目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建-2.ppt

生物工程專業(yè)核心課程,基 因 工 程,華東理工大學(xué) 張惠展,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的基本原理,基因工程所需的基本條件,基因工程的操作過(guò)程,目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,大腸桿菌基因工程,酵母基因工程,哺乳動(dòng)物基因工程,高等植物基因工程,5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,C PCR法,B cDNA法,A 鳥槍法,D 化學(xué)合成法,E 基因文庫(kù)的構(gòu)建,5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 一般來(lái)說(shuō)，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫(kù)，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫(kù)中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。,A 鳥槍法,5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,鳥槍法操作的改進(jìn),鳥槍法克隆目的基因的局限性,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過(guò)快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,染色體DNA的切斷,超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端,全酶切： 片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，,大小不可控,部分酶切： 片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整,與載體連接,如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載,體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體,如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為,轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞,受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá),的受體細(xì)胞,篩選含有目的基因的目的重組子,菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）,鳥槍法操作的改進(jìn),使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率,使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA,鳥槍法操作的改進(jìn),例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接,在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離,2.0 kb,1.6 kb,1.8 kb,鳥槍法操作的改進(jìn),凍融法 濾紙法 吸附法 低融點(diǎn)凝膠法 溶解法,凝膠DNA片段回收技術(shù),鳥槍法克隆目的基因的局限性,工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí),不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu),B cDNA法,5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,cDNA法分離目的基因的基本程序,cDNA法法克隆目的基因的局限性,cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,mDNA,cDNA第一鏈的合成,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,cDNA第一鏈,引物,退火,逆轉(zhuǎn)錄酶,dNTPs,cDNA第二鏈的合成,煮沸,NaOH,自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA 5端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失,AAAAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTT,OH 3,Klenow,dNTPs,S1,cDNA第二鏈的合成,DNApol dNTPs,RNaesH,置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAp 5,5,S1,AAAATTTOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,5,TTTTTTTTTTTTTTOH 3,AAAAAAAAAAAAAA 5,5,TTTTTTTTTTTTTT 3,3,T4-DNA ligase,cDNA第二鏈的合成,dCTP,TdT,引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列,AAAAAOH 3,TTTTTp 5,3 HO,AAAAACCCCCCCOH 3,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,AAAAAOH 3,NaOH,退火,Klenow,dNTPs,cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,雙鏈cDNA的克隆,雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：,平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無(wú)法回收,平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組,分子可通過(guò)加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段,加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收,cDNA法分離目的基因的基本程序,完備分離程序,提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子 篩選時(shí)，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等,cDNA法分離目的基因的基本程序,特異分離程序,提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆 特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等,cDNA法分離目的基因的基本程序,差異分離程序,利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能,差異分離程序,多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞,正常的FR3T3細(xì)胞,總mRNA,總mRNA,cDNA,雙鏈cDNA,單鏈cDNA,提取mRNA,合成cDNA,合成第二鏈,克隆,提取mRNA,共價(jià)交聯(lián),上柱,原位雜交,病毒誘導(dǎo)表達(dá)的基因 cDNA克隆,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu),細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短,mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感，,分離純化困難,僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因,C PCR法,5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶,鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序,使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的,基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必,需的雙引物,PCR法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理,目的基因,5,變性,加熱,引物,退火,底物,聚合,5,5,加熱,變性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加熱,變性,引物,退火,底物,聚合,由Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門aq DNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆,PCR克隆目的基因的基本程序,5,5,A,A,T,T,5,5,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,T 載體,T7,lacZ,MCS,ori,Apr,D 化學(xué)合成法,5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,化學(xué)合成的單元操作,DNA化學(xué)合成的用途,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,全基因合成,化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：,小片段粘接法：,混合退火,根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段,T4-DNA連接酶連接,克隆入合適的載體,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,全基因合成,補(bǔ)釘延長(zhǎng)法：,混合退火,根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長(zhǎng)的單鏈DNA中片段,T4-DNA連接酶連接,克隆入合適的載體,Klenow酶聚合,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,全基因合成,大片段酶促法：,混合退火,根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長(zhǎng)的單鏈DNA片段,T4-DNA連接酶連接,克隆入合適的載體,Klenow酶聚合,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,全基因合成,上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對(duì)較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,探針等寡聚核苷酸合成,在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸,序列，而基因序列未知，此時(shí)需要從已知的氨基酸序列推測(cè)為其,編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到,的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子,由于大多數(shù)氨基酸擁有簡(jiǎn)并密碼子，故在探針序列的設(shè)計(jì)時(shí),必須考慮下列問(wèn)題：,生物體對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的偏愛性，合成系列探針,探針應(yīng)具有足夠的長(zhǎng)度，通常在17-20個(gè)核苷酸之間,探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補(bǔ)區(qū)域,化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略,探針等寡聚核苷酸合成,某段連續(xù)的氨基酸序列,Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile,所有可能的DNA序列,TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA,C T GATG G G T T,C,CGA,CGG,CGT,CGC,設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并探針序列,TGTATGGACGAIATGA,TGTATGGATGAIATGA,TGCATGGACGAIATGA,TGCATGGATGAIATGA,A,G,此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行傾向性簡(jiǎn)并序列設(shè)計(jì),expressed sequence tag,化學(xué)合成的單元操作,化學(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。 從反應(yīng)機(jī)理上來(lái)講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過(guò)程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計(jì)的,化學(xué)合成的單元操作,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,DMT： 二甲氧基三苯甲基,激活,縮合,氧化,脫取代基,玻璃珠,連接臂,DNA化學(xué)合成的用途,合成天然基因,修飾改造基因,設(shè)計(jì)新型基因,制備探針、引物、接頭,如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素,如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等,基因等,E 基因文庫(kù)的構(gòu)建,5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建,基因文庫(kù)的基本概念,基因文庫(kù)的構(gòu)建程序,基因組文庫(kù)重組克隆的排序,基因文庫(kù)的基本概念,基因庫(kù)與基因文庫(kù),基因庫(kù)（gene pool）,特定生物體全基因組的集合（天然存在）,基因文庫(kù)（gene library or gene bank）,從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式,基因組文庫(kù)（含有全部基因）,存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為：,cDNA文庫(kù)（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）,基因文庫(kù)的基本概念,基因文庫(kù)構(gòu)建的基本戰(zhàn)略,用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，材料來(lái)自染色體DNA,用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫(kù)，材料來(lái)自mRNA,在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA,種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫(kù),一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫(kù)或胚胎組織cDNA,文庫(kù)等。很顯然， cDNA文庫(kù)的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù),基因文庫(kù)的基本概念,基因文庫(kù)的完備性,基因文庫(kù)的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概,率，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：,N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ),其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫(kù)中）的概率,f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小,例如，人的單倍體DNA總長(zhǎng)為2.9 x 109 bp，基因文庫(kù)中克隆片段,的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.9的基因文庫(kù)至少需要,45萬(wàn)個(gè)克?。欢?dāng)完備性提高到0.9999時(shí)，基因文庫(kù)至少需要180,萬(wàn)個(gè)克隆,基因文庫(kù)的基本概念,基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備下列條件：,重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大 以減輕篩選工作的壓力,載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度 避免基因被分隔克隆,克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域 以利克隆排序,克隆片段易于從載體分子上完整卸下,重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選,基因文庫(kù)的構(gòu)建程序,基因組DNA的制備,為了最大限度地保證基因在克隆過(guò)程中的完整性， 用于基因組,文庫(kù)構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過(guò)度的斷裂。制備的,DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段,的比率就越低，重組率和完備性也就越高,用常規(guī)方法制備的染色體,DNA的長(zhǎng)度一般在100 kb左右,如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝,膠中，然后置入含有SDS、蛋,白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的DNA片段,基因文庫(kù)的構(gòu)建程序,基因組DNA的切割,用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和,限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：,第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū),第二，保證DNA片段大小均一,超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭,部分酶切法一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶，如：,Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控,連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí),分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！,基因文庫(kù)的構(gòu)建程序,載體和受體的選擇,出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的,l-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用YAC或BAC載體,l-DNA,由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建的載體,通常選質(zhì)粒,上述幾種載體的最大裝載量如下：,質(zhì)粒,考斯質(zhì)粒,15 kb,25 kb,45 kb,BAC,300 kb,YAC,400 kb,用于基因文庫(kù)構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌,基因文庫(kù)的構(gòu)建程序,從基因文庫(kù)中篩選目的基因,大型基因組文庫(kù)一般由數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)重組克隆組成。除,了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白,編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、,酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫(kù)篩選均需多輪,操作步驟,基因文庫(kù)的構(gòu)建程序,從基因文庫(kù)中篩選目的基因,密集鋪板（1-10萬(wàn)）,雜交,挖取,鋪板,鋪板,目的重組克隆,基因文庫(kù)的構(gòu)建程序,基因文庫(kù)構(gòu)建的技術(shù)性問(wèn)題,在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，最應(yīng)引起重視的問(wèn)題是：,嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！,為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：,將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離,用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團(tuán),用TdT酶在DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端,基因組文庫(kù)重組克隆的排序,大型基因文庫(kù)（包括人的基因文庫(kù)）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個(gè)YAC基因文庫(kù)的插入片段總和為整個(gè)基因組的十倍以上時(shí)，一般就能從基因文庫(kù)中調(diào)出任何一段DNA序列。然而基因文庫(kù)的克隆都是隨機(jī)序列，必須將所有的克隆排列成一個(gè)像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項(xiàng)工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫(kù)的構(gòu)建，屬于基因文庫(kù)的后期制作,基因組文庫(kù)重組克隆的排序,將單一的YAC克隆插入DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素 然后再用Sau3AI或MboI將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個(gè)YAC克隆走在同一塊板上，形成10個(gè)克隆的特征性DNA指紋圖譜 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個(gè)YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個(gè)YAC克隆的DNA片段克隆在染色體上是排列一起的,酶切片段末端標(biāo)記法,酶切片段末端標(biāo)記法,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,單一克隆指紋圖譜,十克隆指紋圖譜,載體DNA,克隆DNA,基因組文庫(kù)重組克隆的排序,將若干YAC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成2