GB 5413.14-2010發(fā)布稿 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定 發(fā)布稿.pdf

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.142010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12的測(cè)定 National food safety standard Determination of vitamin B12 in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.142010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 5413.14-1997嬰幼兒食品和乳粉 維生素B12的測(cè)定。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 5413.14-1997相比，主要變化如下： 標(biāo)準(zhǔn)名稱改為嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定。 本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為規(guī)范性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.14-1997。 GB 5413.142010 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12的測(cè)定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12的測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12的測(cè)定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）對(duì)維生素 B12的特異性和靈敏性，定量測(cè)定出試樣中維生素 B12的含量。在測(cè)定用培養(yǎng)基中供給除維生素 B12以外的所有營養(yǎng)成分，這樣微生物生長產(chǎn)生的透光率就會(huì)同標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液及未知待測(cè)溶液中維生素 B12的含量相對(duì)應(yīng)。 以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的透光率相對(duì)于各濃度水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出試樣中維生素 B12的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級(jí)水。 4.1 菌株：萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830。 4.2 維生素 B12 （Vitamin B12或 Cyanocobalamin）標(biāo)準(zhǔn)品：分子式 C63H88CoN14O14P，純度99%。 4.3 培養(yǎng)基 4.3.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A。 4.3.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：見附錄 A。 4.3.3 維生素 B12測(cè)定用培養(yǎng)基：見附錄 A。 注：一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。 4.4 9 g/L 氯化鈉溶液（生理鹽水） 稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝于具塞試管，每管 10 mL。121 滅菌 15 min。 4.5 乙醇溶液：體積分?jǐn)?shù)為 25 %。 4.6 無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。 4.7 無水偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）。 4.8 檸檬酸（含一個(gè)結(jié)晶水）（C6H8O7H2O）。 4.9 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 4.9.1 維生素 B12貯備液（10 g /mL）：精確稱取維生素 B12標(biāo)準(zhǔn)品（4.2），用乙醇溶液（4.5）定容至維生素 B12濃度為 10 g /mL。 GB 5413.142010 2 4.9.2 維生素 B12中間液（100 ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）將 5.0 mL 維生素 B12貯備液（4.9.1）定容至 500 mL。 4.9.3 維生素 B12工作液（1 ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）將 5.0 mL 維生素 B12中間液（4.9.2）定容至 500 mL。 4.9.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液： 分別吸取兩個(gè) 5 mL 維生素 B12工作液 （4.9.3） 于 250mL 和 500mL 容量瓶中，用水定容至刻度。高濃度溶液的濃度為 0.02 ng/mL；低濃度溶液的濃度為 0.01 ng/mL。 注：所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲(chǔ)存于冰箱內(nèi)。4.9.1、4.9.2 和 4.9.3 保存期三個(gè)月，4.9.4 臨用前配制。 5 儀器和設(shè)備 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 5.1 天平：感量為 0.1 mg。 5.2 pH 計(jì)：精度0.01。 5.3 分光光度計(jì)。 5.4 渦旋混合器。 5.5 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.6 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 5.7 冰箱：2 5 。 5.8 無菌吸管：10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器和吸頭。 5.9 瓶口分液器：0 mL10 mL。 5.10 錐形瓶：200 mL。 5.11 容量瓶（A 類）：100 mL，250 mL，500 mL。 5.12 單刻度移液管（A 類）：容量 5 mL。 5.13 漏斗：直徑 90 mm。 5.14 定量濾紙：直徑 90 mm。 5.15 試管：18 mm 180 mm。 注： 準(zhǔn)備玻璃儀器時(shí)， 使用活性劑對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗， 清洗之后要求在 200 干熱 2 h。 6 分析步驟 6.1 測(cè)試菌液的制備 6.1.1 將萊士曼氏乳酸桿菌 （ATCC 7830） 的凍干菌株 （4.1） 活化后， 接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （4.3.1）上，36 1 培養(yǎng) 24 h。再轉(zhuǎn)種 2 代3 代來增強(qiáng)活力。置 2 5 冰箱保存?zhèn)溆?。?15 d 轉(zhuǎn)種一次。 6.1.2 將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.3.2）中，36 1 培養(yǎng) 18 h24 h，以 2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 2 min3 min，棄去上清液，加入 10 mL 生理鹽水（4.4），混勻，再離心 2 min3 min，棄去上清液，再加入 10 mL 生理鹽水（4.4），混勻。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 mL 生理鹽水（4.4），混勻。吸適量該菌懸液于 10 mL 生理鹽水（4.4）中，混勻制成測(cè)試菌液。 6.1.3 用分光光度計(jì)（5.3），以生理鹽水（4.4）做空白，于 550 nm 波長下測(cè)測(cè)試菌液（6.1.2）的透光率，使其透光率在 60 %80 %之間。 6.2 試樣的處理 GB 5413.142010 3 6.2.1 稱取無水磷酸氫二鈉 （4.6） 1.3 g， 無水偏重亞硫酸鈉 （4.7） 1.0 g， 檸檬酸 （含一個(gè)結(jié)晶水） （4.8）1.2 g，用 100 mL 水溶解。 6.2.2 稱一定量的樣品 (精確到 0.0001 g)， 含維生素 B12約 50 ng 100 ng， 用 10 mL 的上述溶液 （6.2.1）混合后，再加 150 mL 水，于 121 水解 10 min，冷卻后調(diào) pH 至 4.5 0.2，再用水定容至 250 mL，過濾。移取濾液 5 mL，加入水 20 mL30 mL，調(diào) pH 至 6.8 0.2，用水定容至 100 mL。最終溶液中維生素 B12 的質(zhì)量濃度約在 0.01 ng/mL0.02 ng/mL，偏重亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度小于 0.03 mg/mL。 6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按表 1 順序加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（4.9.4）和維生素 B12 測(cè)定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管中，一式三份。 表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 試管號(hào) S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 0.01 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（mL） 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 0.02 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（mL） 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6.4 待測(cè)液的制作 按表 2 順序加水、樣品溶液（6.2.2）和維生素 B12測(cè)定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。 表2 待測(cè)液的制作 試管號(hào) 1 2 3 4 水（mL） 4 3 2 1 待測(cè)液（mL） 1 2 3 4 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 6.5 滅菌 將 6.3 和 6.4 中所有的試管蓋上試管帽，121 滅菌 5 min（商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行滅菌） 。 6.6 接種 將上述試管迅速冷卻至 30 以下。用滴管或移液器向上述試管中各滴加 1 滴（約 50 L）測(cè)試菌液（6.1.2） （其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中空白 S1 除外） 。 6.7 培養(yǎng) 將試管放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，36 1 培養(yǎng) 19 h20 h。 6.8 測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)每支試管進(jìn)行目測(cè)檢查，未接種試管 S1 內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則測(cè)定無效。 6.8.1 以接種空白管做對(duì)照，測(cè)定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的透光率，2 h 后重新測(cè)定。兩次結(jié)果透光率差值若小于 2 %，則取出全部檢驗(yàn)管測(cè)其透光率。 6.8.2 用未接種空白試管（S1）作空白，將分光光度計(jì)透光率調(diào)到 100 %（或吸光度為 0），讀出接種空白試管（S2）的讀數(shù)。再以接種空白試管（S2）為空白，調(diào)節(jié)透光率為 100 %（或吸光度為 0），依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度）。 GB 5413.142010 4 6.8.3 用渦旋混合器（5.4）充分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，波長為 550 nm，待讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出透光率，每支試管穩(wěn)定時(shí)間要相同。以維生素 B12標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，透光率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6.8.4 根據(jù)待測(cè)液的透光率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得該待測(cè)液中維生素 B12的濃度，再根據(jù)稀釋因子和稱樣量計(jì)算出試樣中維生素 B12的含量。透光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管 S 3S 10 范圍的試樣管要舍去。 6.8.5 對(duì)每個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的試管， 用每支試管的透光率計(jì)算每毫升該編號(hào)待測(cè)液維生素 B12的濃度，并計(jì)算該編號(hào)待測(cè)液的維生素 B12濃度平均值，每支試管測(cè)得的該濃度不得超過該平均值的15 %，超過者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的總管數(shù)的 2/3，用于計(jì)算試樣含量的數(shù)據(jù)是不充分的, 需要重新檢驗(yàn)。如果符合要求的管數(shù)超過原來管數(shù)的 2/3，重新計(jì)算每一編號(hào)的有效試樣管中每毫升測(cè)定液中維生素 B12含量的平均值，以此平均值計(jì)算全部編號(hào)試樣管的總平均值為Cx。用于計(jì)算試樣中的維生素 B12含量。 注：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，既可讀取透光率（T %） ，也可讀取吸光度（A） 。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中維生素 B12的含量按公式 (1) 計(jì)算： 1001000 =fmCXx (1) 式中： X試樣中維生素 B12的含量，單位為微克每百克表示（g/100 g） ； Cx6.8.5 中計(jì)算所得的總平均值，單位為納克（ng） ； m 試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； f稀釋倍數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。 9 其他 本標(biāo)準(zhǔn)檢出限為 0.1 g/100g。 GB 5413.142010 5 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 A.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 A.1.1 成分 番茄汁 100 mL，三號(hào)蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，瓊脂 14.0 g，水 1000 mL，pH 6.8 0.1（25 5 ）。 A.1.2 制法 先將除瓊脂以外的其他成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH，再加入瓊脂，加熱煮沸至完全溶解。混合均勻后分裝試管，每管 10 mL。121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 A.2.1 成分 番茄汁 100 mL，三號(hào)蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，水 1000 mL，pH 6.8 0.1 （25 5 ）。 A.2.2 制法 先將上述成分（A.2.1）溶解于水中，調(diào)節(jié) pH，加熱煮沸，混合均勻后分裝試管，每管 10 mL。121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.3 維生素 B12 測(cè)定用培養(yǎng)基 A.3.1 成分 無維生素酸水解酪蛋白 15.0 g，葡萄糖 40.0 g，天門冬酰胺 0.2 g，醋酸鈉 20.0 g，抗環(huán)血酸 4.0 g，L-胱氨酸 0.4 g，DL-色氨酸 0.4 g，硫酸腺嘌呤 20.0 mg，鹽酸鳥嘌呤 20.0 mg，尿嘧啶 20.0 mg，黃嘌呤20.0