Robo1 在視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞中的.doc

精品論文robo1在視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞中的作用研究黃旅珍，徐永勝，黎曉新5（北京大學人民醫(yī)院眼科，視覺損傷與修復(fù)教育部重點實驗室，北京 100044） 摘要：目的：探討神經(jīng)導(dǎo)向因子 robo1 在視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞（rf/6a ）中的作用。 方法：通過 sirna 干擾技術(shù)降低 robo1 基因在 rf/6a 細胞中的表達，用 rt-pcr 檢測 mrna 表達變化,用 western blot 檢測蛋白表達變化。采用 mtt，boyden 小室，免疫熒光，流式細 胞儀對細胞的增殖，遷移，伸展，細胞周期進行檢測。用 matrigel 對 rf/6a 血管形成進行10檢測。結(jié)果：sirna 干擾技術(shù)在 mrna 水平以及蛋白水平均有效的沉默 robo1 基因在細 胞中的表達。robo1 sirna 干擾后 rf/6a 細胞的粘附、增殖、遷移均受到抑制，rf/6a 血 管形成明顯受到抑制。結(jié)論： robo1 sirna 對 rf/6a 細胞的細胞增殖、遷移能力的抑制作 用以及管道形成能力明顯。robo1 基因為臨床視網(wǎng)膜新生血管性疾病的治療提供了新的靶 點。15關(guān)鍵詞：小干擾 rna；rf/6a；robo1；增殖the roles of robo1 in the retinal/choroidal vascular endothelial cellshuang lvzhen, xu yongsheng, li xiaoxin20(key laboratory of vision loss and restoration, ministry of education, department ofophthalmology, peking university peoples hospital, beijing 100044)abstract: purpose: to evaluate the roles of robo1 in the retinal/choroidal vascular endothelial cells (rf/6a).methods: sirna technology was used to knock down survivin expression and to study its effects on cells in vitro. cell proliferation, migration, spreading, cycling, and apoptosis25were assessed with the mtt assay, boyden chamber assay, immunocytochemistry, and flowcytometry.tube formation by rf/6a on matrigel was also analyzed.results:robo1 sirna knockdown inhibited cellproliferation, migration. tube formation by rf/6a cells was also disturbed.conclusions: silencing the expression of robo1 in rf/6a cells inhibited their proliferation, migration and tube formation. this study indicates that robo1 may be a molecular30target for new diagnostic and therapeutic strategies for neovascular retinopathy diseases.keywords: sirna; rf/6a; robo1; neovascularization0引言病理性脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜新生血管是造成視力喪失的主要原因如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、年齡35相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等1-2。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)與血 管系統(tǒng)具有很多的相似點。有很多在神經(jīng)系統(tǒng)中具有一定作用的因子被證實在血管生成系統(tǒng) 中也具有重要作用，其中就包括 robo 家族。robo 家族史一類與發(fā)育有關(guān)的保守的跨膜蛋 白家族，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。1993 年，在對果蠅的研究中克隆了首個 robo 基因即 robo1 基因3。早期的 robo1 蛋白的功能研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。近40年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn) robo1 可能參與腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展過程。wang 等首次報道了 robo1 在腫瘤血管形成中的重要作用，發(fā)現(xiàn) robo1 表達在腫瘤血管內(nèi)皮細胞上，并通過體 內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)阻斷 robo1 的表達明顯減少了惡性黑色素瘤新生血管密度和腫瘤大小4。文獻基金項目：高等學校博士學科點專項科研基金（20090001110083） 作者簡介：黃旅珍，(1980-)，女，助理研究員，眼科基礎(chǔ)與臨床。 通信聯(lián)系人：黎曉新，（1950-），女，教授，眼底病。e-mail: drli_- 7 -報道，在結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌等常見腫瘤中，robo1 在腫瘤細胞質(zhì)和細胞膜中高表達，并且表達強度與腫瘤的進程與分化程度密切相關(guān)5-6。robo1 蛋白過量表達在人45正常腎上皮 293 細胞中，可改變其細胞形態(tài)，提高細胞的體外增殖和遷移能力，并通過下 調(diào) e-cadherin 基因的表達誘導(dǎo)正常細胞向惡性增生的腫瘤細胞轉(zhuǎn)化7。表明 robo1 可能在 腫瘤新生血管形成及腫瘤細胞增殖方面具有作用。目前 robo1 的研究主要集中在 robo1 的表達及腫瘤方面，robo1 在視網(wǎng)膜相關(guān)疾病方面的研究未見報道。本研究以體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞為研究對象，采用 sirna 技術(shù)對50robo1 在血管內(nèi)皮細胞中的表達進行抑制，觀察抑制 robo1 表達后細胞生物行為學的變化， 探討 robo1 作為治療視網(wǎng)膜新生血管疾病的新靶點的可行性。1材料與方法1.1研究對象視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞（rf/6a ，crl-1780 cell line ），購自上海中科院細胞研55究所。1.2實驗試劑trizol reagent 購自 invitrogen 公司，prime scripttm rt reagent kit 、sybr premix extaptm 均購自 takara公司，所用引物由 qiagen 公司合成。實驗用一抗包括：兔抗人 robo1 購自 chemicon 公司、小鼠抗人-actin 抗體均購自 sigma 公司。實驗用二抗：fitc60標記的山羊抗小鼠 igg 、tritc 標記的山羊抗小鼠 igg 和 dapi 均購自 sigma 公司。robo1 sirna、陰性對照組 negative sirna，轉(zhuǎn)染劑 hiperfect 購自 qiagen 公司。細胞檢測用 mtt, pi, annexin v-pi 購自 sigma 公司，matrigel 購自 bd 公司。1.3實驗方法1.3.1細胞培養(yǎng)和 sirna 處理細胞65細胞培養(yǎng)參照細胞生物學方法進行，rf/6a 細胞均采用含 10%fbs 的 dmem/f12 培 養(yǎng)基培養(yǎng)。參照說明書對 sirna 進行配制保存。試驗中設(shè)陰性對照組（negative sirna, ns ）、轉(zhuǎn)染劑對照組（untransfection, ut）以及 robo1 sirna 實驗組，以 gapdh 為內(nèi) 參。按照細胞傳代培養(yǎng)的方法，將細胞消化成懸浮狀態(tài)，以 1105/細胞密度接種于 6 孔板 上，每孔 2300l 培養(yǎng)基，6 孔板置于 37 c、5%co2 條件下孵箱中備用。sirna 加入到70100l 無血清培養(yǎng)基中（其終濃度將為 15nm，再加入 12lhiperfect 轉(zhuǎn)染劑，渦旋振蕩器 混勻，室溫下孵育 15-30 分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體混合液。將混合液滴加到 6 孔板的細胞培 養(yǎng)液中，輕晃混勻。6 孔板置于 37 c、5%co2 條件下孵箱中孵育 48-72 小時。收集細胞 用于檢測。1.3.2細胞 rna 提取、cdna 制備及 real time pcr 反應(yīng)75參照 trizol reagent 使用說明提取細胞 mrna 后，參照 prime scripttm rt reagent kit 使用說明將其逆轉(zhuǎn)錄為 cdna ，參照 sybr premix extaptm 使用說明 real time pcr 。根 據(jù) ncbi 中 gene bank檢索的基因序列合成引物，具體信息見表 1。80表 1 pcr 引物序列信息基因名稱上游引物下游引物片 段 長 度（bps）robo1aaatatggtgggcaaagctgctggatgactgtggtggttg104gapdhgagtccactggcgtcttcacgttcacacccatgacgaaca1208590951001051101.3.3細胞總蛋白的提取、sds-page 電泳及免疫印記分析參照蛋白提取試劑使用說明提取細胞總蛋白，經(jīng) bca 進行蛋白定量分析。參照分子生 物學實驗方法進行 sds-page電泳、轉(zhuǎn)膜，最終經(jīng)由封閉、一抗、二抗環(huán)節(jié)完成免疫印 記檢測。將免疫印記結(jié)果 bio-rad 計算機凝膠成像系統(tǒng)拍照，quantity one 軟件分析雜交條 帶，spss 10.0 軟件包統(tǒng)計分析蛋白不同時間段表達量的差異。1.3.4細胞增殖檢測（mtt 法）調(diào)整消化細胞濃度，按 500/孔/0.2ml 接種于 96 孔板培養(yǎng)板中，設(shè) 6 個平行孔，置 37，5%co2 孵箱中。從第 2 天起固定時間加入 5mg/ml 的 mtt20l。4 小時后傾去上清， 加入分析純 dmso150l。在 wallac victor2 上，590nm 測每孔的吸光值。計算每個時相點 6 孔的吸光度的平均值。1.3.5細胞黏附實驗（mtt 法）將消化下來的細胞懸液加入到 96 孔板中，每孔 100l （3104 個細胞/孔）；將 96 孔 板置于 37 c、5%co2 條件下孵箱中孵育 1 小時；pbs 液小心清洗 96 孔板，將未黏附的 細胞清洗掉；加入 80l 新鮮 dmem 培養(yǎng)液；加入 5mg/ml 的 mtt20l；余步驟同細胞增 殖檢測。計算抑制率( 對照-空白)-( 干預(yù)- 空白)/(干預(yù)- 空白)100%。1.3.6細胞遷移試驗（transwell 法）將 transwell 小室取出，向小室下方的 24 孔板中加入 600 l dmem 和 10% 胎牛血清； 將 transwell 小室放回原位；向 transwell 小室內(nèi)加入細胞懸液 100l；置于 37 c、5%co2 條件下孵箱中孵育 5 小時；取出小室；用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞；4%多聚甲醛固定；加入1:1000 稀釋 dapi，3715 分鐘；0.1m pbs 緩沖液洗滌 3 次，每次 5 分鐘；將 transwell 小 室底膜取下，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察；取 5 個隨即視野照相，計數(shù)穿過 transwell 小室底膜的細胞數(shù)。1.3.7細胞周期的檢測(pi 法)細胞消化后制成單細胞懸液；-20預(yù)冷的 70% 乙醇固定 4過夜；冷 pbs 洗滌 3 次， 每次 5 分鐘；rnaase 消化 30 分鐘，離心；加入 100g/ml 碘化丙錠 0.5ml，避光 5 分鐘。 流式細胞儀 488nm 檢測。1.3.8體外管道形成能力檢測(matrigel 法)參照 matrigel 說明進行鋪 48 孔板；細胞消化后制成單細胞懸液，以 1104 細胞/孔進 行接種；置于 37 c、5%co2 條件下孵箱中孵育 24 小時。倒置顯微鏡下觀察；取 5 個隨 即視野照相，使用 image pro plus 圖像分析軟件計算管道形成面積。計算抑制率(1-干預(yù)/ 空白)100%。1.3.9統(tǒng)計學分析全部試驗重復(fù) 3 次以上。使用 spss13.0 統(tǒng)計學軟件，采用 t 檢驗及單因素方差分析115120（anova）進行統(tǒng)計，計量資料采用 mann-whitney u test 法。p0.05 表示有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1robo1 sirna 特異的抑制 robo1 在細胞的表達如圖 1a 實時定量 pcr 結(jié)果表明，與陰性對照組（ns）和轉(zhuǎn)染劑對照組(ut)比較而言， 顯示 robo1 sirna 可特異敲減了 rf/6a 細胞中 robo1 基因的表達（圖 1a）。圖 1b 中的 western-blot 結(jié)果表明 robo1 特異 sirna 可以在蛋白水平上有效地沉默 robo1 基因的表達（圖 1b）。表明該實驗體系可以特異、有效地敲減 robo1 基因。125130圖 1. robo1 sirna 可特異地從 rna 水平和蛋白水平抑制 robo1 在 rf/6a 細胞的表達。a. 定量 pcr 檢測 robo1 在轉(zhuǎn)染劑對照組（ut）及陰性對照組（ns）和特異的 robo1sirna 處理組的表達水平。b. western-blot 顯示 robo1 蛋白條帶在不同處理組的表達。2.2robo1 特異 sirna 對 rf/6a 細胞生物學特性的影響2.2.1robo1 特異 sirna 抑制細胞增殖實驗如圖 2 所示，與陰性對照組（ns）相比，mtt 結(jié)果顯示，robo1 特異 sirna 在第 3天時可明顯抑制 rf/6a 細胞的增殖，抑制作用可持續(xù)至第五天，均有統(tǒng)計學差異 (p 0.01)。1352.2.2細胞遷移實驗圖 2. robo1 sirna 抑制 rf/6a 細胞的增殖作用如圖 3 所示，與陰性對照組（圖 3a）相比，robo1 sirna 均抑制了 rf/6a 細胞的遷移（圖 3b）。rf/6a 細胞中，平均每個視野中遷移細胞數(shù)與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(圖 3c，p 0.01)。140145150圖 3 robo1sirna 對 rf/6a 細胞的遷移作用。a. 陰性對照組（negative sirna, ns ）中 rf/6a 細胞遷移 結(jié)果。b. robo1 sirna 處理組中 rf/6a 細胞遷移結(jié)果。c. ns 組和 robo1 sirna 處理組中細胞遷移的統(tǒng)計 結(jié)果。2.2.3體外成管實驗如圖 4 所示，與陰性對照組（ns）相比，robo1 特異 sirna 明顯抑制 rf/6a 細胞體 外管道形成能力，管道形成數(shù)目明顯減少，具有統(tǒng)計學差異(p 0.01)。圖 4. robo1sirna 對 rf/6a 細胞成管作用。a. 陰性對照組（negative sirna, ns ）中 rf/6a 細胞管道形 成結(jié)果。b. robo1 sirna 處理組中 rf/6a 細胞管道形成結(jié)果。c. ns 組和 robo1 sirna 處理組中細胞管道 形成的統(tǒng)計結(jié)果。1551602.2.4robo1 特異 sirna 細胞周期呈 g0/g1 實驗如圖 5 所示，與陰性對照組（ns）相比，robo1 sirna 處理組 rf/6a 細胞 g1 期為 74.92% 而對照組為 63.91%；s 期為 16.08%而對照組為 28.27%。與對照組相比，處理組細胞中 robo1 的減少導(dǎo)致細胞周期 g0/g1 期延長，s 期減少，均具有統(tǒng)計學差異(p 0.01)。圖 5. robo1 對 rf/6a 的細胞周期作用。a：ns 處理組；b：robo1 sirna 處理組；c. ns 組和 robo1 sirna處理組中細胞周期的統(tǒng)計結(jié)果。1651701753結(jié)論小干擾 rna（sirna）介導(dǎo)的 rna 干擾在哺乳動物細胞中能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默， 具有高效性和特異性。但是，sirna 過程中，mrna 水平和蛋白水平中的非特異性效應(yīng)可 能是限制這一技術(shù)應(yīng)用的原因之一【8】。因此，我們使用陰性對照來觀察這種效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)特 異地 robo1 sirna 可以很好的沉默 rf/6a 細胞中 robo1 的表達。本研究選用視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜 血管內(nèi)皮細胞為研究對象，采用 sirna 技術(shù)降低 robo1 的表達，以研究 robo1 在細胞中 的作用，探討其在視網(wǎng)膜新生血管性疾病。對于 robo1 特異 sirna 的驗證采用了實時定量 pcr 和 western blot 的方法從 mrna 水平和蛋白水平對 sirna 的敲減效率進行驗證，結(jié)果證實了這一體系的可靠性。對于 robo1 特異 sirna 處理后對細胞黏附、增殖、遷移、周期、管道形成的影響均采用較為成熟的方 法進行檢測。管道形成是 rf/6a 細胞的特性之一，也是新生血管形成中最重要的階段。我們的研究 結(jié)果顯示，robo1 基因沉默可顯著降低 rf/6a 的管道形成能力，提示 robo1 在 rf/6a 體 外形成血管中具有一定的作用。細胞遷移、黏附是細胞正常生理功能的主要指標。robo1 sirna 處理的 rf/6a 細胞與 對照組相比，細胞遷移明顯減少，細胞黏附能力均降低，說明沉默 robo1 的表達可以抑制 rf/6a 細胞的遷移和黏附。180185190細胞的生長和增殖是細胞生命活動的重要體現(xiàn)。真核細胞是以有絲分裂的方式進行增殖的。細胞周期亦即細胞增殖周期，是指細胞從第一次有絲分裂結(jié)束到第二次有絲分裂結(jié)束所 經(jīng)歷的過程。它包含有絲分裂間期和有絲分裂期，有絲分裂間期又包括 dna 合成前期（g1）， dna 合成期（s），dna 合成后期（g2）和有絲分裂期（m ），此外靜止相的 g1 期細胞 沒有增殖活性，又被稱做 g0 期。各類細胞的細胞周期時間有很大差異，細胞周期短的細胞 因可以在短時間內(nèi)大增殖，故增殖能力強，細胞周期長的細胞增殖能力弱。而細胞周期長短 的時間主要取決于細胞周期中的 g1 期時間，不同細胞 g1 期時間差別很大，而細胞進入 s 期 后，一直到有絲分裂完成所需要的時間相當恒定。robo1 sirna 轉(zhuǎn)染的細胞較對照組 g1 和s 期延長，細胞生長受到抑制?？偠灾?，我們的研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，robo1 可能在脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的管 道形成、細胞粘附、遷移和增殖中具有重要作用。后續(xù)研究需要進一步深入研討 robo1 體 內(nèi)對視網(wǎng)膜新生血管中的作用。比如通過 robo1 的特異抑制劑或特異激活劑來抑制或活化 robo1 的表達可能有助于確定 robo1 在視網(wǎng)膜新生血管中的作用。參考文獻 (references)1952002052101 ferris fl 3rd, fine sl, hyman l. age-related macular degeneration and blindness due to neovascularmaculopathy. arch ophthalmolj. 1984;102:1640-1642.2 green wr. histopathology of age-related macular degeneration. mol visj. 19