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第四節(jié) 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,一.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。 進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸序列相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾等。 例1 鐮刀形貧血病(一種血紅蛋白分子病) 患者血紅細(xì)胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S, hemoglobin - sickle） 它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化 （Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基 使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血(導(dǎo)致貧血) 這說明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性,例2 一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活 體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時(shí)，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿印?胰島素的激活：胰島素，在剛合成時(shí)，是一個(gè)比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原 前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號(hào)肽. 信號(hào)肽被切去，剩下的是胰島素原。 胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當(dāng)C肽被切除后才成為有51個(gè)殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.,例3 血液凝固與氨基酸序列的局部斷裂,在動(dòng)物體內(nèi)的某些生物化學(xué)過程中，蛋白質(zhì)分子的部分肽鏈必須先按特定的方式斷裂，然后才呈現(xiàn)生物活性。蛋白質(zhì)分子的這一特性具有它的重要生物學(xué)意義。它是在生物進(jìn)化過程中發(fā)展起來的，是蛋白質(zhì)分于的結(jié)構(gòu)與功能具有高度統(tǒng)一性的表現(xiàn)。,1.血液凝固的生物化學(xué)原理,血液凝固是一系列復(fù)雜的生物化學(xué)過程。這一過程的主要環(huán)節(jié)有二：一是血漿中的凝血酶原受到血漿和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶(thrombin)；二是血漿中的纖維蛋白原在凝血酶的激活下轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白(fibrin)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使血液變成凝膠。,凝血酶原是一種糖蛋白。在凝血酶原致活物的催化下，凝血酶原分子中的二個(gè)肽鍵(Arg274-Thr275和Arg323-Ile324）發(fā)生斷裂，釋放出分子量力32000的氨基末端片段形成有活性的凝血酶。 凝血酶由二條肽鏈通過一個(gè)二硫鍵交聯(lián)而成，一條肽鍵（A鏈)含49個(gè)殘基，另一條肽鍵含259個(gè)殘基。,纖維蛋白原分子長(zhǎng)46nm，分子量為340 000，屬纖維狀蛋白質(zhì)。每一分子含6條肽鏈，這6條肽鏈兩兩相同，分三種類，分別稱為鏈(含600個(gè)殘基左右)、鏈(461個(gè)殘基)和鏈(410個(gè)殘基)。整個(gè)分子由對(duì)稱的兩部分組成，6條肽鏈的N末端部分集中在中間。纖維蛋白原分子共含29個(gè)二硫鍵，6條肽鏈由這些二硫鍵交聯(lián)成一個(gè)整體分子。肽鏈的氨基酸之間有順序同源現(xiàn)象。,纖維蛋白原一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖,纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的過程是在凝血酶的作用下，從二條鏈和二條鏈的N末端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵(Arg-Gly-)，釋放出二個(gè)纖維肽A和二個(gè)纖維肽B。 A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)了纖維蛋白分子的直線聚合和側(cè)向聚合，從而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維蛋白。電子顯微鏡觀察表明，纖維蛋白單體的聚合是按1/2錯(cuò)位的方式進(jìn)行的。,例4 同源蛋白質(zhì) 同源蛋白質(zhì)：指在不同生物體中實(shí)現(xiàn)同一功能或相似功能的蛋白質(zhì)。同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近. 例：細(xì)胞色素C（位于線粒體中） 60 個(gè)物種中，有 27 個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基. 可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素 C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系越近，氨基酸差異少，反之則反（進(jìn)化樹）.,黃色： 不變殘基（invariable residues） 藍(lán)色 ： 保守氨基酸（conservative residues） 未標(biāo)記：可變殘基（variable residues）,二.蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能的關(guān)系 別構(gòu)效應(yīng)（allosteric effect）：又稱變構(gòu)效應(yīng)，是指寡聚蛋白與配基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性改變的現(xiàn)象。 可分為同促效應(yīng)（正協(xié)同性、負(fù)協(xié)同性）和異促效應(yīng)。它是細(xì)胞內(nèi)最簡(jiǎn)單的調(diào)節(jié)方式。 例：血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng) 一個(gè)亞基與氧結(jié)合后，引起該亞基構(gòu)象改變 進(jìn)而引起另三個(gè)亞基的構(gòu)象改變 整個(gè)分子構(gòu)象改變 與氧的結(jié)合能力增加,第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分離、純化和表征,一.蛋白質(zhì)的分子大小 蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對(duì)分子質(zhì)量大于6 000。最高可達(dá)40 000 000（煙草花葉病毒）。 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定方法 1.根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量 此法首先利用化學(xué)分析方法測(cè)定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個(gè)分子或原子，據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對(duì)分子質(zhì)量： 最低相對(duì)分子質(zhì)量（已知成分的相對(duì)分子、原子質(zhì)量）/已知成分的百分含量 如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一個(gè)單位，則真實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量等于最小相對(duì)分子質(zhì)量的倍數(shù)。 2.沉降速度法（超離心法） 在60 00080 000r/min的超速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng) 用光學(xué)方法（依折射率變化）測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度 蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān),沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，用s表示。 一個(gè)s單位，為110-13秒,用S表示 相對(duì)分子質(zhì)量越大，s值越大 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1200S 由沉降系數(shù)s可根據(jù)斯維得貝格Svedberg方程(P296)計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量。 3.凝膠過濾法(原理見P303) 凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如交聯(lián)葡聚糖，商品名：Sephadex 一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外 洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來，洗脫體積大 只能測(cè)定球形pro，不能測(cè)定線形的或與凝膠能發(fā)生吸附作用的pro,測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve 以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（logMr）對(duì)Ve作圖，得出標(biāo)準(zhǔn)直線 再測(cè)出未知樣品洗脫體積Ve 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量,4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑 普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、形狀、大小） 用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理 蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物 不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比相同（每2分子AA殘基結(jié)合1分子SDS） 不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象（雪茄煙狀） 用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的相對(duì)遷移率（樣品遷移距離/前沿染料遷移距離,R ）作圖(lgMr=a-bR) 測(cè)出待測(cè)樣品的遷移率 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量,影響遷移率的主要因素 凝膠的分子篩效應(yīng)對(duì)長(zhǎng)短不同的棒形分子會(huì) 產(chǎn) 生不同的阻力主要因素 凝膠的濃度和交聯(lián)度 同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動(dòng)快，遷移率大。相對(duì)分子質(zhì)量大者，遷移率小 優(yōu)點(diǎn)：快速，樣品用量少，可同時(shí)測(cè)幾個(gè)樣品 缺點(diǎn)：誤差大，約為10（誤差主要來源于遷移距離的測(cè)量誤差） 此方法只能測(cè)得 亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量 二. 蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象 蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)(Isoelectric point， pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最?。捎糜趐ro的純化），在電場(chǎng)中不移動(dòng)。 在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Protein Electrophoresis)。,蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。,三.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 四.蛋白質(zhì)的沉淀作用 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。 改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)。 在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。,1.可逆沉淀 (1)在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 (2) 在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。 (3)可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法（短時(shí)間）等。 鹽溶（salting in）：指中性鹽增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象。 鹽析：指向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集的 可逆性沉淀的現(xiàn)象。 2.不可逆沉淀 (1)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。 (2)由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。 (3)如加熱沉淀（制豆腐）、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀（豆?jié){解毒）和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。 五.蛋白質(zhì)的變性 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性.,變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等。,六.蛋白質(zhì)的紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強(qiáng)的吸收。 利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。 七.蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 1.雙縮脲反應(yīng)： 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的復(fù)合物 含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣的反應(yīng) 肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深 受蛋白質(zhì)特異性影響小 蛋白質(zhì)定量測(cè)定；測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度,2.米倫氏反應(yīng) 酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)） 米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色 3.乙醛酸反應(yīng) 在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成 色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)） 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸 明膠中不含色氨酸 4.坂口反應(yīng) 精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)） 精氨酸與-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸 定量測(cè)定精氨酸,5.茚三酮反應(yīng) 靈敏度不高 6.黃蛋白反應(yīng) 濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng) 生成黃色化合物 指甲、皮膚、毛發(fā) 7.考馬斯亮藍(lán)G-250 本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色 與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高（595nm,11000微克/毫升）,本章小節(jié),蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用：功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白 蛋白質(zhì)的組成（元素組成、化學(xué)組成）及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類及名稱（三字縮寫符） 氨