細胞工程-第十二章、試管動物與克隆動物.ppt

第十二章、試管動物與克隆動物,第一節(jié) 試管動物,1978年7月25日深夜時分，英國曼徹斯特郊外的奧德姆總醫(yī)院里，一個女嬰的啼哭聲劃破夜空，震撼了世界她就是世界上第一例試管嬰兒路易斯.布朗。,一、試管動物概念 將供體的精子和卵子在體外受精、體外培養(yǎng)胚胎，然后將發(fā)育到一定程度的胚胎移植入受體，可以得到各種動物。由于體外受精一般都在試管內進行，所以稱為“試管動物”。也有稱為“體外受精動物”。,二、試管動物的培育流程 精子的采集與體外獲能處理 卵子的回收與成熟培養(yǎng) 卵子與精子的體外受精 受精卵的體外發(fā)育 試管胚胎的移植,、精子的采集與獲能處理,精液的采取方法通常有：人工陰道法、電刺激法、陰道內回收法等。 對于個體較大的動物多采用人工陰道法，而對于小動物而言多采用電刺激法采精。,人工陰道法,人工陰道法是由橡膠制造的雙層圓筒，兩層之間充以溫水（3840），后端有精液收集管以軟橡膠膜袋與人工陰道相連。對于公牛而言，一般多應用臺畜使爬上，將假陰道自側面套在公牛陰莖上，使其射精。在公豬可以用豬用假陰道收集精液或用手握法采精，但仍需要臺畜，使其爬上以遍進行操作。 另外，也可以用特制的電極，插到公畜的直腸內，根據不同畜種給予不同的電流刺激，經過不同的時間，即可射精而得到精液。,精液的保存,精液的保存可以分為常溫（1525）、低溫（05）和超低溫冷凍（79-196）三種，其目的是要降低精子的代謝活動，延長其存活時間，盡量保存其受精能力。 保存前，要加稀釋液，其成分按其作用可分為稀釋劑、營養(yǎng)劑和保護劑等。 稀釋劑包括等滲氯化鈉溶液和某些鹽溶液， 營養(yǎng)劑包括糖類、奶類和卵黃等， 保護劑包括有抗凍作用的營養(yǎng)劑和其它一些如甘油、DMSO、糖類等。,三種保存方法,常溫保存主要通過降低pH值達到抑制精子的代謝活動，一般可以保存2天以上。 低溫保存主要是抑制其正常的代謝活動，除豬外，其它家畜的保存效果均較好。 如果應用超低溫可以在液氮中長期保存精液，用時可以即時解凍。 對于不同的動物，各種保存液的配制方法都有所差異的。,人為使得精子獲能,可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道獲能沒有種屬特異性，因而可以由屠宰場取任何的動物的子宮或在實驗室內取小動物的子宮給所需動物的精子獲能。 另外，可以利用人工配制的培養(yǎng)液使得精子獲能。,、卵子的回收與成熟培養(yǎng),人工采卵是得到卵母細胞的方法通常利用激素進行誘導采卵或超數(shù)采卵?？梢岳么傩韵偌に鼗螯S體激素釋放激素（LHRH），對小鼠、大鼠和兔子等動物進行一次性投與誘發(fā)其排卵，排卵數(shù)目不變。 以小鼠為例，通?？捎?5IU PMSG或23IU hCG或100g FSH 或100gLH或0.020.05g LHRH皮下或腹腔內注射，1214小時可以有70100正常排卵。,采卵,（）輸卵管內采卵：以鼠為例，一般為了防止干燥可將屠殺后取出的輸卵管放在平皿內，用石蠟油覆蓋，在實體顯微鏡下找到輸卵管膨大部，用磨尖的鐘表鑷子，切開輸卵管膨大部，使內容物溢出而找到卵。 （）對于稍大一些的動物可以用活體輸卵管采卵，例如將兔子的腹部正中線切開，找出子宮角和輸卵管。然后利用逆向沖卵法，自子宮輸卵管連接處插入注射針，傘部以平皿接著沖洗；或在子宮輸卵管連接處下1cm處，剪成V形小口，插入塑料細管，自傘部輸卵管腹腔口插入，將液體推入，得到沖出的卵。,（3）對于屠宰場中的大中型動物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手術后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 （）對人而言通常在超數(shù)排卵步驟處理后，用B超檢測卵巢表面卵泡發(fā)育情況，然后，在腹腔后部體壁進行局部麻醉，將腹腔鏡望遠鏡插管插入，以觀察卵巢表面卵泡成熟情況，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵針將卵吸出，放平皿中檢查。,卵母細胞一般檢測,得到卵母細胞后，可根據卵泡發(fā)育的不同時期，在顯微鏡下檢查核和胞質發(fā)育的狀況，如核的形態(tài)、位置和所處的時期。 排出的卵母細胞，有多層卵丘細胞包圍，除去卵丘細胞后，可以見到卵周隙增大，內有第一極體，核處于第二次成熟分裂中期。 多數(shù)實驗動物的卵母細胞胞質呈透明狀，但由于胞質中富含大量脂滴和空泡，所以在鏡下呈暗色。 各種不同的動物，按照不同的分類標準，卵的分類可以分為優(yōu)秀、普通、不良和異常卵。 進行體外受精的卵母細胞，一般以卵丘卵母細胞復合體外面完整地包有34層卵丘細胞，卵母細胞胞質無斑塊者為佳。,鏡檢卵母細胞,如果新鮮或固定后要作整體觀察，可以取凡士林石蠟（1：1）融化后滴于載片中部四角，在鏡下用微吸管自平皿中吸取卵母細胞，滴到4滴凡士林石蠟滴的中央，蓋上蓋片并輕壓之，即可置于相差顯微鏡下觀察。 如果要觀察細節(jié)，需要染色、切片后觀察。一般在卵固定后水洗染色，用瓊脂與石蠟進行雙重包埋，最后進行切片、脫臘和封固，進行觀察。,、體外受精,1951年Chang和Austin發(fā)現(xiàn)了精子的獲能現(xiàn)象，為體外受精的實現(xiàn)打開了通路。 1954年，Thibault等獲得第一只體外受精的兔子。隨著研究深入，試管老鼠、試管豬、試管牛等相繼產生。 1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“試管嬰兒”，至此，體外受精技術逐漸成熟。,過程,獲得獲能的精子和成熟的卵母細胞后，應在塑料平皿底部，用已經處理獲能的精子浮游液5l精子浮游液，注入小滴中，將成熟培養(yǎng)后的卵母細胞，或自體內手術沖出的卵母細胞，以BO液沖洗，用微吸管吸10個卵母細胞與少量BO液注入精子浮游液小滴中。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7小時后再經微量吸管自小滴中用BO液多次沖洗以洗去多余的精子。然后移入發(fā)育培養(yǎng)液（TCM19910FCS）繼續(xù)培養(yǎng)。,顯微操作協(xié)助受精,在顯微操作儀下進行顯微受精，即對哺乳動物的精子和卵母細胞，進行顯微操作，促使其相互結合技術，這可以解除透明帶和質膜對精子的阻擋作用。 1976年，Uehara和Yanagimachi將倉鼠或人的精子在顯微操作儀下，通過顯微工具，注射到倉鼠卵母細胞的細胞質中，使精子核在卵胞質中染色體解螺旋形成了原核。隨后，又深入研究了操作技術，分成了卵胞質內精子注射、透明帶下注射、透明帶鉆孔和透明帶部分切口等幾種。,卵母細胞質內注射,卵母細胞質內注射，是將整個精子或精子頭部直接注射到卵母細胞質內。要求注射針的尖端必須鋒利，注射吸管內徑通常為510m，并盡量避免液體進入卵胞質。此方法可以使任何類型的精子如精子頭形不正常、死精子或嚴重缺陷的精子等，可省去獲能和頂體反應。 還可以將1個或多個精子注入透明帶下，可以一步直接將精子注射到卵周隙，也可以先將透明帶鉆孔或部分切口后，再進行精子注射。使用的精子應該是獲能和發(fā)生頂體反應的。當然，當注射多個精子時可能發(fā)生多精受精現(xiàn)象。,單精子卵胞漿內顯微注射,其它一些方法,如果在透明帶上人為鉆孔后，可以為精子入卵提供機會，或者是易于精子入卵?？梢韵扔霉潭ㄎ芄潭ㄗ÷?，然后將吸滿酸性臺氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切線方向往透明帶上射出穩(wěn)定的液流。當透明帶上溶出小孔后，即可撤走注射針。將卵洗滌后，再用適當密度的精子進行受精。 先用胰麋蛋白酶軟化透明帶，然后用纖細的針在透明帶上扎針孔，本法適用于精子運動乏力或少精癥不育患者的治療。通過該技術已經使得小鼠獲得了超過30的妊娠或出生率，而且并沒有增加孤雌活化率和多精受精率。 另外，可以用微細玻璃針或金屬微刀片，在透明帶上切開或挑開或撕開一個口，再經適當濃度精子受精。,、受精卵的體外發(fā)育,受精卵需在培養(yǎng)液（或輸卵管）中發(fā)育到桑葚胚或囊胚后移植到受體，才能獲得較高的妊娠率。 目前體外培養(yǎng)的哺乳動物早期胚胎（受精卵）主要障礙是發(fā)育阻滯。,為了克服阻滯現(xiàn)象，有助于產生高質量的桑差或囊胚胚胎，主要采取以下方法：利用臨時中間受體，即把牛體外受精卵放人結扎的中間受體兔或綿羊的輸卵管中，培養(yǎng)至桑葚胚或囊胚，再移植到受體或冷凍保存。此方法優(yōu)點是胚胎質量高，能耐受冷凍保存。但操作過程復雜，胚胎丟失嚴重，不適合胚胎的大批量生產。Yadav等研究發(fā)現(xiàn)，同源或異源輸卵管細胞共同培養(yǎng)都能顯著提高水牛早期胚胎的卵裂和發(fā)育。利用體細胞在體外與受精卵共同培養(yǎng)，促進胚胎發(fā)育，獲得了較高的囊胚發(fā)育率。Brackett等在復雜的血清添加培養(yǎng)液(TCM199十血清)中加入體細胞共培養(yǎng)獲得40 的牛囊胚發(fā)育率,、試管胚胎的移植,參照胚胎工程,三、試管動物的研究意義,可以用來研究受精機理， 治療人類男性和動物的生殖不育， 可以利用體外受精卵的發(fā)育狀況或染色體核型檢測用來檢測形態(tài)不正常精子其染色體是否正常， 可以產生大量的動物個體， 還可以簡化煩雜的凍精技術，或許只保存核物質，就可以達到受精的目的，這對保護珍貴的動物資源，將起到重要的作用。,第二節(jié)、克隆動物 通過無性繁殖的手段，獲得的遺傳背景一致的動物群體。,一、概念,是指遺傳上完全相同的分子、細胞或來自同一祖先的生物個體的無性繁殖群體。 關鍵技術核移植。,二、克隆程序 核供體動物的選擇與細胞核的獲得。 核受體動物的選擇與細胞核的移出。 供體核的移入及原核的取出。 胚泡的體外試管培養(yǎng)。 代母的選擇與胚泡移入子宮。 克隆動物的體內發(fā)育與出生。,最早培育出的克隆動物,1952年，美國人羅伯特布里格斯和T.J.金對豹蛙發(fā)育到胚囊期的胚胎細胞做移核試驗，成功地獲得了一個可以攝食的豹蛙幼體。 1958年到1962年，英國劍橋大學利用爪蟾原腸內胚層細胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。,里程碑式的突破,1996-1997年首只體細胞克隆動物“多莉”羊的成功證明了成熟的體細胞也具有全能性。,多莉培育者之一 伊斯維姆.穆特,三、應用與意義 （1）檢驗動物細胞全能性 （2）加速動物繁殖、優(yōu)良育種、 保護珍貴動物。 （3）克隆動物的遺傳背景相同，因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實驗材料，具有良好的穩(wěn)定性和重復性。 （4）可以用患者本人細胞培育出新組織。,四、 克隆人,、克隆人制備過程,將普通的男性細胞或者是主體細胞和一枚女性卵子結合起來，儲存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除。通過細胞分裂形成的胚胎應只帶有這名男性的全部遺傳信息，最后將胚胎移植到女性子宮中，獲得男性克隆后代。 當然，如果一對夫婦愿意的話，也可以克隆女性。,克隆的人類胚胎,ACT公司的研究人員將一枚卵細胞中的DNA全部剔除，然后用一枚成年人皮膚細胞中的細胞核替代上述DNA，由于這個卵細胞事先經過受精，所以開始自然分裂，但它并沒有發(fā)育成一個嬰兒，而是演變成干細胞，研究人員得到3個早期胚胎，其中兩個發(fā)育到4細胞階段，另一個至少發(fā)育到6細胞階段。 由于這證明人體單個細胞的遺傳物質能被誘導發(fā)育成為幼胚胎，因此這項研究被認為是向著克隆人的方向邁出了關鍵一步。,但他們強調：不會制造用于生育目的的胚胎，他們的研究是為了幫助病人。威斯特將這一成果稱為走向醫(yī)學新時代的“蹣跚第一步”，是治療性克隆研究中的重大突破，將幫助研究人員找到治療帕金森綜合征、糖尿病和早老性癡呆等疾病的方法。,、克隆人最新進展,2003年1月第1個克隆人？ 11月26日，安蒂諾里在羅馬再次引爆了輿論炸彈。他在記者招待會上透露：一名懷有克隆胚胎的婦女已懷孕33周。B超顯示，胎兒為男性，目前重約2.7公斤，發(fā)育良好。如果一切順利的話，世界上第一個“克隆人”將于年1月的第一個星期誕生。,3、有關克隆動物與人存在的問題,（1） 技術尚不成熟,得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今為止，克隆試驗的成功率始終很低。例如，在培育多莉的過程中，科學家共克隆出 個綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產的只有多莉一個。 目前，多莉羊的制備還不能重復，更不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動物或其它不同組織器官的細胞。,（2） 遺傳、疾病問題,克隆動物夭折率高，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大。 克隆動物沒有遺傳物質的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。,（3） 社會、倫理學問題 一個例子人+動物,中山醫(yī)科大學陳系古教授等于2001年1月以來，先后使用“核移植”技術，將人類皮膚細胞核移植到家兔卵母細胞中，經過多次實驗，成功克隆出多個人類胚胎，其中部分發(fā)育到“桑葚胚”階段。這是國際上首次用該技術克隆出人類胚胎。 但有些學者就對在家兔卵母細胞中克隆出人類胚胎的提出質疑，認為這是違背人類倫理的“科學”實驗。,聽一聽：關于克隆人的爭論,贊同的,迄今為止，公開宣稱要進行克隆人的只有3家： 一個是意大利婦科專家安蒂諾利。 一個就是在美國開公司的法國女科學家布利吉特布瓦瑟利耶。 一個是美國專家扎沃斯。,意大利醫(yī)生 安蒂諾里 克隆人的帶頭人,冒死也要克隆人的科學家布瓦瑟利耶,反對的,“多利羊”之父反對克隆人,中國日報網站消息：被譽為“多利羊”之父的英國科學家威爾穆特1月4日稱，“多利羊”感染了早期關節(jié)炎，哺育動物的克隆安全問題再度受到質疑。威爾穆特呼吁，反對任何克隆人的計劃。 “我認為，已經有足夠的證據表明，克隆人的行動是完全不負責任的?！彼f，克隆技術目前還存在很多不確定因素，他們在對動物進行實驗時經常遇到大量畸形或異常情況，因此克隆技術目前不適合用于人類。,任何克隆動物都有基因上的缺陷。 克隆羊和克隆牛都有體形過度龐大的問題。該缺陷在克隆鼠身上也存在