[精品論文]旋毛蟲幼蟲侵入胃上皮細胞后蟲體與細胞.doc

精品論文旋毛蟲幼蟲侵入胃上皮細胞后蟲體與細胞蛋白變化的研究*王蕾，崔晶，田翔宇，陳夢歡，范思洋，陳雨，劉莉娜，姜鵬，王中全5（鄭州大學寄生蟲學教研室）摘要： 目的 為了觀察旋毛蟲幼蟲對胃上皮細胞的侵入及侵入前后蟲體與細胞蛋白的變化， 篩選幼蟲侵入相關蛋白。方法 將旋毛蟲感染性幼蟲接種至胃上皮細胞（sgc-7901）單層，37 5%co2 條件下培養(yǎng)培養(yǎng)不同時間后在倒置顯微鏡下觀察幼蟲侵入情況；培養(yǎng) 18h 后10分別提取蟲體與細胞蛋白，進行 sds-page 與 western blot 分析。結果 旋毛蟲幼蟲培養(yǎng) 6 h時已侵入細胞單層，18h 在幼蟲尾端與頭端可見鞘的形成。sds-pagd 結果表明，幼蟲與細 胞培養(yǎng)后比僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的幼蟲增加了 3 條蛋白帶，減少了 4 條蛋白帶；而細胞與幼蟲培養(yǎng)后細胞蛋白增加了 3 條蛋白帶，減少了 2 條蛋白帶。western blot 分析顯示，幼蟲與細胞共培養(yǎng)后蟲體蛋白被旋毛蟲感染鼠血清多識別了 3 條蛋白帶（58、21、18kda），少識別15了 3 條蛋白帶（98、86、31 kda）；而細胞與幼蟲培養(yǎng)后細胞蛋白被旋毛蟲感染鼠血清多識 別了 6 條蛋白帶（96、62、40、34、29、22 kda），少識別了 2 條蛋白帶（98、15 kda）。結論 旋毛蟲幼蟲可侵入體外培養(yǎng)的胃上皮細胞單層；幼蟲與細胞共培養(yǎng)后被感染鼠血清多識別的蟲體與細胞蛋白可能是幼蟲分泌的侵入相關蛋白。關鍵詞： 旋毛蟲；侵入相關蛋白；胃上皮細胞；sds-page；western blot20中圖分類號：r383.15protein changes of larval and cell proteins after invasion of gastric epithelial cells by trichinella spiralis infective larvaewang lei, cui jing, tian xiangyu, chen menghuan, fan siyang, chen yu,25liu lina, jiang peng, wang zhongquan(department of parasitology, basic medical college, zhengzhou university, zhengzhou 450052, henan, china)abstract: objectiveto observe the invasion and protein changes of larval and cell proteins after invasion of gastric epithelial cells by trichinella spiralis infective larvae, and to screen the30invasion-related proteins. methods t. spiralis infective larvae were inoculated on monolayer of gastric epithelial cell (sgc-7901), the larval invasion was observed under an inverted microscopeafter culture at 37 in 5% co2 for different time. the larval and cell proteins after culture for18 h were extracted and analyzed by sds-page and western blot. resultswhen the larvaewere cultured for 6 h, the larvas head invaded cell monolayer. the anterior and posterior sheathe35of larva was observed after culture for 18 h. the results of sds-page showed after the larvae were cultured with cells, three additional protein bands were observed, and 3 protein bands was disappeared, compared with larvae cultured only in medium. after the cells were cultured with larvae, three new protein bands were observed, and two protein bands were disappeared. western blot analysis showed after the larvae were cultured with cells, three additional protein bands (58,4021, 18 kda) were recognized by sera from infected mice and three protein bands (98, 86, 13 kda) were not recognized by infection sera compared with proteins from larvae incubated in medium only. after the cells were cultured with larvae, six additional protein bands (96, 62, 40, 34, 29, 22 kda) were recognized by infection sera and two protein bands (98, 15 kda) were not recognized by infection sera. conclusions t. spiralis infective larvae invade the monolayer of gastric45epithelial cells cultured in vitro. after the larvae were cultured with cells, additional proteins of基金項目：國家自然科學基金項目（no.30972579；81271860）；高校博士點專項科研基金項目（no.20124101110005）；國家大學生創(chuàng)新計劃項目（no.1210459108） 作者簡介：王蕾（1988-），女，碩士研究生，旋毛蟲侵入機制 通信聯(lián)系人：王中全（1959-），男，教授，旋毛蟲侵入機制. e-mail: - 7 -larvae and cells may be the invasion-related proteins secreted by the larvae.key words: trichinella spiralis; invasion-related proteins; gastric epithelial cells; sds-page; western blot引言50旋毛形線蟲trichinella spiralis (owen,1835) railliet,1895,簡稱旋毛蟲，其成蟲和幼蟲分 別寄生在同一宿主的小腸和骨骼肌細胞內(nèi)。旋毛蟲具有十分廣闊的易感宿主（哺乳動物、鳥 類和爬行動物），人體感染旋毛蟲是因生食或者半生食含旋毛蟲幼蟲包囊的豬肉或其他動物 肉類而引起的。在生食或半生食感染旋毛蟲的肉類后，幼蟲在宿主胃液的作用下脫囊而出，0.9 h 內(nèi)進入腸道發(fā)育為腸道感染性第 1 期幼蟲，然后侵入腸道柱狀上皮細胞內(nèi)，經(jīng) 30h48h55完成 4 次蛻皮后發(fā)育為成蟲，雌雄交配后產(chǎn)新生幼蟲，新生幼蟲經(jīng)淋巴或血液循環(huán)移行到肌 肉組織，幼蟲在肌肉中可以存活數(shù)年而保持其感染性1。因此，脫囊幼蟲（腸道感染性第 1期幼蟲）侵入腸粘膜內(nèi)繼續(xù)發(fā)育或是被宿主從腸道排出，是旋毛蟲能否導致感染與致病的關鍵步驟。由于不能在體外觀察旋毛蟲幼蟲侵入腸粘膜或腸道排蟲反應（worm expulsion）的 詳細過程，目前關于幼蟲對腸上皮細胞的識別、侵入或排出機制均不完全清楚。體外實驗證60實，旋毛蟲幼蟲在體外可侵入人與大鼠的大腸、小腸上皮細胞及犬腎臟上皮細胞等2, 3，但 是否能侵入胃癌細胞則不清楚。為了研究旋毛蟲能否侵入胃癌細胞及其侵入機制，本文對旋毛蟲感染性幼蟲與人胃癌細胞株（human gastric cancer sgc-7901 cells，sgc-7901）在體外 共培養(yǎng)后，應用 sds-page 和 western blot 分析了幼蟲侵入細胞前后蟲體蛋白和細胞蛋白的變化，為尋找旋毛蟲侵入相關因子奠定基礎。651 材料與方法1.1旋毛蟲、實驗動物和細胞株本實驗所用的旋毛蟲（trichinella spiralis）為河南省南陽豬源旋毛蟲，由本室昆明小鼠 傳代保種。20 只雄性 6 周齡昆明小鼠（清潔級），體重 20g25g，均購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心。人胃癌細胞株 sgc-7901 購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。70sgc-7901 細胞接種于 1640 完全培養(yǎng)基中含 10%胎人血清（fbs，上海尚寶公司）、100 u/ml青霉素，100 g/ml 鏈霉素中，37 5% co2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁生長至 80%90%匯 合時，用 0.25% 胰蛋白酶（trypsin，北京索來寶公司）-0.02%乙二胺四乙酸鈉（edta）消化后傳代培養(yǎng)4。1.2 主要儀器和試劑75攪拌器（珠海飛利浦家庭電器有限公司），6孔培養(yǎng)板（美國costar公司產(chǎn)品），倒置顯 微鏡（olympus ix71，日本），人工消化液（含1%胃蛋白酶、0.7%鹽酸和0.85%氯化鈉），人血清白蛋白（bsa）寶信生物科技有限公司進口分裝,1640完全培養(yǎng)基含10%胎牛血清（fetalbovine serum，fbs，上海尚寶公司）、100 u/ml青霉素，100 g/ml鏈霉素，硝酸纖維素膜（ nc膜）amersham公司 ，hrp標記的羊抗小鼠igg (北京購自鼎國生物技術產(chǎn)品), dab（二氨80基聯(lián)苯胺，sigma公司），synthesis 超純水系統(tǒng)（美國millipore公司），totallab tl100分 析軟件（美國syngene公司產(chǎn)品）。1.3旋毛蟲肌幼蟲的收集與激活將300條旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)口感染昆明小鼠，感染后42 d 拉頸處死。膈肌壓片鏡檢證實感染成功后，剝皮、除內(nèi)臟和脂肪，用攪拌器攪碎數(shù)次，5s/次，至肌肉完全攪碎。將肌肉與85人工消化液按1 g10 ml混合后置于42 震蕩消化4 h，按貝氏法收集肌幼蟲，生理鹽水反復 洗滌后鏡下計數(shù)5。將肌幼蟲用含5%牛膽汁的pbs在37 5% co2條件下孵育2-3 h，用pbs 洗滌3次后，加入含抗生素的pbs（100u/ml青霉素，100g/ml鏈霉素）中37孵育1 h備用6。1.4細胞培養(yǎng)將 sgc-7901 細胞接種在 rpmi-1640 完全培養(yǎng)基均含 10% fbs（上海尚寶公司）、90100u/ml 青霉素，100g/ml 中，在 37 5% co2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，23 d 即可形成致密的單細胞 層，用于幼蟲接種。1.5蟲體與細胞蛋白的制備將激活的幼蟲與 sgc-7901 細胞在 rpmi-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) 18 h 后，分別收集蟲體與95100105110115120sgc-7901 細胞，制備蟲體與細胞蛋白6，bca 法7測得幼蟲與細胞培養(yǎng)前后的蟲體蛋白濃 度分別為 1.21 mg/ml 與 2.24 mg/ml；細胞與幼蟲培養(yǎng)前后的細胞蛋白濃度分別為 3.52 mg/ml 與 2.69 mg/ml，80凍存?zhèn)溆谩?.6sds-page 與 western blot 分析采用 bio-rad 公司電泳系統(tǒng)進行 sds-page，積層膠濃度為 5%，分離膠濃度為 12%。 將蟲體蛋白和細胞蛋白分別加入 5sds 上樣緩沖液，100水浴煮沸 10min 后離心，上樣濃度為 15 g/孔。 電泳時積層膠電壓為 80v，分離膠電壓為 120v，電泳時間 2.5 h。電泳結束 后將凝膠用 0.25%考馬斯亮藍 r-250 染色 4 6h，用洗脫液（100ml 醋酸、50ml 乙酸、850mldh2o）脫色，用蛋白圖譜掃描儀（分辨率為 300 bpi，像素為 8 bits）掃描后用 gene genius凝膠圖像分析軟件分析。將凝膠用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（nc 膜）上，電壓 20v，轉(zhuǎn)印 25 min。轉(zhuǎn) 印后將 nc 膜置于麗春紅染液中染色 5s，觀察到蛋白帶后用蒸餾水洗滌 3 次，再用 tbst 洗 滌以除去麗春紅，加封閉液（tbst+5%脫脂奶粉）4過夜，將 nc 膜用 tbst 洗滌 3 次后 加入 1：100 稀釋的一抗（旋毛蟲感染小鼠血清）培養(yǎng) 1 h；洗滌 3 次后加 1：5000 稀釋的二 抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 igg 抗體），培養(yǎng) 1h 后加入 dab 顯色 35min 后，置 蒸餾水中終止反應。2 結果2.1旋毛蟲幼蟲對 sgc-7901 細胞侵入情況的觀察 將旋毛蟲幼蟲加入培養(yǎng)細胞的單層后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)膽汁激活的幼蟲在細胞單層上作蛇形移動，并能侵入細胞單層；而未經(jīng)膽汁激活的幼蟲在細胞單層上仍呈盤旋狀，不能侵入細胞單 層，仍留在培養(yǎng)基中（圖 1）。激活幼蟲培養(yǎng) 6 h 時幼蟲頭部已侵入細胞單層；12h 絕大部分 蟲體全部伸展開并侵入細胞，頭尾端未見脫鞘；18 h 可見蟲體兩端帶鞘，但蟲體不能從鞘中 脫出，細胞損傷較為嚴重（圖 2）。圖 1 膽汁激活后旋毛蟲幼蟲在 sgc-7901 細胞單層上形態(tài)的變化a：經(jīng)膽汁激活后旋毛蟲在細胞單層呈蛇樣移行（200），b:未經(jīng)膽汁激活的幼蟲在細胞單層上呈盤旋狀（200）fig.1 morphological change of activated t. spiralis larvae with bile on sgc-7901 cell monolayer.a：the activated serpentine larva by bile migrated on the sgc-7901 cell monolayer（200）.b：the non-activated spiral larva without bile migrated on the sgc-7901 cell monolayer（200）125130135140145.圖 2 旋毛蟲幼蟲對 sgc-7901 細胞單層的侵入情況a：培養(yǎng) 6 h 的幼蟲頭部侵入細胞單層（200，箭頭所示），b：培養(yǎng) 12h 的幼蟲侵入細胞單層（200），c： 培養(yǎng) 18 h 的幼蟲頭尾兩端可見鞘的形成（200），d：培養(yǎng) 18 h 后細胞損傷較嚴重fig. 2 invasion of sgc-7901 cell monolayer by t. spiralis larvaea： the larvas head invade cell monolayer cultured for 6 h（200）， b：invasion of cell monolayer by larvacultured for 12 h（200），c： the anterior and posterior sheathe of larva cultured for 18 h（200）， d：serious cell damage cultured for 18 h（200）2.2 幼蟲與 sgc-7901 細胞孵育后蟲體蛋白的 sds-page 與 western blot 結果在無 sgc-7901 細胞的培養(yǎng)基中孵育 18h 后，幼蟲蛋白有 36 條蛋白帶，分子量為130kda12 kda。幼蟲與細胞共培養(yǎng)后，蟲體蛋白增加了 3 條蛋白帶（83、42、39 kda），減 少了 4 條蛋白帶（127、60、32、31 kda）（圖 3）。western blot 結果顯示，幼蟲僅在培養(yǎng)基中孵育 18h 后，能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的有 21 條帶，分子量為 131 kda 12 kda（圖4）；幼蟲與細胞孵育后蟲體蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的也有 21 條帶，分子量為 131 kda 12 kda。旋毛蟲幼蟲和細胞培養(yǎng)后與僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的幼蟲相比，被感染鼠血清多識別了 3 條蛋白帶（58、21、18 kda），少識別了 3 條蛋白帶（98、86、31 kda）。圖 3 旋毛蟲幼蟲與 sgc-7901 細胞孵育后 18h 蟲體蛋白的 sds-page 分析m：蛋白 marker，1：幼蟲與細胞孵育后的蟲體蛋白 2：僅在培養(yǎng)基中孵育后的蟲體蛋白fig. 3 sds-page analysis of proteins of t. spiralis larvae incubated with sgc-7901 cells for 18 hm：protein marker，1：proteins of larvae incubated with cells, 2：proteins of larvae incubated only in medium150155圖 4 旋毛蟲幼蟲與 sgc-7901 細胞培養(yǎng)后蟲體蛋白的 western blot 結果m：蛋白 marker，1：與細胞孵育后的蟲體蛋白+感染鼠血清，2：培養(yǎng)基中孵育后的蟲體蛋白+感染鼠血清，3：與細胞孵育后的蟲體蛋白+正常鼠血清，4：培養(yǎng)基中孵育后的蟲體蛋白+正常鼠血清fig. 4 western blot analysis of proteins of t. spiralis larvae incubated with sgc-7901m：protein markers，1：proteins of the larvae incubated with cells + sera of the infected mice，2：proteins of thelarvae incubated only in medium + sera of the infected mice，3：proteins of the larvae incubated with cells + sera of normal mice，4：proteins of larvae incubated only in medium + sera of normal mice16016517017518023sgc-7901 細胞與幼蟲孵育后細胞蛋白的 sds-page 與 western blot 結果sds-page 結果表明，在不含幼蟲的培養(yǎng)基將 sgc-7901 細胞的培養(yǎng)孵育 18h 后， sgc-7901 細胞有 32 條蛋白帶，分子量為 134 kda 11 kda。細胞與幼蟲共培養(yǎng)后的細胞蛋 白增加了 3 條蛋白帶（96、35、25 kda），減少了 2 條蛋白帶（84、15 kda）（圖 5）。western blot 結果顯示，僅在培養(yǎng)基中孵育的 sgc-7901 細胞蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的有13 條帶（98 kda 11 kda）；與幼蟲孵育后的細胞蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的有 17條帶（96 kda 11 kda）（圖 6）。與幼蟲孵育后的細胞蛋白與僅在培養(yǎng)基孵育的細胞相比， 被旋毛蟲感染鼠血清多識別了 6 條蛋白帶（96、62、40、34、29、22 kda），少識別了 2 條蛋白帶（98、15 kda）。此外，與幼蟲孵育后的細胞蛋白能被正常鼠血清識別 1 條 46 kda 條 蛋白帶，而僅在培養(yǎng)基孵育的細胞則有 2 條蛋白帶（89、46 kda）被正常鼠血清識別。圖 5 sgc-7901 細胞與旋毛蟲幼蟲孵育后細胞蛋白的 sds-page 結果m 蛋白 marker， 1：與幼蟲孵育后的細胞蛋白，2：僅在培養(yǎng)基中孵育后的細胞蛋白fig. 5 sds-page analysis of proteins of sgc-7901 cells incubated with t. spiralis muscle larvaem：protein marker， 1：proteins of cells incubated with larvae，2：proteins of cells incubated only in medium圖 6 sgc-7901 細胞與旋毛蟲幼蟲孵育后細胞蛋白的 western blot 結果m：蛋白 marker，1：與幼蟲孵育后的細胞蛋白+感染鼠血清，2：僅在培養(yǎng)基中孵育后的細胞蛋白+感染鼠 血清，3：與幼蟲孵育后的細胞蛋白+正常鼠血清，4：僅在培養(yǎng)基中孵育后的細胞蛋白+正常鼠血清fig. 6 western blot analysis of proteins of sgc-7901 cells incubated with t. spiralis larvae m：protein markers，1：proteins of cells incubated with larvae + sera of the infected mice，2：proteins of cells incubated only in medium + sera of the infected mice，3：proteins of cells incubated with larvae + sera of normal mice，4：proteins of cells incubated only in medium + sera from normal mice3 討論人胃癌細胞株 sgc-7901 來自胃腺癌，具有胃粘膜上皮細胞的形態(tài)且能分泌粘液8，國 內(nèi)外主要用于抗腫瘤藥效、胃癌耐藥機制等研究。旋毛蟲幼蟲囊包經(jīng)口食入后，在胃內(nèi)消化185190195200205210215液的作用下，幼蟲自囊包內(nèi)逸出，鉆入十二指腸及空腸上段的腸粘膜。但對于幼蟲是否能侵 入胃粘膜則尚未見報道。本文結果表明，旋毛蟲幼蟲可侵入體外培養(yǎng)的胃腺癌 sgc-7901 細胞單層，該細胞株可作為體外研究旋毛蟲侵入機制的細胞模型。對于幼蟲是否能侵入宿主胃 粘膜，有待動物實驗證實。由于旋毛蟲缺乏侵入性的解剖結構（如口孔無齒狀和矛狀結構等）9，推測幼蟲對腸上 皮細胞的侵入不是簡單的機械性損傷。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，幼蟲侵入腸上皮細胞時將幼蟲分泌的蛋白沉積在細胞內(nèi)3,6，故推測幼蟲對腸上皮細胞的侵入可能是通過幼蟲分泌的某種 蛋白或宿主細胞釋放的某些化學信號介導的10，11。 旋毛蟲穿透細胞膜和誘導的細胞膜的損傷并不一定能導致幼蟲的侵入，表明幼蟲的成功侵入還需要一些宿主和寄生蟲之間的信號傳導。膽汁對肌幼蟲的激活對幼蟲侵入腸粘膜不必可少的，可能與膽汁激活了宿主-寄生的信 號通路有關12，13。本文應用 sds-page 對 sgc-7901 細胞與激活幼蟲培養(yǎng) 18h 后的蟲體蛋 白和細胞蛋白組分進行了分析，發(fā)現(xiàn)幼蟲與細胞共培養(yǎng)后，蟲體蛋白增加了 3 條蛋白帶（83、42、39 kda），減少了 4 條蛋白帶（127、60、32、31 kda）。western blot 結果顯示，旋毛蟲 幼蟲和細胞共培養(yǎng)后的蟲體蛋白與僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的幼蟲相比，被感染鼠血清多識別了 3 條蛋白帶（58、21、18 kda），少識別了 3 條蛋白帶（98、86、31 kda）。sgc-7901 細胞與 幼蟲孵育后的細胞蛋白與僅在培養(yǎng)基孵育的細胞相比，被旋毛蟲感染鼠血清多識別了 6 條蛋 白帶（96、62、40、34、29、22 kda），少識別了 2 條蛋白帶（98、15 kda）。上述結果提示， 幼蟲與細胞培養(yǎng)后被感染鼠血清多識別的蟲體蛋白可能是細胞激活了蟲體某些基因表達的侵入相關蛋白；減少的蛋白可能是幼蟲與細胞接觸后表達這些蛋白的基因下調(diào)，也可能與蟲 體或細胞分泌的酶類水解有關10。細胞與幼蟲培養(yǎng)后被旋毛蟲感染鼠血清多識別的細胞， 可能是細胞與幼蟲接觸過程中幼蟲的 es 抗原進入細胞內(nèi)所致，而減少的蛋白可能是細胞與 幼蟲接觸后細胞釋放出了特異性的化學介質(zhì)有關。但目前關于細胞特異性化學介質(zhì)及旋毛蟲 對化學介質(zhì)的識別過程了解甚少。旋毛蟲幼蟲并不能侵入所有的細胞，如幼蟲可侵入旋毛蟲易感的人小腸與結腸上皮細 胞、鼠小腸上皮細胞及犬腎上皮細胞等，但不能侵入人肺成纖維細胞、小鼠橫紋肌成肌細胞及大鼠空腸隱窩細胞 iec-6 等2。將幼蟲與旋毛蟲易感或不易感的細胞共培養(yǎng)后，均可引起非致死性的細胞膜損傷，雖然這些損傷不一定能導致幼蟲的侵入，但均可使幼蟲的 es 抗原 進入細胞內(nèi)。butcher 等10將旋毛蟲幼蟲與不敏感的 iec-6 細胞培養(yǎng)后，雖然幼蟲不能侵入細胞內(nèi)，但可在細胞漿與胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn) es 抗原；若將 es 抗原加入含細胞的培養(yǎng)基中，則細 胞不能攝入 es 抗原，提示 es 抗原可能不是通過胞飲進入細胞內(nèi)的，而可能是通過細胞膜的損傷幼蟲直接將 es 抗原注入細胞內(nèi)的。對于旋毛蟲不易感的細胞，幼蟲引起的單獨的細 胞膜損傷或單獨的 es 抗原進入細胞內(nèi)均不足以導致幼蟲侵入細胞，提示幼蟲對細胞的侵入還需要來自細胞的特異性信號。參考文獻 (references)2202252302351 吳觀陵. 人體寄生蟲學第 3 版m. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2005:603-618.2 manwarren t，gagliardo l，geyer j，et al. invasion of intestinal epithelia in vitro by the parasitic nematodetrichinella spiralisj. infect immun,1997,65(11):4806-4812.3 wang sw, wang zq, cui j. protein change of intestinal epithelial cells induced in vitro by trichinella spiralis infective larvaej. parasitol res, 2011, 108:593-5994 ren hj, cui j, wang zq, liu rd. normal mouse intestinal epithelial cells as a model for the in vitro invasionof trichinella spiralis infective larvaej. plos one, 2011, 6(10):e27010.5 li f, cui j，wang zq, et al. factors affecting the sensitivity of artificial digestion and its optimization forinspection of trichinella spiralis in meat j. foodborne pathog dis, 2010,7(8):879-885.6 wang zq, wang l, cui j. proteomic analysis of trichinella spira