腫瘤免疫及其免疫檢測瑞金醫(yī)院檢驗科顧志冬.ppt

腫瘤免疫 及其免疫檢測 瑞金醫(yī)院檢驗科 顧志冬,什么是腫瘤？為什么會發(fā)生腫瘤？,腫瘤是正常組織異常增生所形成的贅生物。按其所引起的后果不同可分為惡性和良性兩種。,第一節(jié) 概述,實踐表明，內在的遺傳因素、免疫狀態(tài)和外部的誘變因子，是構成腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎和條件。 其中，機體的免疫狀態(tài)，尤其是細胞免疫功能的強弱，已被視為是否發(fā)生腫瘤的重要內在因素。,腫瘤發(fā)病率和死亡率,WHO：每年腫瘤死亡人數(shù)為630萬，至2020年， 全世界腫瘤患者將達1500萬。 我國：惡性腫瘤死亡率為108.39/10萬，占死亡 人數(shù)17.94%，居死亡原因第二位。 腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療可明顯提高患者生 存率。,最普遍的惡性腫瘤死亡原因,臨床：病史、體癥,物理檢查：X光、CT、磁共振、B超、紅外、 核醫(yī)學,術前：穿刺、刮片、拉網 術后：組織切片,免疫：腫瘤抗原和代謝物測定,分子生物：腫瘤相關基因分析,腫 瘤 診 斷,輔助,病理,正常 間變 惡性 可見前期 不可見前期,物質分析,影像診斷,腫瘤的發(fā)展及診斷期,腫瘤的免疫逃避機制？,腫瘤細胞缺乏有效的抗原性表位，難以觸發(fā)足夠的抗腫瘤免疫效應。 腫瘤細胞的MHC分子表達發(fā)生改變，異常表達的MHC分子，有礙機體免疫細胞對腫瘤細胞的識別，影響抗原遞呈作用。 不能正常表達B7等活化免疫細胞的共刺激分子和黏附分子。 患者血清中存在著封閉因子。 腫瘤細胞產生的某些細胞因子對T細胞的產生有抑制作用。 腫瘤細胞表達FasL，和活化CTL的Fas結合，介導CTL凋亡。,第一節(jié) 概述,體液免疫效應,激活補體的溶細胞作用 介導殺傷細胞的細胞毒作用 調理吞噬作用 干擾腫瘤細胞的生物學行為 其他作用,第二節(jié) 機體的抗腫瘤免疫效應機制,細胞免疫效應,T細胞 生物學效應包括T細胞的直接殺傷和對免疫系統(tǒng)其它成分的活化。 （1）CD4陽性的輔助T細胞 （2）CD8陽性的細胞毒T細胞,第二節(jié) 機體的抗腫瘤免疫效應機制,CD4陽性的輔助T細胞 在胸腺中分為Th1和Th2，其中和腫瘤免疫關系密切的是Th1細 胞。 激活：腫瘤細胞抗原+抗原遞呈細胞（樹突狀細胞）+MHC II類分子形成復合物，被CD4陽性的T細胞的TCR識別并使自身活化。 效應：通過釋放細胞因子（TNF，IFN-）發(fā)揮抗腫瘤作用。 Th表面的CD154分子和APC表面的CD40分子結合，釋放IL-12。促進CTL分化和增殖。 Th和APC釋放共刺激信號分子，協(xié)助CTL的分化和增殖。 可增強B細胞活化引起的抗體應答及CD8陽性CTL的細胞毒 其亞群可分泌因子促進體液免疫應答。,第二節(jié) 機體的抗腫瘤免疫效應機制,CD8陽性的細胞毒T細胞 是腫瘤免疫的主要途徑。 通過釋放毒性物質或促發(fā)靶細胞上的死亡受體，而直接溶解靶細胞，或通過分泌IFN- 間接殺傷腫瘤細胞，在機體發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用。,第二節(jié) 機體的抗腫瘤免疫效應機制,細胞免疫效應,NK細胞 NK細胞是宿主固有免疫或一線防御機制的一部分，非MHC限制性，她們不需要對宿主或其免疫功能進行調整適應。對腫瘤細胞和病毒感染細胞比對大多數(shù)正常細胞更具有毒性作用。其作用機制類似于CTL，還可分泌大量的細胞因子以調節(jié)機體免疫反應。 新發(fā)現(xiàn)的NKT細胞在胸腺外發(fā)育，其發(fā)育依賴于TCR與類MHC I類分子CD1的相互作用，經TCR觸發(fā)，主要介導NK類細胞毒活性。,第二節(jié) 機體的抗腫瘤免疫效應機制,細胞免疫效應,巨噬細胞 活化的巨噬細胞與腫瘤細胞的結合可觸發(fā)細胞毒活性，細胞毒性介質有細胞溶解蛋白酶、TNF-及其相關的因子、IFN- 和IFN-、IL-1，氧化反應的中介物如過氧化氫，氮化反應的中介物如NO、精氨酸酶等也可能屬于此列。 它是參與抗腫瘤、抗感染的主要效應細胞。,第二節(jié) 機體的抗腫瘤免疫效應機制,細胞免疫效應,樹突狀細胞 是一類專職抗原遞呈細胞，輔佐T、B細胞參與特異性殺傷腫瘤的過程。 可利用制備腫瘤特異性樹突狀細胞以進行腫瘤的生物療法。,第二節(jié) 機體的抗腫瘤免疫效應機制,腫瘤抗原是細胞癌變過程中所表達的新生物或過量表達產物，它的產生與下列因素有關： 細胞發(fā)生轉化而產生新的蛋白 點突變或基因重組致細胞內癌基因活化，促使表型 改變 隨機病變而產生新的蛋白 胚胎抗原的過度表達或分化抗原的異常表達。,第三節(jié) 腫瘤抗原的分類,腫瘤特異性抗原 為腫瘤細胞所特有，只表達于腫瘤細胞，而不存在于任何處于不同發(fā)育階段的正常細胞。 1.化學物質誘發(fā) 其抗原的顯著特征是高度個體化，即高度的個體特異性。不同腫瘤，甚至同一化學致癌物誘導的腫瘤，所表達的腫瘤抗原可有不同，而不同化學物質引起的腫瘤，其抗原的差異性更大。,第三節(jié) 腫瘤抗原的分類,腫瘤特異性抗原 2.病毒誘發(fā) 無嚴格的特異性，通常由同一種病毒誘發(fā)的所有腫瘤，都具有相同的TSA。血清學試驗和腫瘤特異性CTL的檢測，均有助于抗原的檢定。其可誘導機體的免疫應答，故又被稱為腫瘤特異性移植抗原。其成分多系病毒基因的表達成分。,第三節(jié) 腫瘤抗原的分類,腫瘤特異性抗原 3.自發(fā) 自發(fā)腫瘤系無明顯誘因的腫瘤，很難檢測到特異性的抗原標志物，其原因可能有： 早期腫瘤細胞及近親本子代細胞一定時間內可以表達，但后代細胞因為染色體的隨機突變而失去表達。 可能存在，但單獨使用抗原抗體方法難以得到確定答案。,第三節(jié) 腫瘤抗原的分類,腫瘤相關抗原 指非腫瘤細胞所特有的抗原成分，也少量存在于正常細胞，但在腫瘤發(fā)生的機體可異常表達，可分為胚胎性抗原和分化抗原兩種類型。 胚胎抗原 分化抗原,第三節(jié) 腫瘤抗原的分類,第四節(jié) 常見腫瘤的免疫診斷及應用原則,一、腫瘤標志物的檢測及臨床意義,腫瘤標志物,是顯示腫瘤存在的生物化學指示物 與腫瘤相伴產生 抗原或激素或酶蛋白 存在于血液、體液及組織中 可定量或定性檢測到 可以作為辨認和追蹤腫瘤存在和發(fā)展的標志,腫瘤標志物研究歷史,1845 Bence-Jones 本周蛋白 1930 Zondek HCG 1959 Markert 同工酶 1963 Abelev AFP 1965 Gold & Freeman CEA 1969 Hubner & Todaro 癌基因 1975 Kohler & Milstein 單克隆抗體 1978 Herberman 提出腫瘤標志物概念 1979 英國第7屆腫瘤發(fā)生生物學和醫(yī)學會議 腫瘤標志物被確認并應用臨床 1980 Koprowski CA19-9 1981 Bast et al CA125 1981 Colcher et al CA72-4 1984 Kufe et al CA15-3 .,已建立的腫瘤標志物,腫瘤標志物的分類,細胞腫瘤標志物：位于細胞中的物質或抗原，如激素受體、白血病表型。 體液腫瘤標志物：病理情況下，濃度增加時可在血液、尿液或其他體液中測得的物質，如AFP、CA19-9、 CEA、 CA15-3等。 腫瘤表型標志物：酶、胚胎性抗原、異位性蛋白、激素等。出現(xiàn)于癌細胞轉化和臨床進展階段。 腫瘤基因標志物：基因突變、基因表達異常等，出現(xiàn)于癌前起動階段。,在各種肝病中AFP的變化,AFP在各類肝病中的陽性率,AFP陽性后查找肝癌,腫瘤直徑 五年生存率 5 cm 31.25% 10cm 3.7%,癌胚抗原,一. 正常值 (直接法 ng/mL),胸，腹水 10ng/mL,二. 病理值 (直接法 ng/mL),一) 病種： 陽性檢出率 (Ca) 1. 胰、膽 腸、胃 泌尿、乳房 6080% 5060% 2030%,胰、膽、腸、胃、肺炎癥等良性病變一般不 25 ng/mL,癌胚抗原,二. 病理值 (直接法 ng/mL),2. 胸腹水陽性率高于血液 3. AFP，CEA聯(lián)合檢測鑒別原發(fā)/繼發(fā)肝癌,總PSA和游離PSA,PSA的兩種主要形式,游離PSA,結合PSA (PSA-ACT) -1-antichymotrypsin,抗原結合部位,PSA,PSA,ACT,PSA的檢測,PSA66MAb,PSA10 MAb,35%,30%,25%,20%,15%,10%,5%,0%,良性疾病的可能性增加,前列腺癌的可能性增加,FREE PSA % 結果解釋,前 列 腺 癌 的 可 能 性 %,CI* Confidence Interval,糖類抗原12-5（CA125） 是卵巢癌和子宮內膜癌的腫瘤標志物 分子量為20萬的糖蛋白 可被單克隆抗體OC125所識別 在卵巢腫瘤上皮和Mullerian副腎管來 源的病理和正常組織中表達，其生物 學功能不明。,糖類抗原12-5（CA125）,正常人血清中CA125的臨界值為35U/ml CA125的半衰期僅4.8天，在血中很快代謝，所測即時結果能反映腫瘤近期的變化狀態(tài),CA125在卵巢癌，尤其是上皮性卵巢 癌、子宮內膜癌可出現(xiàn)升高，還可在 肺癌、宮頸癌等腫瘤狀態(tài)時升高。 CA125在子宮內膜異位癥、1%的健 康婦女、3%的患良性卵巢疾病婦女 及其他非腫瘤患者也可見到升高。,CA125的臨床應用,卵巢癌的輔助診斷 觀察病情及預測預后 -血清CA125升高（或降低）2倍的患者 中大于80%的病例為病情進展（或消退） -CA12535U/ml的病人中有95%在第二次 手術時仍有腫瘤存在,早期復發(fā)的監(jiān)測 75%的患者在腫瘤復發(fā)前一年左右時間CA125的水平就已升高,CA125的臨床應用,CA125升高：90%的卵巢癌和期 50%的期和90%的期 CA125升高水平與腫瘤大小和分期有關 CA125可以區(qū)別可觸及的良性或惡性實體瘤,CA125的臨床應用,卵巢癌和良性卵巢疾病的鑒別診斷 連續(xù)測定CA125 聯(lián)合檢測CA199可提高準確性，敏感性可從83.3%提高到91.6% 卵巢上皮性癌患者CA125明顯高于對照組，敏感性可達82%到93.5% 8%的良性患者CA125大于65U/ml，而惡性患者占75%,CA125的臨床意義,術后 CA125 的升高是癌腫復發(fā)的重要標志， 當CA125大于65U/ml時則不需作第二次手術探查,CA125的臨床應用,糖類抗原19-9（CA199） CA19-9是胰腺、胃和腸癌的標記物。 正常人群血清CA19-9陽性的臨界值為 37U/ml,癌組織中的濃度要高于正常組織或 炎性組織；是胰腺癌診斷較好的指 標，還可用于胃腸癌的檢測和篩選。 伴有黃疸的良性疾病患者也可出現(xiàn) CA19-9升高，但一般不120/ml， 經臨床處理后可恢復到正常值范圍。,CA19-9的臨床應用,診斷 -可以作為胰腺和膽管癌較好的標志物用于臨床，胰腺癌的陽性率可達70%92%，膽管癌為66.7% -對胃癌、肝癌和結直腸癌的陽性率分別可達25%60%、56%60%，18%58%,療效監(jiān)測 治療中及術后含量下降乃至正常表示治療方案正確 復發(fā)跟蹤 升高可作為腫瘤復發(fā)轉移的亞臨床診斷或重要的輔助診斷指標,CA19-9水平在胰腺癌診斷中反應參數(shù)的比較,神經原特異性烯醇化酶（NSE）,同功酶類腫瘤標志物，正常僅存于神 經組織和紅細胞中 正常人血清值為 13g/L 小細胞肺癌、神經母細胞瘤和神經內 分泌腫瘤及腦損傷時升高 待測標本絕對禁止溶血，溶血可出現(xiàn) NSE血清水平升高,NSE的臨床意義,NSE在小細胞肺癌中的陽性率明顯高于對照組，NSE可作為小細胞肺癌的高特異、高靈敏的腫瘤標志物,跟蹤監(jiān)測癌腫病情進展和療效判斷 -肺癌 NSE高于11.8 g/L預示肺癌患者生存 期較短 化療24小時后 NSE下降是治療效果良 好的標志,其他癌癥 癌癥復發(fā)的早期標志，尤其是存在胸腔、肝、骨骼、腦、脊髓轉移 NSE升高的癌癥患者5年存活率僅為5%12%,NSE的臨床應用,腫瘤標志物對分型的比較,陽性率,Ebert, W., et al. Anticancer Research, 1996,16:2161-2168,人絨毛膜促性腺激素（HCG）,糖蛋白類激素，由蛋白核心與位于 羧基端的以唾液酸為終止的側鏈組成 兩個亞基組成: & : 與 - LH, TSH 和 FSH相同 :與-LH有交叉 由合胞體滋養(yǎng)層細胞產生 被證實是一種原始物質 (可作為一種有用的腫瘤標志物),hCG Epitopes,Intact hCG,Free ,Free ,Free -hCG Assay,Catching Antibody,Detecting Antibody,HCG,臨床應用： HCG上升：幾乎所有絨毛膜上皮細胞 癌、70%的非精原細胞性睪丸癌，胃 腸道、肺、 乳腺腫瘤時亦可見 HCG水平與腫瘤大小、疾病預后有關 腦脊液中HCG上升提示腫瘤有腦轉移 可用于監(jiān)測治療,第四節(jié) 常見腫瘤的免疫診斷及應用原則,二、常見腫瘤標志物檢測的免疫方法,標記免疫方法,HAPATITIS,CANCER,FERTILITY,PROTEINS,TDMs/DRUGS,TYROID, ANEMIA,HBV HCV,M 107,10,10-15,10-4 g/L,AFP FER CEA CA199,PRL HCG LH FSH GH Myoglobin,RHF IgG C3 ASO CER TRF AAG,QUI GEN AMI PHY,FT3 FT4 Dig T3 T4 TSH Prog,Immunoassay Analyte Map,待測物質濃度與檢測手段,臨床化學分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,第四節(jié) 常見腫瘤的免疫診斷及應用原則,三、腫瘤標志物的應用價值,腫瘤標志物的應用價值,普查 定位 輔助診斷 分期 療效監(jiān)測 預后 預測,普查,一般不適宜對無癥狀人群進行普查 CEA查結腸癌 普查 在消化病房使用,發(fā)病率 370/10萬 10000/10萬 靈敏度 95% 95% 特異性 70% 70% 真陽性數(shù) 370*95%=351.5 10000*95%=9500 假陰性數(shù) 370-351.5=18.5 10000-9500=500 真陰性數(shù) 99648.5*70%=69753.95 90000*70%=63000 假陽性數(shù) 99648.5-69753.95=29894.55 90000-63000=27000 陽性預示值 0.15% 26.03% 陰性預示值 99.97% 99.22%,腫瘤標志物普查五項原則,應十分清楚該腫瘤的發(fā)病率 該腫瘤標志物應能檢測早期腫瘤 該腫瘤的早期治療比晚期治療更經濟有效 測定方法的靈敏度、特異性和重復性良好 普查所需費用能被接受,定 位,腫瘤標志物基本上不能對腫瘤定位。 極少數(shù)腫瘤標志物如PSA，PAP，甲狀腺球蛋白具器官特異性，但不具腫瘤特異性。,確 診,通常不能進行確診。 因為腫瘤標志物無足夠的靈敏度，不能 排除假陰性結果。 本周蛋白(多發(fā)性骨髓瘤）、AFP（肝 癌）、-HCG（絨毛膜癌）和降鈣素 （甲狀腺C-細胞癌）等有助確診。,分 期,大多數(shù)腫瘤標志物與疾病分期有關，且濃度與腫瘤大小通常存在關聯(lián)。 但并不能根據(jù)個體測得值來判斷腫瘤大小， 也不能以腫瘤標志物濃度精確指示各期腫 瘤，因為各期腫瘤的腫瘤標志物濃度范圍 極廣，且互相重疊。,腫瘤標志物評價治療有效性方案(Beastall,1991),無效：濃度與治療前相比下降50% 有效：濃度與治療前相比下降90%,預 后,術前濃度增高，術后降低，表示這些腫瘤標志物對此腫瘤有預后價值。 在病程監(jiān)測過程中，腫瘤標志物的濃度增高或降低與疾病的預后密切相關。,術后腫瘤標志物水平的變化,73,腫瘤標志物水平,跟 蹤 復 發(fā),預 測,利用ROC曲線進行 PPV：陽性時患腫瘤的可能性 NPV：陰性時不患腫瘤的可能性 PPV和NPV與靈敏度、特異性和患病率有關 腫瘤標志物的靈敏度、特異性、PPV、NPV 不是固定不變的，而是依賴于選定的臨界值。,腫瘤標志物的臨床應用,1. 預后：病員分群 ( - )非保護人群 ( + )保護人群-預后好、壞,2. 療效觀察：外科：手術切除/殘留/姑息 保守：藥效、放療效果 3. 隨訪： 術后6周 三年 五年 七年 4. 良/惡鑒別：輔助指標,標志物,三月一次,半年一次,一年一次,腫瘤標志物的應用原則,1. 有關標志物聯(lián)合檢測 - 提高靈敏度 2. 陽性標志物動態(tài)觀察 - 提高準確性 不應以單項、單次檢測下診斷,腫瘤標志物的其它幾個問題,正常參考范圍的界定 方法學不同而導致的結果的不統(tǒng)一,腫瘤標志物的正常參考范圍,目前通常以正常人群的95%的可信區(qū)間為正常參考范圍，對于腫瘤標志物，由于雙側通常是無意義的，因此一般取右單側 95%為正常參考范圍。即有5%的正常人在檢測時其值會超過正常參考范圍，引起臨床的假陽性結果。,正常參考范圍的建立 正常人群的平均值2SD,2.5,97.5,腫瘤標志物的正常參考范圍,研究表明，正常參考范圍對于腫瘤標志物來講是毫無意義的，我們希望通過檢測值來了解： （1）陽性結果提示該病人罹患腫瘤的概率 （2）陰性結果提示該病人不罹患腫瘤的概率,最后通過概率的大小來指導臨床應該 進行的檢查和處理措施，因此應用ROC曲 線（receiver operator characteristic curve)來 確定最佳界定值（cutoff value）。,臨 界 值 的 確定,根據(jù)金標準確定病人和對照兩組例數(shù)相似的人群，并測出各組的實驗數(shù)據(jù)。 用該實驗數(shù)據(jù)的不同域值區(qū)分陽性和陰性的不同分界點，分別計算靈敏度和特異性。