ELK1 結(jié)合位點突變的 EGR1 啟動子報告載【推薦論文】 .doc

精品論文elk1 結(jié)合位點突變的 egr1 啟動子報告載體的構(gòu)建和鑒定熊毅1,2,3，張惠華1,2,3，吳國藝1,2,3，董濠鋆1,2,3，陳小佳1,2,35（1. 基因工程藥物國家工程研究中心；2. 廣東省生物工程藥物重點實驗室；3. 暨南大學(xué)細胞生物學(xué)系/生物醫(yī)藥研究院，廣州 510632 ）10摘要：egr1 一個普遍存在于哺乳動物細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和分 化發(fā)育的功能。本文采用重疊 pcr 法成功構(gòu)建 egr1 啟動子片段中 elk1 結(jié)合位點突變的 載體，利用熒光表達系統(tǒng)對重組載體活性進行分析。以已構(gòu)建的人 egr1 啟動子載體為模板， 在引物上引入突變堿基，重疊 pcr 擴增獲得突變啟動子序列，經(jīng)過 t 載體亞克隆入 pgl3-basic 熒光表達載體，獲得重組突變載體 pgl3-egr1mt，以 prl-tk 為內(nèi)對照載體，15共轉(zhuǎn)染 293 細胞，分別檢測報告載體的熒光素酶活性；結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了重組突變載體的細 胞的熒光素酶活性明顯比未突變組低。本實驗獲得的重組突變載體為進一步研究 egr1 對下游信號通路的影響奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；egr1 啟動子；重疊 pcr；點突變；熒光素酶報告系統(tǒng)中圖分類號：q78; q29120reconstruction and identification of egr1 promoter report vector with elk1 binding site mutationxiong yi1,2,3, zhang huihua1,2,3, wu guoyi1,2,3, dong haojun1,2,3, chen xiaojia1,2,325(1. national engineering research center of genetic medicine;2. guangdong provincial key laboratory of bioengineering medicine;3. cell biology department & institute of biomedicine of jinan university, guangzhou 510632, china)abstract: the early growth response 1 (egr1) is a nuclear transcription factor which regulates30cell proliferation, differentiation and apoptosis. to further explore its function, a recombinant luciferase reporter vector of egr1 promoter with elk1 binding site mutation was constructed. by using overlap pcr assay, the egr1 promoter sequence with elk1 binding site mutation was obtained. then, the targeted sequence was subcloned into pgl3-basic vestor to be named of pgl3-egr1mt. co-transfected with prl-tk vector as internal control reporter, luciferase35activities expressed in 293a cells transfected with pgl3-egr1mt and pgl3-egr1 had been compared. the results showed that a decrease in cell transfected with pgl3-egr1mt. in conclusion, a mutated egr1 promoter with lower luciferase activity was successfully gained forfuther investigation.key words: molecular biology; egr1 promoter; overlap pcr; site mutation; luciferase reporter40system0引言erg1(early growth response 1)屬于即刻早期基因家族中的一員1 ，位于人類染色體5q31，由 533 個氨基酸組成的分子量為 75kd 的蛋白質(zhì) 2。egr1 作為一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子，基金項目：廣州市科技計劃項目基金（2010j-e261）作者簡介：熊毅（1988-），男，碩士，分子與細胞生物學(xué)通信聯(lián)系人：陳小佳（1973-），女，助理研究員，分子與細胞生物學(xué). e-mail: - 7 -45它含有一個高度保守的 dna 結(jié)合域，能與富含 gc 序列 gcgc(g/t)gggcg 3結(jié)合，調(diào)控基因的 表達。egr1 啟動子上同時存在多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括血清反應(yīng)元件 sres、ap-1 結(jié)合位點、camp 調(diào)控元件 cres 和 sp1 結(jié)合位點等 4。egr1 在不同細胞類型或外因刺激下，可結(jié) 合到目的基因啟動子上的富含 gc 的順式作用元件起到轉(zhuǎn)錄激活作用，促進細胞的分化、生長、生長抑制和凋亡5。50elk1（ets-like protein 1）為真核細胞轉(zhuǎn)錄因子ets家族中的重要成員，早在1989年rao 等研究發(fā)現(xiàn)了兩個新ets致癌基因，并將其命名為elk1和elk26。elk1活性受磷酸化與去磷 酸化影響，其表達與上游mapk信號通路有關(guān)，包括erk1/2、p38及jnk信號通路的激活7，磷 酸化elk1通過與dna直接結(jié)合而起到轉(zhuǎn)錄激活作用8。研究顯示轉(zhuǎn)錄因子elk-1 的磷酸化 可能是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)及細胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控通路9。通過ucsc基因組數(shù)據(jù)庫55（ucsc genome browse database）軟件分析，在已獲得的egr1啟動子（-669+157）中含有3個elk1結(jié)合位點, 并有研究指出，elk1 c-末端的的磷酸化可改變其蛋白構(gòu)象，有利于與egr1啟動子的結(jié)合，介導(dǎo)后者的表達上調(diào)10。本文旨在通過將 egr1 啟動子中-401bp 處 elk1 結(jié)合位點（cccgccggaacaac）突變，構(gòu) 建啟動子突變的 pgl3-basic 熒光表達載體，通過啟動子熒光素酶活性檢測，探討 elk1 與60egr1 的表達調(diào)控關(guān)系，并為 egr1 在癌癥治療方面的機制和功能的研究打下實驗基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑65大腸桿菌 dh5 、293a 細胞為本實驗室保存。pgl3-basic 載體、prl-tk 載體、內(nèi)切 酶 xho、hind 、pmd18-t 載體均購至 takara 公司，kod-neo-plus 高保真酶、ligationhigh購至 toyobo 公司， 2xla taq mix 、 dna marker 購至 廣 州 東 盛 生 物 公 司 ， lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑購至 invitrogen，雙熒光素酶報告系統(tǒng)購至 promega 公司，質(zhì)粒 提取試劑盒、膠回收試劑盒購至 omega 公司。701.1.2引物設(shè)計與合成參考 ucsc 收錄的 egr1 啟動子序列，利用文獻報道和軟件預(yù)測出 elk1 結(jié)合位點（cccgccggaacaac），使用 primer primer 5.0 設(shè)計重疊 pcr 特異性引物。上游引物：5-a tcgctcgaggggccctggatgacagcgat- 3（含有 xho酶切位點，劃線部分），上 游重疊引物：5- aataagggttgtgaaggcgagggatccttcc - 3，擴增長度為 264bp；75下游重疊引物：5- ggaaggatccctcgccttcacaacccttatt -3，下游引物：5-acccaagcttaacactgagaa gcgtgcaggc- 3（含有 hind 酶切位點，劃線部 分），擴增長度為 641bp，總長度為 846bp。1.2方法1.2.1pcr 擴增80模板為已構(gòu)建好的轉(zhuǎn)載在 pgl3-basic 上的 egr1 啟動子序列（-669+157）pgl3-egr1， 由本研究小組構(gòu)建。pcr 反應(yīng)分為兩步，第一步體系 25 l，模板 1 l，10xbuffer 2.5 l，mgso41.5 l，dntp 2.5 l，kod-neo-plus 0.5 l，上游引物（下游引物）/上游重疊引物（下游重疊引物）分別為 0.75 l，3dh2o 15.5 l。9630s，5930s，7240s，32 循環(huán)。 擴增產(chǎn)物純化后，進行第二步。體系 10 l，上、下游純化產(chǎn)物各 0.5 l，2xtaq mix5 l，854 l 3dh2o。9630s，5130s，7260s，12 循環(huán)。反應(yīng)完成后，各補加 2xtaq mix5 l，1 l 3dh2o，上游引物和下游引物各 2 l。9630s，53.530s，7260s，32 循環(huán)。1.2.2重組表達載體的構(gòu)建pcr 擴增產(chǎn)物經(jīng)純化，根據(jù) a-t 克隆法，直接跟 t 載體進行連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受 態(tài) e.coli dh5 ,在 lb 培養(yǎng)基上選擇淺色（接近無色）菌落，液體培養(yǎng)，抽提重組質(zhì)粒，酶90切、pcr 驗證插入片段的大小，測序。序列正確的重組子抽提質(zhì)粒，亞克隆到 pgl3-basic上，酶切、pcr 鑒定，獲得 pgl3-egr1mt。1.2.3脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 293a 細胞對數(shù)生長期的 293a 細胞計數(shù)后，按 1106 細胞/孔，種于 24 孔板內(nèi)，待細胞融合度 為 60%時，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。按 4g dna，5l lipofectaminetm 2000 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細胞，以共95轉(zhuǎn)染 pgl3-egr1、prl-tk 和 pgl3-egr1mt、prl-tk 為實驗組，轉(zhuǎn)染 pgl3、prl-tk 為 對照組，48h 后，收集細胞。1.2.4雙熒光素酶報告實驗每孔細胞加入 150 l 的 plb，室溫輕微振搖 30min，收集細胞裂解液于干凈的 ep 管 中；在白色不透光的 96 孔板中加入 50 l 的 lar；將細胞裂解液 12，000g 離心 1min，100取上清 25 l 加入孔中并吹打均勻；用閱讀儀測量可見光強度 10（s此時所讀的光為 pgl 載體上轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的螢火蟲熒光素酶所發(fā)出的）；繼續(xù)在孔中加入 50 l stop and glo reagent，吹打均勻；用閱讀儀測量可見光強度 10s（此時所讀的光為內(nèi)參 prl-tk 載體上 轉(zhuǎn)錄翻譯出的海腎熒光素酶所發(fā)出的）；將所得到的數(shù)據(jù)，標(biāo)準化后進行分析。1052結(jié)果1102.1egr1 啟動子突變序列的獲得對帶有突變堿基的引物進行重疊 pcr，以原有的啟動子片段為模板，得出分別為 305bp 和 596bp 的擴增片段；將得到的擴增片段作為模板進行重疊 pcr，獲得全長為 846bp 的含有 突變堿基的啟動子片段（圖 1a），將所獲得 egr1 啟動子突變序列與原始 egr1 啟動子序列 同時進行測序，測序結(jié)果比對分析（圖 1b、c），成功獲得 elk1 結(jié)合位點突變 egr1 全長啟 動子序列。圖 1 突變 egr1 啟動子序列的獲得和測序鑒定115120125130a.突變 egr1 啟動子 pcr 結(jié)果, b.原始序列測序, c.突變后序列測序圖m: 100bp dna 標(biāo)準; 1: 596 bp 片段; 2: 305 bp 片段; 3: 846bp 全長突變片段.fig.1 pcr and sequencing result of mutant egr1 promotera. pcr screening for mutant fragment, b. origin sequence before mutant, c. sequencing for mutant fragmentm: 100bp ladder dna marker; 1: 596 bp fragment; 2: 305 bp fragment; 3: 846bp total mutant fragment.2.2pgl3-egr1mt 重組載體的構(gòu)建采用 a-t 克隆法，先把回收純化后的目的片段連接到 pmd18-t 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 dh5 ，挑取單菌落，xho、hind 雙酶切及菌落 pcr 對所得陽性克隆進行鑒定，結(jié)果表明， 目的片段成功轉(zhuǎn)入 pmd18-t 載體（圖 2a）。對構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pmd18-t-egr1mt 與表達載體 pgl3-basic 均使用 xho、hind 雙 酶切，酶切產(chǎn)物回收后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽性克隆，菌落 pcr 鑒定，并使用限制性內(nèi)切酶 xho、hind 雙酶切進行驗證（圖 2b），成功獲得重組表達載體，并命名為pgl3-egr1mt。pgl3-egr1mt 重組載體多克隆位點下游含有螢火蟲熒光素酶編碼區(qū)域，熒光 素酶表達量的高低直接反映啟動子活性(圖 2c)。圖 2 pgl3-egr1mt 重組表達載體的構(gòu)建a. pmd18-t-egr1mt 重組 t 載體的構(gòu)建, b. pgl3-egr1mt 載體的構(gòu)建, c. pgl3-basic 載體圖譜m1: ds5000 dna 標(biāo)準; m2: hind dna 標(biāo)準; m3: ds2000 dna 標(biāo)準; 1:pmd18-t-egr1mt; 2、3:pmd18-t-egr1mt 雙酶切、pcr 結(jié)果; 4: pgl3-basic; 6: pgl3-egr1mt; 5、7: pgl3、pgl3-egr1mt 雙酶切;8: pgl3-egr1mt pcr135140fig.2 construction of recombinant pgl3-egr1mta. construction of pmd18-t-egr1mt, b. construction of pmd18-t-egr1mt, c. map of pgl3-basic vectorm1: ds5000 dna marker; m2: hind dna marker; m3: ds2000 dna marker; 1:pmd18-t-egr1mt; 2、3: pmd18-t-egr1mt digested with xhoand hind and pcr result; 4:pgl3-basic; 6: pgl3-egr1mt; 5、7: pgl3 and pgl3-egr1mt digested with xhoand hind ; 8: pcrof pgl3-egr1mt1451501551602.3突變啟動子活性檢測以帶有綠色熒光蛋白 pegfp-n1 載體轉(zhuǎn)染 293a 細胞。摸索細胞最佳轉(zhuǎn)染效率。 實驗設(shè) 計 3 個濃度梯度，分別是 pegfp-n1：lipo2000( g: ml)=4:10；4:5；2:5，轉(zhuǎn)染 24h 后， 倒置熒光顯微鏡（ix71, olympus co.）觀察拍照。結(jié)果表明（圖 3），質(zhì)粒與 lipo2000 最 佳轉(zhuǎn)染效率為 4:5。pgl3-basic 載體含有熒光素酶報告基因，可用來檢測基因啟動子活性。用 4ug 質(zhì)粒作 轉(zhuǎn)染，pgl3-basic 和 prl-tk 比例為 50:1。轉(zhuǎn)染 pgl3-basic 和 prl-tk 為對照組，將 pgl3-egr1 和 pgl3-egr1mt 分別與內(nèi)對照載體 prl-tk 共轉(zhuǎn)染 293a 細胞。48h 后收集樣品對 egr1 啟動 子活性檢測。egr1 啟動子上 elk1 結(jié)合位點經(jīng)突變后，其啟動子活性比原始啟動子序列啟動 子活性顯著降低, p0.05（圖 4）。圖 3 pegfp-n1 轉(zhuǎn)染 293a 細胞的熒光檢測a. pegfp-n1: lipo2000 ( g: ml) = 2: 5, b. pegfp-n1: lipo2000 ( g: ml) = 4: 5, c. pegfp-n1: lipo2000 ( g: ml) = 4: 10fig.3 fluorescent detection of 293a cells transfected with pegfp-n1a. pegfp-n1: lipo2000 (g: ml) = 2: 5, b. pegfp-n1: lipo2000 (g: ml) = 4: 5, c. pegfp-n1: lipo2000 (g: ml)= 4: 10165170175180185圖 4 突變啟動子活性檢測(“*”表示 p0.05)fig.4 dual luciferase activity assay of mutant promoter (“*” represents p0.05)3討論與結(jié)論egr1 最早是作為調(diào)控細胞生長和增殖的因子被發(fā)現(xiàn)11，egr1 可促進細胞從 g0/g1 期 進入 g2/m 期12。高表達 egr1 能穩(wěn)定染色體和抑制增殖，也可以促進分化和細胞凋亡；并 能直接調(diào)控一系列的腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子及其受體等的表達，形成下游信號 網(wǎng)絡(luò)決定細胞命運13。研究表明在結(jié)腸癌14、黑色素瘤15、乳腺癌16、前列腺癌17等多 種疾病中 egr1 都扮演著重要角色，具有促進腫瘤發(fā)展的作用，預(yù)示 egr1 可作為腫瘤基因治 療中重要的分子靶點。elk1是轉(zhuǎn)錄因子ets家族、三元復(fù)合因子（tcf）亞族的一員。elk1通過與elk4/sap-1 和elk3/sap-2/net結(jié)合形成三元復(fù)合物，發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用18。通過啟動子結(jié)合位 點的軟件的分析，egr1（-669+157）啟動子區(qū)含有三個elk1的結(jié)合位點，提示elk1作為轉(zhuǎn) 錄因子，對egr1的表達可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。體外實驗研究證實，磷酸化的elk1可與 egr1啟動子結(jié)合，直接介導(dǎo)egr1的表達19-20。重疊延伸 pcr 在基因的定點突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除以 及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應(yīng)用21。通過采用具有互補末端的引物，使 pcr 產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重 疊拼接起來.此技術(shù)利用 pcr 技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化 和連接酶處理，利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。本實驗中所采用的雙熒光素酶報告系統(tǒng)常用于實驗系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測 22，通常一個報告基因作為內(nèi)對照，使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時雙 報告基因通常用來瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞，帶有實驗報告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報告基因 作為對照的第二個載體。通常實驗報告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子，研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生 理基礎(chǔ)。報告基因表達活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成190195200205210215220225230235240型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試不被實驗條件變化所干擾。通過這種方法，可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實驗準確性。本 研 究 利 用 重 疊 pcr 技術(shù)，對 egr1 啟 動 子 原 序 列 上 的 elk1 結(jié)合位點 （cccgccggaacaac）進行定點突變，并將突變后的 egr1 啟動子序列轉(zhuǎn)入表達載體 pgl3-basic，通過雙熒光素酶實驗證明 elk1 結(jié)合位點突變后基因啟動子活性明顯下降，表 明 elk1 對 egr1 的轉(zhuǎn)錄具有直接調(diào)控作用。與此同時，重組 pgl3-egr1mt 為研究 egr1 在 腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制和功能的研究奠定了基礎(chǔ)。參考文獻 (references）1 yu j, baron v, mercola d et al. a network of p73, p53 and egr1 is required for efficient apoptosis in tumor cellsj. cell death and differentiation, 2007; 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