(論文)菊花嫩莖快繁技術的研究 論文(2013年優(yōu)秀畢業(yè)設計論文)

畢 業(yè) 設 計（論 文） 菊花嫩莖快繁技術的研究專 業(yè) 生物技術及應用 學生姓名 班 級 生物技術及應用(2)班 學 號 指導教師 完成日期 5 第5頁，共13頁附1：成績評議學號姓名 題目 指導教師建議成績： 評閱教師建議成績： 答辯小組建議成績： 院答辯委員會評閱意見及評定成績：答辯委員會主任簽字（蓋章）： 年 月 日附2：畢業(yè)設計（論文）任務書姓名學號班級題目菊花嫩莖快繁技術的研究設計(論文)主要內容配制培養(yǎng)基（包括：誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基。）先配制誘導培養(yǎng)基組培室消毒（超凈工作臺紫外消毒20min）菊花嫩莖消毒處理實驗準備實驗操作(初代培養(yǎng),繼代培養(yǎng),生根培養(yǎng)) 觀察并記錄數(shù)據(jù)和現(xiàn)象實驗中可能出現(xiàn)問題的處理實驗室培養(yǎng)的苗移栽到適用田。重點研究問題怎樣避免或減少褐變的機率，怎么樣降低污染率。激素在不同時期對其起到什么作用。光照，溫度對其有什么影響。不同品種的菊花其生長環(huán)境有什么不同。培養(yǎng)因素對菊花組織的影響。6BA和NAA對菊花葉片分離再生的影響等.主要技術指標配置標準的母液，配置培養(yǎng)基，PH及培養(yǎng)基的濃度，滅菌鍋的正確操作，超凈工作臺的操作及無菌操作。誘導培養(yǎng)的成活率，繼代培養(yǎng)的成活率及最終長成小苗的比例。對其生長環(huán)境的掌握程度。其它要說明的問題莖老發(fā)生褐變，真菌污染，操作不當、講話導致細菌污染。滅菌出錯，培養(yǎng)基出現(xiàn)問題（包括滅菌時中途打開滅菌鍋在里面加東西，操作失誤等）。不同的菊花的生長條件不同等。指導老師意見 指導教師簽字： 年 月 日附3：指導教師意見 對論文的簡短評價：1.指出論文存在的問題及錯誤2.對創(chuàng)造性工作評價3.建議成績 優(yōu) 良 中 及格 不及格 指導教師簽字 年 月 日評閱教師意見 對論文的簡短評價：1.指出論文存在的問題及錯誤2.對創(chuàng)造性工作評價3.建議成績 優(yōu) 良 中 及格 不及格 評閱教師簽字 年 月 日吳黎平 : 菊花愈傷組織快繁技術的研究答辯小組評議意見學號姓名 題目 答辯小組意見： 1、對論文的評價2.建議成績等級 優(yōu) 良 中 及格 不及格3.需要說明的問題 答辯小組長簽字 年 月 日菊花嫩莖快繁技術的研究06生物技術及應用（2）班 吳黎平 指導老師：黃小忠摘要：先實驗前的準備工作，然后選取菊花，以帶頂芽的嫩莖為外植體接種到誘導培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)室里培養(yǎng)并觀察，一周后長出叢生芽，再沒有污染的叢生芽在無菌超凈工作臺上用手術刀切成多塊，再將叢生芽接到繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，當發(fā)現(xiàn)初步長出嫩根時，將無污染的帶根的叢生芽接到生根培養(yǎng)基中，當生長成幼苗時將生根試管苗開蓋練苗,移栽。及在培養(yǎng)過程中遇到的問題。關鍵詞：菊花；組織培養(yǎng)；褐變；脫毒；外植體Rapid Propagation of Chrysanthemum tender stem ResearchAbstract: Tests before first the preparatory work, then the selection chrysanthemum, plants the body take the belt terminal bud tender stem as outside to vaccinate in the induction culture medium, places in the raise room to raise and to observe, after a week is long grows thickly the bud, then does not have the pollution to grow thickly the bud to sliver the multi-blocks on the asepsis ultra only work table with the scalpel, then will grow thickly the bud grafting to continue in a generation of culture medium to carry on continues a generation of raise, when discovered when at the beginning of the length of stride will leave the tender root, will not have the pollution the belt root to grow thickly the bud grafting to take root in the culture medium, when will grow the seedling will take root the test tube seedling to uncap practices the seedling, will transplant. And question which meets in the raise process.Keyword：Chrysanthemum; Tissue culture; Turning brown; Escapes the poison; Outside plants the body目 錄1材料和方法811材料與用具812培養(yǎng)條件 913實驗前的準備工作 9131培養(yǎng)基配制 9132接種室的滅菌 9133超凈工作臺及器械消毒 9134材料選取 9135材料滅菌 914接種 1015誘導側芽生長1016 繼代培養(yǎng) 1017誘導生根1018移栽培養(yǎng)102結果與分析102.1初代培養(yǎng) 102.2繼代培養(yǎng) 1123生根誘導及移栽112 4細菌、真菌污染及防治123.討論 12參考文獻 13致謝14菊花又稱“菊”、“秋菊”、“黃花”, 為菊科菊屬的多年生宿根草本植物或半灌木, 是原產于我國的十大傳統(tǒng)名花和世界最主要的切花之一, 主產于浙江、江蘇, 在四川、安徽、河南、山東等省也有栽培。杭菊、亳菊、貢菊、滁菊、祁菊、懷菊、濟菊、黃菊為我國藥用菊花的八大主流商品。菊花株高80120cm 左右, 莖直立, 基部木質化, 上部多分枝, 枝略具棱, 是典型的溫帶短日照植物。在短日照下能提早開花, 喜陽光忌蔭蔽, 較耐旱、忌澇; 喜溫暖濕潤氣候, 但也能耐寒, 嚴冬季節(jié)根莖能在地下越冬, 花能經(jīng)受微霜, 但幼苗生長和分枝孕蕾期需較高的氣溫, 最適生長溫度為20左右。菊花的再生能力強, 采用扦插法繁殖操作簡便, 易于成活, 且沒有季節(jié)限制, 全年均可進行。菊花味甘、性寒,在明代李時珍的本草綱目中載有“利五脈,調四肢,治頭目風熱,腦骨疼痛,養(yǎng)目血,去翳膜,主肝氣不足”的功效1 ， 且具有很強的抗菌作用, 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有很強的抑殺作用，常用于治療心胸煩熱、疔瘡、偏頭痛、冠心病、乳腺炎、扁桃炎等疾病, 可降低血液中的血脂和膽固醇, 預防心臟病的發(fā)生, 并能增強身體的免疫能力。其花中主要含有揮發(fā)油、龍腦、乙酸龍酯、矢車菊甙、綠原酸、維生素、黃酮類物質、微量元素硒等, 具有清除人體中超氧離子自由基及抗衰老、增加機體免疫力的生理活性作用?，F(xiàn)代研究表明, 菊花花瓣中不僅含有多種營養(yǎng)物質, 它還有食用、藥用等多種價值, 有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗HIV 和癌細胞的成分、舒血管、降血壓、降血脂、抗腫瘤等多種藥理作用。菊花的主要繁殖方法有扦插繁殖、分株繁殖、壓條繁殖、嫁接繁殖等,這些方法均存在一定程度的缺點與不足,主要表現(xiàn)為繁殖速度不快、病蟲害發(fā)生頻率高、易受季節(jié)變化 影響等等, 尤其在北方地區(qū)冬季嚴寒,夏秋季為主要綠化季節(jié),冬春季節(jié)為育苗季節(jié),相對來說任務重,成本高。隨著組培技術的發(fā)展,其快速、 高效、 保優(yōu)等都將改變這種不足,因此推動菊花走向組培育苗的道路在北方地區(qū)有著廣闊的前景。利用組織培養(yǎng)技術進行菊花的快速繁殖,則可有效解決上述問題與矛盾,已越來越成為菊花繁殖的重要方法與手段,在菊花種苗生產上加以推廣應用。現(xiàn)在生產上多用扦插和嫁接繁殖,但該方法大面積綠化使用時成苗慢,根據(jù)植物細胞全能性 ,利用組織培養(yǎng)方法，在短時間內將體細胞培養(yǎng)出大量植株 ,在農業(yè)生產中有著非常大的推廣潛力與意義。栽培技術在菊花科研中占據(jù)著重要的地位, 已成為人們研究的重點；其中人們更側重于成分提取與分析研究, 人們已經(jīng)意識到菊花的化學成分、色素研究對開發(fā)其有效成分有重大意義2。1.材料和方法 1.1材料與用具 植物材料：菊花嫩莖。器材與用具：超凈工作臺、 解剖刀、 長柄鑷子、 架臺、無菌濾紙、 酒精燈、火柴、 標簽、棉球、廢液缸、垃圾袋、皮筋、精密pH試紙（5.47.0）、玻璃三角瓶（150ml）、封口膜、培養(yǎng)皿。藥品與試劑：MS培養(yǎng)基母液、激素(生長素 、細胞分裂素等)母液、有機物（瓊脂、蔗糖）、無菌水、0.1 %升汞、 70 %、75%酒精、0.1MNaOH。1.2培養(yǎng)條件 適宜的溫度范圍為24 26，28培養(yǎng)時生長快但增殖倍數(shù)低, 26時增殖倍數(shù)最高,但溫度在27 29時, 玻璃化現(xiàn)象較為嚴重。3 為了減輕試管苗玻璃化現(xiàn)象我們在培養(yǎng)基中添加活性碳，而添加水解酪蛋白則使玻璃苗百分率增加。培養(yǎng)基pH值對玻璃苗發(fā)生也有影響，在 pH 5.87.0范圍內，玻璃苗百分率以pH 6.2時最高，pH 7.0時最低；培養(yǎng)過程中注意通氣以盡可能降低培養(yǎng)容器內的空氣相對濕度和改善氧氣供應狀況，有助于克服玻璃化光周期:以12 16h/ d 為宜。 在愈傷誘導期進行適量的暗培養(yǎng), 有促進愈傷形成的作用。光照強度。范圍為1000 4000lx, 較多選擇1500 2000lx。 4000 5000lx 的光照使試管苗的分化增殖倍數(shù)提高, 但對生根則相反。白色光一般能滿足生長需要。1.3實驗前的準備工作1.3.1培養(yǎng)基配制 表-1 培養(yǎng)基制作配比培養(yǎng)基配比蔗糖瓊脂pH叢生芽誘導MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L3%0.7%5.8繼代培養(yǎng)MS+6-BA3.5mg/L+NAA0.5mg/L3%0.7%5.8生根培養(yǎng)1/2MS+NAA0.2mg/L3%0.7%5.8滅菌條件為0.11MPA，120min。在煮瓊脂時要把握好時間，不宜過長以免糖分受熱分解，導致滅菌好的培養(yǎng)基發(fā)黃。滅菌前要檢查滅菌鍋是否缺水，滅菌時要正確操作，滅菌一定要徹底，中途期間不要打開滅菌鍋。1.3.2接種室的滅菌在實驗的前一天,將接種室用高錳酸鉀和甲醛熏蒸進行滅菌消毒。1.3.3超凈工作臺及器械消毒啟動超凈工作臺,操作之前用 70 %的酒精擦臺面。將操作用刀、 鑷子、 剪子等用具在酒精燈下用火灼燒到變紅,冷卻待用。 1.3.4材料選取 選取在脫毒實驗中成功移栽上盆而且長勢健壯的植株作為實驗材料,選取莖作為實驗材料8。1.3.5材料滅菌 選取生長健壯的嫩莖洗去表面泥土 ,在超凈工作臺 ,用 75 %酒精處理 2030 秒 ,再用無菌水沖洗 35 次 ,轉入 0.1 %升汞溶液浸泡 810 分鐘 ,再用無菌水沖洗 46 次 ,用濾紙吸干水分。1.4.接種在無菌條件下將其切成2厘米左右?guī)в幸秆康男《危描囎訆A取切好的外殖體材料,然后按極性方向直立迅速接種到錐形瓶的培養(yǎng)基中,深約 23 mm,注意培養(yǎng)瓶口始終在火焰下方,盡量使切口接觸培養(yǎng)基，每個錐形瓶可接種 34 塊外殖體。接種時錐形瓶應保持傾斜,接種后要迅速將瓶口在酒精燈上轉動灼燒一遍進行消毒,然后迅速蓋上專用透性膜封好。最后在瓶壁上貼上標簽,注明接種材料的名稱、 編號和接種日期。接種完成后即轉入培養(yǎng)室進行初代培養(yǎng) ,培養(yǎng)溫度2228 ,光強10004000 Lx。1.5誘導側芽生長接種于誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。置于光照培養(yǎng)箱中,每天連續(xù)光照1216h ,光照強度為2 0003 000Lx ,培養(yǎng)溫度(25 1) 。經(jīng)過10d 菊花莖尖顏色逐漸變綠,基部逐漸增大,莖尖也逐漸伸長,一般25d 后,長出叢生芽。1.6 繼代培養(yǎng)將叢生芽切割下,分開接種于繼代培養(yǎng)基之上,一般15d 后可長出叢生芽,取叢生芽轉接于新的培養(yǎng)基繼代上,則可在更短的時間內(約10d) 長出叢生芽,繼代培養(yǎng)的次數(shù)越多,從接種到長出叢生芽所需的時間越短,但不短于7d ,若不及時轉接,芽苗會迅速長高。1.7誘導生根待繼代獲得較多叢生芽后,將叢生芽切成單株,取長約23 cm的芽苗分開接種于生根培養(yǎng)基上,進行誘導生根培養(yǎng),10d 左右就可出現(xiàn)大量小根,最后有16 條根可長得較長,芽苗也迅速長高。待生根后,將生根試管苗開蓋練苗,移栽。1.8移栽培養(yǎng)待根長至12cm時開瓶進行練苗,先將瓶塞打開,讓其由無菌環(huán)境轉至有菌且濕度較低的環(huán)境之中約3d ,將苗取出,小心用流水洗去根表面的培養(yǎng)基殘留物,移栽到素沙中,適當遮蔭,一星期后即可成活,成活率達95 %以上,一個月后即可上盆。2結果與分析21初代培養(yǎng)不同外植體對芽誘導的影響9，外植體誘導成芽時間有差異4。在拿菊花莖尖和菊花葉片接種到初代培養(yǎng)基上在相同的條件下培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)莖尖及莖段最為合適,其他外殖體在此培養(yǎng)基效果不明顯。在培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)有很多都褐變死亡。為了防止褐變我們加入了VC溶液。為了證明VC能抑制褐變我們做了組對比實驗，在1，2組中我們沒加入VC，在3，4組中我們加入了VC，其他條件不變（如表2）。表2 初代培養(yǎng)記錄表：次數(shù)接種量真菌污染細菌污染褐變玻璃化正常成活率160107523660%260128823050%360910203965%460116313965%統(tǒng)計：240423118514460%從表2上我們看到第3，4組的褐變的數(shù)量比第1，2組的褐變數(shù)量少?？梢娫诮臃N前先用100 mg/ L Vc 浸泡外植體1 h ,在其以后的繼代過程中加入 200 mg/ L 聚乙烯吡咯吡烷酮（PVP） ,可有效地控制褐變現(xiàn)象5。當褐變現(xiàn)象不再發(fā)生時,要及時停止添加PVP ,以防長期使用 PVP 對外植體產生毒副作用。22繼代培養(yǎng)表-3 繼代培養(yǎng)記錄表：次數(shù)接種量真菌污染細菌污染褐變玻璃化正常成活率1992130304545%2841527004250%31171833036354%41082433304844%統(tǒng)計：408781236319849%23生根誘導及移栽對大多數(shù)菊花而言加入適量的生長素效果會更好, 從生根的天數(shù)和生根的質量看IBA 較NAA 好 6。表-4 菊花組培中生長素的濃度范圍(單位:mg/L )生長素NAAIBAIAA愈傷誘導和分化0. 01 2-0. 3 3生根0. 1 0. 3 (1/2M S)0. 1 0. 31. 06-BA濃度00. 5 mg/L范圍內,菊花分枝數(shù)隨6-BA濃度增高而增多,但超過這一濃度,菊花分枝數(shù)隨濃度增高而降低,說明菊花分枝數(shù)在一定范圍內與6-BA 濃度呈正相關。當 6-BA 濃度為0. 5mg/L,與其他濃度相比差異極顯著(P 0. 01) 7 。在實驗過程中發(fā)現(xiàn),6-BA/ NAA 比值越大有利于芽分化。結果顯示,試驗所采用的誘導培養(yǎng)基芽分化雖然較少,但分化的芽都屬有效芽。最終篩選出此培養(yǎng)基較佳配方,繼代周期為2530d ,增殖倍數(shù)47 倍。因時間和材料問題本次試驗為能完成生根培養(yǎng)和移栽，但通過查閱資料得知：當繼代培養(yǎng)的叢生芽長至2. 53. 5cm,具23 片葉時,可將其切成單株,轉接到各種生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),一般1 周后有根出現(xiàn)10。在組織培養(yǎng)的過程中,試管苗移栽的成功與否也是一個關鍵的環(huán)節(jié),因為試管苗在試管中不論生長多好,移栽若不成功則導致前功盡棄。在試驗中,當試管苗具有45 片葉,56 條根時即可移栽。24細菌、真菌污染及防治表-5 初代、繼代培養(yǎng)中的污染統(tǒng)計培養(yǎng)類型污染分類總計概率染菌表現(xiàn)初代真菌污染17.5%外植體周圍有白色絨毛狀菌絲，培養(yǎng)基出現(xiàn)綠、白菌斑細菌污染13%培養(yǎng)基表層呈水漬狀污染，外植體周圍滴形云霧狀污染繼代真菌污染19%培養(yǎng)基表層出現(xiàn)黃、白色油滴狀菌斑細菌污染30%培養(yǎng)基表層有粉紅色如水漬狀分布的菌斑在實驗過程中，我們會發(fā)現(xiàn)每次實驗下來總有幾瓶污染的，大多都是真菌和細菌污染。細菌污染主要是我們的操作部規(guī)范，接種時沒有嚴格按照操作制，在接種時說話，或者隨處走動，自身消毒不徹底導致。為了防止當代培養(yǎng)基染菌，我們在培養(yǎng)基中附加50150mg/l氨芐青霉素；為了防止生根培養(yǎng)基的試管苗染菌我們加入50mg/l 硫酸丁胺卡那霉素。3.討論通過本次實驗我們了解到不同的激素組合對不定芽的增殖也有影響。激素水平對愈傷組織再分化關系密切, 隨激素水平的提高外植體的分化率增加,芽的分化系數(shù)也提高 , 但激素濃度過高和生長素與細胞分裂素配比失調, 易導致玻璃化苗的產生。在相同激素水平、相同條件下, 不同菊花品種的生長有很大的差異。由此可見, 對某一品種的菊花進行組培時, 選用什么樣的激素種類和配比, 較難有一個固定的模式, 除了參照前人的經(jīng)驗外, 最好的辦法還是先進行小規(guī)模的試驗, 選出適宜的激素組合再擴大生產。我們在繼代增殖試驗過程中注意到,采用0. 7 %的瓊脂比采用0. 1 %的植物膠效果要好。0.7%瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中濕度稍低。而且在實驗過程中可能會出現(xiàn)培養(yǎng)基不凝固現(xiàn)象，那么我