[精品論文]EECP 蛋白表達(dá)在乳腺癌中的初步研究.doc

精品論文eecp 蛋白表達(dá)在乳腺癌中的初步研究王宇1,2，嚴(yán)華梅1，王艷萍1，王竹1，鄭鴻1（1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤分子診斷研究室，成都 610041；52. 生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）摘要：目的：研究 eecp 蛋白在乳腺癌患者組織和血漿標(biāo)本中的表達(dá)情況。方法：采用免疫 組化方法檢測(cè) 15 例乳腺癌石蠟組織切片中的 eecp 蛋白表達(dá)水平。elisa 法檢測(cè) 130 例乳腺癌患者，對(duì)照組為 71 例體檢健康或乳腺良性增生女性的血漿中 eecp 蛋白的濃度。結(jié)果：10對(duì)照組全部 15 例癌旁正常組織結(jié)果為陰性。15 例乳腺癌組織中，12 例腫瘤細(xì)胞胞漿染色強(qiáng) 陽(yáng)性，呈彌漫性分布；1 例結(jié)果為陰性；2 例結(jié)果不確定，eecp 蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)顯著增加。乳腺癌患者血漿中 eecp 蛋白濃度為 13.381.37 ng/ml，對(duì)照組為 3.70.48 ng/ml。eecp 蛋白在乳腺癌血漿中顯著升高（p0.01）。結(jié)論：eecp 蛋白可能是一個(gè)乳腺癌相關(guān)基因，及其腫瘤標(biāo)志物。15關(guān)鍵詞：乳腺癌；eecp；elisathe study of expression of eecp in breast cancerwang yu1,2, yan huamei1, wang yanping1, wang zhu1, zheng hong120(1. laboratory of molecular diagnosis of cancer,west china hospital,si chuan university, chengdu 610041;2. state key laboratory of the biotherapy and cancer center, west china hospital,si chuanuniversity, cheng du 610041)abstract: objectives: the study was aimed to investigate the eecp expression in tissue and plasm25of breast cancer patients. method: eecp protein in 15 tissue slices were detected by ihc assay.eecp protein in plasma of 71 normal /benign disease females and 130 breast cancer patients were detected by elisa assay. result: the result of all cases of control from adjacent tissue was negative. strong,diffuse eecp staining was detected in 12 cases of breast cancer tissue, 1 case was negative,2 cases were uncertain. stronger expression of eecp protein was observed in breast30cancer specimens compared with the adjacent normal tissue. eecp protein conentration in thebreast cancer patinet was 13.381.37 ng/ml, while that in controls was 3.70.48 ng/ml. there was a statistical significance increased（p0.01）. conclusion: eecp may be a breast cancer relatedgene and tumor marker.key words: breast cancer; eecp; elisa350引言乳腺癌是女性主要的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)不斷上升。據(jù)報(bào)道，2007年美國(guó)乳腺癌新發(fā)病例數(shù)，位居女性新發(fā)腫瘤的首位和因腫瘤死亡的第2位1。我國(guó)雖屬女性乳腺癌的低發(fā)國(guó)，但近年來(lái)乳腺癌的發(fā)病率明顯增高，居女性40惡性腫瘤的第二位，發(fā)病年齡也由中老年婦女向青年女性擴(kuò)展，滬、京、沿海等發(fā)達(dá)地區(qū)成為我國(guó)乳腺癌的高發(fā)地區(qū)2, 3。當(dāng)前，乳腺癌診斷仍主要依靠自我檢 查、臨床體檢及影像學(xué)檢查，如鉬靶攝片、b超等，這對(duì)于相當(dāng)一部分腫塊較小基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金資助課題（20090181110070） 作者簡(jiǎn)介：王宇（1980），男，助理實(shí)驗(yàn)師，腫瘤分子生物學(xué) 通信聯(lián)系人：鄭鴻（1965），男，教授，乳腺癌的基礎(chǔ)與臨床. e-mail: - 5 -甚至不能捫及腫塊的患者，以及對(duì)大部分乳腺組織較致密、脂肪組織不多而不適于鉬靶診斷的東方女性而言，僅僅依靠上述傳統(tǒng)手段進(jìn)行早期診斷，存在很大的45困難。雖然近年來(lái)乳管鏡和乳腺導(dǎo)管灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查的應(yīng)用，為大導(dǎo)管內(nèi)無(wú)腫 塊、無(wú)鈣化的乳腺導(dǎo)管原位癌的診斷提供了一條新途徑，但其檢查途徑的侵入性 及對(duì)技術(shù)設(shè)備條件的較高要求，給其推廣應(yīng)用帶來(lái)了阻力4。在乳腺癌術(shù)后療效 評(píng)價(jià)、預(yù)后估計(jì)和隨訪方面，也主要也依賴于上述經(jīng)典手段，但效果難以令人滿 意。乳腺癌的發(fā)生是基因、環(huán)境復(fù)雜交互作用的結(jié)果，但是其確切的發(fā)病機(jī)制仍50不清楚。 通過(guò)對(duì)乳腺癌相關(guān)基因及表達(dá)蛋白的深入研究，能夠更加了解乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，揭示其發(fā)病機(jī)制，有助于發(fā)明新的乳腺癌診斷、治療、預(yù)后監(jiān)測(cè)等 方法5。我們?cè)谇捌谘芯恐校瑘?bào)道發(fā)現(xiàn)了乳腺癌相關(guān)基因eecp。本次將繼續(xù)研究 eecp蛋白在臨床乳腺癌患者標(biāo)本中的表達(dá)情況。551 材料與方法1.1 對(duì)象 我院 130 例乳腺癌患者，均由病理診斷確診，平均年齡 49.41 歲。對(duì)照組為體檢健康或乳腺良性增生女性，共 71 例，平均年齡 40.06 歲。均征得參 與者的知情同意。1.2 試劑和儀器 羊抗兔 igg 抗體(中杉金橋)，dab 顯色液（博士德），tmb 顯色60液（p0209 碧云天），兔抗人 eecp 蛋白多克隆抗體，小鼠抗人 eecp 蛋白單克隆 抗體為本室自制。酶標(biāo)儀（therm,usa），恒溫培養(yǎng)箱（zgb-2080）。1.3 標(biāo)本采集 術(shù)前抽取患者靜脈血 4ml，置于未加抗凝劑管中，室溫放置 30min，4下 3000g 離心 15min，取上清液存于-80冰箱保存，待用。取乳腺癌和癌旁 正常組織標(biāo)本，固定于 4%甲醛 24h，經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。651.4 免疫組化法檢測(cè)組織中 eecp 蛋白表達(dá) 組織切片厚度 5um，一抗為本室自制 的兔抗人 eecp 蛋白多克隆抗體，濃度 1:500，37孵育 2h。二抗為辣根過(guò)氧化 物酶標(biāo)記的羊抗兔 igg 抗體，37孵育 30min。dab 顯色，蘇木精復(fù)染, 顯微鏡 下觀察結(jié)果。1.5 elisa 檢測(cè)血漿中 eecp 蛋白含量 篩選配對(duì)的小鼠抗人 eecp 蛋白單克隆抗70體，采用雙抗夾心 elisa 法檢測(cè)血漿中 eecp 蛋白含量。將抗體 4a10d7、2a7b2混合，包被酶標(biāo)板 4，24h。血漿標(biāo)本按 1:4 稀釋?zhuān)瑢⑵浼尤氚灰豢沟?96 孔酶標(biāo)板，37孵育 2h；二抗 hrp 標(biāo)記的 4f7d3 37孵育 1.5h；tmb 顯色，使用酶標(biāo)儀測(cè)定 450nm 處的 od 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 eecp 蛋白含量。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用 spss16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用 se 表示。t 檢75驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。p0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 乳腺組織中 eecp 蛋白表達(dá) 采用免疫組化法，eecp 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞染色為胞漿 棕色著色，陰性細(xì)胞不著色。對(duì)照組全部 15 例癌旁正常組織結(jié)果為陰性（圖 1a、80b）。15 例乳腺癌組織中，12 例腫瘤細(xì)胞胞漿染色強(qiáng)陽(yáng)性，呈彌漫性分布(圖 1c、 d)；1 例結(jié)果為陰性；2 例結(jié)果不確定。這表明 eecp 蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)顯 著增加。1.ac8590bd95100105圖 1.乳腺組織中 eecp 蛋白的表達(dá)。采用免疫組化法，癌旁正常組織細(xì)胞中 eecp 蛋白染色（a,b），400， 乳腺癌腫瘤組織中 eecp 蛋白染色（c,d），400。figure1.expression of eecp in breast tissues by ihc. eecp in corresponding adjacent normal breast tissues(a,b) ,400, in breast cancer tissues(c,d) , 400.2.2 血漿中 eecp 蛋白含量 對(duì)照組健康或乳腺良性增生女性血漿中 eecp 蛋白濃 度為 3.70.48 ng/ml，乳腺癌患者血漿中 eecp 蛋白濃度為 13.381.37 ng/ml。eecp 蛋白在乳腺癌患者血漿中的濃度顯著升高（p0.01）（圖 2）。2.eecp血漿 中 的 含量 （ng/ml)2015 *1101050對(duì)照組(n=71) 乳腺癌(n=130)115圖 2.eecp 蛋白在血漿中的含量。* p0.01figure 2.eecp protein conentration in the plasm by elisa. * p0.011201251301353.討論乳腺癌是威脅女性健康最嚴(yán)重的疾病之一，發(fā)病率和死亡率都很高。近年來(lái)， 在乳腺癌診斷、治療、術(shù)后療效評(píng)價(jià)方面，發(fā)現(xiàn)了一些標(biāo)志物。如，對(duì) muc1 基因的相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物 ca15-3 和 ca27-29 的檢測(cè)，可作為檢測(cè)乳腺癌術(shù)后有 無(wú)復(fù)發(fā)及治療效果的一種方法，但是它們特異性和敏感性尚不能達(dá)到人們的期望 6?！癶er-2/neu”基因是侵襲性乳腺癌的標(biāo)志物7。它在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)， 提示腫瘤具有侵襲性，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，對(duì) tamoxien 治療效果差,對(duì)非蒽環(huán)類(lèi)為基 礎(chǔ)藥物的化療方案不敏感。針對(duì) her-2 基因擴(kuò)增的病人，已經(jīng)研發(fā)出了免疫治療 藥物 herceptin。可是只有大約 25-30%的乳腺癌患者才有該基因的擴(kuò)增，這就極 大的限制了適用人群8。因此尋找新的、更特異，更敏感的乳腺癌相關(guān)基因，在 全球范圍內(nèi)具有重要的科學(xué)意義、社會(huì)意義和重大的經(jīng)濟(jì)效益。我們發(fā)現(xiàn)的eecp基因與國(guó)外報(bào)道的zg16b基因（pauf；hrpe773；gene id124220）非常相似。zg16b定位于染色體16p13.3，mrna含有846個(gè)堿基，編碼的 蛋白質(zhì)含有208個(gè)氨基酸，分子量為25kd。eecp與zg16b相比：eecp定位于染色體12.3，兩者在染色體的位置有細(xì)微差異，blast的序列比對(duì)表明它們的mrna序列 有極高的同源性（s1400,e0），特別是兩者的編碼序列完全一致，編碼的蛋 白質(zhì)氨基酸序列相同。我們推測(cè)eecp與zg16b可能是同一個(gè)基因。2009年，kim sa, et al使用基因芯片研究胰腺癌相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)與zg16b同源的基因pauf9，mrna含有721個(gè)堿基，編碼的分泌性蛋白pauf含有196個(gè)氨基140145150酸，分子量約為25kd。pauf與eecp/zg16b相比，前者的5端序列明顯較短，少編碼12個(gè)氨基酸。pauf在正常細(xì)胞系中不表達(dá)，在正常胰腺組織中表達(dá)很低；但 是在胰腺癌細(xì)胞系，胰腺癌組織及胰島細(xì)胞中顯著高表達(dá)。pauf高表達(dá)，通過(guò)激 活erk、jnk和akt信號(hào)通路，以及上調(diào)趨化因子受體crcx4，從而提高胰腺癌細(xì)胞 生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力10, 11。eecp與pauf同源性較高，都是從外分泌腺的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)，本次研究也表 明eecp蛋白在乳腺癌患者的組織和血漿標(biāo)本中顯著高表達(dá)。我們推測(cè)：eecp可能 是一個(gè)乳腺癌相關(guān)基因，并且可能是一個(gè)潛在的腫瘤血清標(biāo)志物。在以后的研究 中，我們將繼續(xù)研究eecp蛋白在乳腺癌中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，及與臨床指 標(biāo)的關(guān)系，探索其在乳腺癌治療、預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用。參考文獻(xiàn) (references)1551601651701 jemal a, siegel r, ward e, et al. cancer statistics, 2007j. ca cancer j clin, 2007,57(1):43-66.2 何丹丹, 趙立昀, 周潔, 等. 1993 2007 年上海市閔行區(qū)惡性腫瘤發(fā)病死亡分析j. 中國(guó)腫瘤,2011,(12):897-902.3 何丹丹 , 王春芳 , 曹莉莉 , 等 . 上 海 市 閔 行 區(qū) 女 性 乳 腺 癌 發(fā) 病 流 行 趨 勢(shì) 分 析 j. 中國(guó)腫瘤 ,2010,(02):108-110.4 shen kw, wu j, lu js, et al. fiberoptic ductoscopy for patients with nipple dischargej. cancer,2000,89(7):1512-9.5 casiano ca, mediavilla-varela m, tan em. tumor-associated antigen arrays for the serological diagnosis of cancerj. mol cell proteomics, 2006,5(10):1745-59.6 gion m, mione r, leon ae, et al. ca27.29: a valuable marker for breast cancer management. a confirmatorymulticentric study on 603 casesj. eur j cancer, 2001,37(3):355-63.7 sahin aa. biologic and clinical significance of her-2/neu (cerbb-2) in breast