和表面活性劑等。 重金屬離子：可與菌體蛋白質結合而使之變性或與某些酶蛋白的巰基相結合而使酶失活；重金屬鹽是蛋白質沉淀劑，還可與代謝產(chǎn)物發(fā)生鰲合作用而使之變?yōu)闊o效化合物。 有機溶劑：可使蛋白質及核酸變性，也可破壞細胞膜透性使內(nèi)含物外溢。 碘：可與蛋白質酪氨酸殘基不可逆結合而使蛋白質失活。 氯氣：與水反應產(chǎn)生的強氧化劑具有殺菌作用。 染料：在低濃度條件下可抑制細菌生長，革蘭氏陽性菌普遍比革蘭氏陰性菌對染料更加敏感。 表面活性劑：能降低溶液表面張力，改變微生物細胞膜透性，使蛋白質變性。,五、微生物培養(yǎng)技術的發(fā)展,從少量培養(yǎng)發(fā)展到大規(guī)模培養(yǎng) 從淺層培養(yǎng)發(fā)展到厚層（固體）或深層（液體）培養(yǎng) 從以固體培養(yǎng)技術為主發(fā)展到以液體培養(yǎng)技術為主 從靜止式液體培養(yǎng)發(fā)展到通氣攪拌式的液體培養(yǎng) 從單批培養(yǎng)發(fā)展到連續(xù)培養(yǎng)以至多級連續(xù)培養(yǎng) 從利用分散的微生物細胞發(fā)展到利用固定化的細胞集團 從單純利用微生物細胞到大量培養(yǎng)、利用高等動植物細胞 從單菌發(fā)酵發(fā)展到混菌發(fā)酵 從利用野生菌種發(fā)展到利用變異株以及“工程菌”等等,1、微生物的實驗室培養(yǎng),固體培養(yǎng) 好氧菌的培養(yǎng)：主要有試管斜面、培養(yǎng)皿平板及較大型的茄子瓶等的平板培養(yǎng)方法。 厭氧菌的培養(yǎng) 高層瓊脂柱：用加有還原劑的固體或半固體培養(yǎng)基裝入試管中，以培養(yǎng)相應的厭氧菌。在這種培養(yǎng)基中，越是深層，其氧化還原勢越低，因而越有利于厭氧菌的生長。 厭氧培養(yǎng)箱,液體培養(yǎng) 好氧菌的培養(yǎng) 試管液體培養(yǎng) 三角瓶淺層培養(yǎng) 搖瓶培養(yǎng)：廣泛用于菌種的篩選以及生理生化和發(fā)酵實驗。 臺式發(fā)酵罐：體積一般為幾升至幾十升 厭氧菌的培養(yǎng) 采用加有有機還原劑（如巰基乙酸、半胱氨酸、維生素C等）或無機還原劑（鐵絲等）的 深層液體培養(yǎng)基，并在其上封以凡士林-石蠟層。 厭氧培養(yǎng)箱,2、生產(chǎn)實踐中的微生物培養(yǎng),固體培養(yǎng) 好氧菌的曲法培養(yǎng)：將接過種的固體基質薄薄地攤鋪在容器表面，這樣，既可使微生物獲得充分的氧氣