目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞.ppt

第五章 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,5.1 受體細(xì)胞,受體細(xì)胞(receptor cell) 又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(host cell)等，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞。,作為基因工程的宿主細(xì)胞必須具備以下特性： 便于重組DNA分子的導(dǎo)入； 能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中； 便于重組體的篩選； 遺傳性穩(wěn)定高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)； 安全性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染； 有利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累，或促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá)。 在遺傳密碼的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性； 具有較好的翻譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)； 在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。,基因工程中常用的受體細(xì)胞類型： 原核生物細(xì)胞 真核生物細(xì)胞 真菌細(xì)胞 植物細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞,原核生物細(xì)胞,優(yōu)點(diǎn)： 大部分原核生物細(xì)胞無(wú)纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA的進(jìn)入。 沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩。 原核生物多為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。 基因組小，遺傳背景簡(jiǎn)單，并且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。,缺點(diǎn)： 原核生物細(xì)胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)，即使真核生物基因能得到表達(dá)，得到的多是無(wú)特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。 原核生物細(xì)胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。 原核細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定。,至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)細(xì)菌等。 一、大腸桿菌受體細(xì)胞 大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。 優(yōu)點(diǎn)：繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)便，代謝易于控制。 缺點(diǎn)：大腸桿菌細(xì)胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。,二、枯草桿菌受體細(xì)胞 枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽(yáng)性菌。 優(yōu)點(diǎn)： 枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將具有表達(dá)的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡(jiǎn)化了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性。 枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無(wú)致病性，是一種安全的基因工程菌。 枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)。 枯草桿菌也具有大腸桿菌生長(zhǎng)迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點(diǎn)。 應(yīng)用：已成功的用于表達(dá)人的干擾素、白細(xì)胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和動(dòng)物口蹄疫病毒VPI抗原等。,三、藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻） 藍(lán)藻又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng) (PS ) 和光合系統(tǒng) (PS )、能進(jìn)行光合作用，但它又具有細(xì)菌的特征，無(wú)細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。 藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在： 基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡(jiǎn)單，便于基因操作和外源DNA的檢測(cè)。 細(xì)胞壁屬G，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。 營(yíng)光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，只需光、CO2、無(wú)機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長(zhǎng)需要。 多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。 藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無(wú)毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無(wú)毒藍(lán)藻，就可達(dá)到錦上添花的效果。,真核生物細(xì)胞,一、真菌受體細(xì)胞 真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細(xì)胞表達(dá)高等動(dòng)植物基因具有原核生物細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。 酵母菌細(xì)胞 是單細(xì)胞真核微生物，外源真核基因最理想的表達(dá)系統(tǒng)。 優(yōu)點(diǎn)： 酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的真核生物之一，其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單。 具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。 不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素。 培養(yǎng)簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。 能使外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。,二、植物受體細(xì)胞 優(yōu)點(diǎn)：全能性，即一個(gè)分離的活細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個(gè)獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。 缺點(diǎn)：植物細(xì)胞有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，不利于攝取重組DNA分子。 現(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟(jì)作物和擬南芥等模式植物。,三、動(dòng)物受體細(xì)胞： 優(yōu)點(diǎn)： 能識(shí)別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪切和加工成熟的mRNA。 真核基因的表達(dá)蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性，約為酵母細(xì)胞的1620倍。 易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性。 經(jīng)轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。 缺點(diǎn)：組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，難度較大。 目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動(dòng)物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和鼠、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要用途在于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動(dòng)物疫苗、動(dòng)物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。 常用的動(dòng)物受體細(xì)胞有小鼠L細(xì)胞、Hele細(xì)胞、猴腎細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)等。以動(dòng)物細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。,5.2.1 重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌 轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由Griffith于1928年在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的。,5.2 重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞,目 錄,細(xì)菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來(lái)自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細(xì)胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的過程。,以革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為例，細(xì)菌轉(zhuǎn)化的一種可能機(jī)制包括如下基本步驟：,細(xì)菌感受態(tài)的形成。當(dāng)轉(zhuǎn)化因子接近細(xì)菌細(xì)胞時(shí)受體細(xì)胞分泌一種小分子質(zhì)量的激活蛋白，又稱為感受因子，能誘導(dǎo)使細(xì)菌胞壁部分溶解，局部暴露出細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白和核酸酶等，此時(shí)細(xì)菌細(xì)胞處于感受態(tài)，極易接納周圍環(huán)境中轉(zhuǎn)化因子以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。,轉(zhuǎn)化因子的吸收。受體菌細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)持異性結(jié)合，然后激活鄰近的核酸酶，將雙鏈DNA分子中的一條鏈逐步降解，同時(shí)將另一條鏈逐步轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)。,整合復(fù)合物前體的形成。進(jìn)入受體細(xì)胞的單鏈DNA與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復(fù)合物前體，它能有效地保護(hù)單鏈DNA免受各種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導(dǎo)至受體菌染色體DNA處。,單鏈DNA轉(zhuǎn)化因子的整合。整合復(fù)合物前體中的單鏈DNA片段可以通過同源重組，置換受體細(xì)胞染色體DNA的同源區(qū)域形成異源雜合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。,轉(zhuǎn)化子的形成。受體菌染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段亦隨之進(jìn)行半保留復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞分裂后，該染色體發(fā)生分離，形成一個(gè)新的轉(zhuǎn)化子。,大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的正是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNA分子，而非來(lái)自供體菌的游離DNA片段(轉(zhuǎn)化因子)。 因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法之一是Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。,（1） Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法,Ca2+誘導(dǎo)DNA對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的可能原因： 在0的Cacl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時(shí)Cacl2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來(lái)，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。 Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。,該法重復(fù)性好。操作簡(jiǎn)便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)這種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每g質(zhì)粒DNA可以獲得51062l07個(gè)轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要。,Mg2+對(duì)DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細(xì)胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進(jìn)一步處理細(xì)胞，能誘導(dǎo)高頻感受態(tài)細(xì)胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高1001000倍，且對(duì)大小質(zhì)粒分子均可進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。 但該法要求條件高，對(duì)外界污染物極為敏感，通常很少采用。,DNA分子進(jìn)入大腸桿菌受體細(xì)胞的機(jī)制,一般認(rèn)為只有雙鏈閉環(huán)或開環(huán)的質(zhì)粒DNA分子才能轉(zhuǎn)化，而線形DNA分子不能獲得轉(zhuǎn)化子。因此，環(huán)狀DNA分子中混雜線形DNA分子，會(huì)影響環(huán)狀DNA分子的轉(zhuǎn)化效率。 也有人認(rèn)為吸附在受體細(xì)胞表面上的是雙鏈DNA，但卻以單鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞，這與革蘭氏陽(yáng)性菌的轉(zhuǎn)化過程相似。,轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對(duì)照處理： DNA對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.2ml無(wú)菌水代替0.2m1感受態(tài)細(xì)胞，檢驗(yàn)DNA溶液是否染菌。 感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.1mlNTE緩沖液代替0.1m1DNA溶液，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞是否染菌。 感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照處理。在0.2ml感受態(tài)細(xì)胞中加入0.1ml已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒DNA。,（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法,基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔(electro poration)形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。 電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每ugDNA可以得到1091010轉(zhuǎn)化子。 研究表明，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間的組合方式導(dǎo)致5070細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化水平達(dá)到最高。,用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞的制備容易得多當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度，并用10甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3l010個(gè)m1。分裝，在干冰上速凍后置于70貯存。這樣，每小份細(xì)胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達(dá)6個(gè)月以上。 電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(04)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。,（3）三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌,簡(jiǎn)稱為三親本雜交轉(zhuǎn)移法，是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式適用于那些難以采用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。 非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所須的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細(xì)胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果在宿主細(xì)胞中存在另外一種溶合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒），非接合型質(zhì)粒通常也會(huì)被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用。,接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著宿主細(xì)胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒DNA分子也不能直接接進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化而只能通過其遷移作用來(lái)完成。,首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。 整個(gè)接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細(xì)菌菌株，即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。,（4）轉(zhuǎn)化率的計(jì)算及其影響因素,轉(zhuǎn)化率是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率，有兩種表示方式： 一是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示； 二是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)的比率表示。 用每單位質(zhì)量的DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)來(lái)表示，難以反映分子大小與轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系。,以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)為基數(shù)來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)化率，首先必須通過菌液OD值測(cè)定或細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出用于制備感受態(tài)細(xì)胞的受體菌總數(shù)。然后計(jì)算轉(zhuǎn)化子與受體菌的比率。,影響轉(zhuǎn)化率的因素,分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較高，分子質(zhì)量較大的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較低，對(duì)于大于30kb的重組質(zhì)粒則很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 組成重組DNA分子的載體類型及其構(gòu)型。與受體細(xì)胞親和性較強(qiáng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體，而處于自然雙螺旋閉環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體比開環(huán)結(jié)構(gòu)成線性結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體有更高的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)體外酶切、酶連操作后的載體DNA或重組DNA分子由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，轉(zhuǎn)化率一般要比具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。 重組DNA分子的濃度和純度。在10ng100u1以下的DNA濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與DNA分子數(shù)成正比關(guān)系。,同一重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率不同受體細(xì)胞的選擇對(duì)于重組DNA分子的轉(zhuǎn)化也是極為重要。 前述三種轉(zhuǎn)化方法中，最佳轉(zhuǎn)化率以電穿孔法最高（1081010）；Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法居中（107108）；而三親本雜交轉(zhuǎn)移法最低（104105），但它適于前兩種方法難以轉(zhuǎn)化的受體菌。,在轉(zhuǎn)化操作方而，受體細(xì)胞的預(yù)處理或感受態(tài)細(xì)胞的制備對(duì)轉(zhuǎn)化率影響最大。 如Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法，菌齡、Cacl2處理時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞的保存期以及熱激時(shí)間均是重要的影響因素。 電穿孔轉(zhuǎn)化法中，對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行冰凍甘油預(yù)處理后的轉(zhuǎn)化率，要比不經(jīng)此預(yù)處理的轉(zhuǎn)化率高10100倍。,5.2.2 重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌,將重組噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染。 將重組噬菌體DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導(dǎo)操作。 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是指通過噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。,具有感染能力的噬菌體顆粒除含有噬菌體DNA分子外，還包括外被蛋白。 以噬菌體顆粒感染受體細(xì)胞，首先必須對(duì)重組A噬菌體DNA分子進(jìn)行體外包裝 。 體外包裝，是指在體外模擬噬菌體DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組噬菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù)。,基本原理，根據(jù)噬菌體DNA體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D包裝蛋白的噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨(dú)地包裝噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能包裝噬菌體DNA。,噬菌體DNA體外包裝的主要過程,制備包裝物。 首先，須培養(yǎng)兩種溶原菌 第二，誘導(dǎo)溶菌生長(zhǎng) 第三，收集和貯存包裝物。 體外包裝。 制備噬菌體DNA混合液。 第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r(shí)，細(xì)胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。 第二次包裝。進(jìn)行第二次包裝，可提高包裝效率25倍，加入蛋白酶可降低包裝反應(yīng)液的黏度，便于包裝反應(yīng)的進(jìn)行。 去除細(xì)胞屑。第二次包裝后，在反應(yīng)液中加入SM溶液和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。,經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆粒可以感染適當(dāng)?shù)氖荏w菌細(xì)胞，并將重組噬菌體DNA分子高效導(dǎo)入細(xì)胞中。 在良好的體外包裝反應(yīng)條件下，每g野生型的噬菌體DNA可形成108109的pfu。對(duì)于重組的噬菌體DNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達(dá)到106107pfu，完全可以滿足構(gòu)建真核基因組基因文庫(kù)的要求。,5.2.3 受體細(xì)胞的選擇,野生型的大腸桿菌不是理想的受體細(xì)胞，因?yàn)樽陨砭哂械南拗坪托揎椣到y(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性。因此必須通過適當(dāng)?shù)恼T變手段對(duì)野生型大腸桿菌進(jìn)行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株。通常應(yīng)從以下幾個(gè)方面加以考慮：,限制與修飾系統(tǒng),這是導(dǎo)致外源重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主要原因之一。 應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細(xì)胞，以提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 進(jìn)一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細(xì)胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。,重組系統(tǒng),進(jìn)入野生型細(xì)胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應(yīng)由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。RecA蛋白能促進(jìn)DNA分子之間的同源聯(lián)會(huì)和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至10-6。 recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率。 因此受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型，基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個(gè)基因同時(shí)失活。,易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo),可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞壁的通透性及細(xì)胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導(dǎo)形成感受態(tài)細(xì)胞的菌株作為受體菌細(xì)胞,有明顯的選擇性差異,遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測(cè)。通常是使受體細(xì)胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標(biāo)記互補(bǔ)的遺傳性狀。 如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有AMP抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對(duì)這種抗生素敏感。當(dāng)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，載體上的標(biāo)記基因賦予受體細(xì)胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。 如果受體細(xì)胞具有與外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性互補(bǔ)的遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。,感染寄生缺陷型,從安全的角度上考慮，受體細(xì)胞不能具有感染寄生性。,5.2.4 重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞,5.2.4.1重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞 （1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌是一類土壤習(xí)居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)絕大多數(shù)單子葉植物無(wú)侵染能力。 具有趨化性的農(nóng)桿菌移向這類植物受傷細(xì)胞，并將其Ti質(zhì)粒上的T-DNA的轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部。根據(jù)這一性質(zhì)，將待轉(zhuǎn)移的目的基因組入Ti質(zhì)粒載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞，與染色體DNA整合，得以穩(wěn)定維持或表達(dá)。,用于植物基因轉(zhuǎn)化操作的受體通常稱為外植體。選擇適宜的外植體是成功進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件，而外植體的選擇主要是依據(jù)受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力來(lái)決定的。 目前作為基因轉(zhuǎn)化的外植體材料非常廣泛，涉及到植物的各個(gè)組織、器官和部位。,選擇合適的轉(zhuǎn)化外植體,優(yōu)先考慮葉片、子葉、胚軸等作為外植體材料。 要注意外植體的年齡，應(yīng)選擇轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的幼期外植體，同時(shí)還要考慮其最佳感受態(tài)時(shí)期。 轉(zhuǎn)化外植體易于組織培養(yǎng)，并有較強(qiáng)的再生能力。 應(yīng)考慮外植體中易被轉(zhuǎn)化的分生組織感受態(tài)細(xì)胞所在的部位及其數(shù)量。切割外植體時(shí)應(yīng)盡可能地暴露分生組織細(xì)胞，增加農(nóng)桿茵與分生組織的接種面積。,農(nóng)桿菌接種操作,外植體的農(nóng)桿菌接種就是把農(nóng)桿菌接種到外植體的損傷切面。通常采用較低的菌液OD值和較短的浸泡時(shí)間來(lái)進(jìn)行外植體的接種。 將接種農(nóng)桿菌后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽固體分化培養(yǎng)基上，隨著外植體的細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，農(nóng)桿菌在外植體切口面也進(jìn)行著增殖生長(zhǎng)，故該培養(yǎng)過程稱之為農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)。 由于農(nóng)桿菌的附著侵染、T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都是在共培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)完成，因此共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握是整個(gè)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率有著很大影響，,與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的外植體表面及淺層組織中常常共生有大量農(nóng)桿菌，對(duì)外植體的正常生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生不利影響，必須進(jìn)行脫菌培養(yǎng)以殺死和抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。 脫菌培養(yǎng)是指把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)的過程。目前使用最多的是頭孢霉素。 最后，還須將外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，篩選出被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，經(jīng)再分化培養(yǎng)成再生植株。,針對(duì)不同的外植體以及不同的轉(zhuǎn)化目的而建立多種轉(zhuǎn)化方法，主要包括葉盤轉(zhuǎn)化法、植株接種共轉(zhuǎn)化法、植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法、植物懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法等。,整體植株接種轉(zhuǎn)化法：人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植株體內(nèi)、使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植株體內(nèi)進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。,原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法即取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛再生出新細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。用此方法已成功地實(shí)現(xiàn)了植物細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)化。 懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法。此方法類似于原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，主要差別是首先建立懸浮細(xì)胞系。,(2)DNA的直接轉(zhuǎn)移,DNA的直接轉(zhuǎn)移是指利用植物細(xì)胞的生物學(xué)特件、通過物理化學(xué)的方法將外源基因轉(zhuǎn)入受體植物細(xì)胞的技術(shù)。 為克服農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的宿主局限性，巳發(fā)展了電擊法(電穿孔法)、基因槍法(微彈轟擊法)、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法，多聚物介導(dǎo)法、花粉管通導(dǎo)法等DNA直接轉(zhuǎn)移技術(shù)。,多聚物介導(dǎo)法,聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等是常用的協(xié)助基因轉(zhuǎn)移的多聚物，尤以PEG應(yīng)用最廣。這些多聚物和二價(jià)陽(yáng)離子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)與DNA混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)否噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。,聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等都是細(xì)胞融合劑。它們可以使細(xì)胞膜之間或使DNA與膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連。還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識(shí)別，從而有利于細(xì)胞膜間的融合和外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。 本法中線性DNA比環(huán)形DNA有更高的轉(zhuǎn)化效率，而單鏈DNA又比雙鏈DNA更為有效。這與質(zhì)粒DNA分子對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化完全相反。,電穿孔轉(zhuǎn)化法,細(xì)胞膜的基本成分是磷脂雙分子層，在適當(dāng)?shù)耐饧与妷鹤饔孟?，?xì)胞膜有可能被擊穿，但不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞致命的傷害，當(dāng)移去外加電壓后，被擊穿的膜孔可被修復(fù)。,激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法,此方法是利用直徑很小，能量很高的激光微束能引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，然后用激光光源替代熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細(xì)胞周圍的外源DNA分子隨之進(jìn)入細(xì)胞。 這種利用激光微束照射受體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)外源DNA直接導(dǎo)入、整合和表達(dá)的技術(shù)稱之為激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法。 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便快捷；基因轉(zhuǎn)移效率高；無(wú)宿主限制，可適用于各種動(dòng)植物細(xì)胞、組織、器官的轉(zhuǎn)化操作，并且由于激光微束直徑小于細(xì)胞器，可對(duì)線粒體和葉綠體等細(xì)胞器進(jìn)行基因操作。 但該法需要昂貴的儀器設(shè)備；技術(shù)條件要求高；穩(wěn)定性和安全性等都不如電穿孔法和基因槍法。,顯微注射法,利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。 這一技術(shù)的關(guān)鍵是原生質(zhì)體或具壁細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的固定。由于動(dòng)物細(xì)胞具有獨(dú)特的貼壁生長(zhǎng)待性，因此不存在固定細(xì)胞的問題，這為動(dòng)物細(xì)胞的顯微注射創(chuàng)造了十分有利條件，也是動(dòng)物細(xì)胞能廣泛使用該技術(shù)的原因之一。 但是，對(duì)植物細(xì)胞而言，首先必須建立固定細(xì)胞技術(shù)，然后才能進(jìn)行定位顯微注射操作。,超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,利用低音強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，可逆性地?fù)舸┘?xì)胞膜并形成過膜通道，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。 利用超聲波處理可以避免脈沖高電壓對(duì)細(xì)胞的損傷作用，有利于原生質(zhì)體存話，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。,基因槍法,又稱微彈轟擊法，是利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時(shí)能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象，將包裹在金屬顆粒（鎢或金顆粒）表面的外源DNA分子隨之帶入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化方法。,脂質(zhì)體介導(dǎo)法,脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，可以將DNA包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。 優(yōu)點(diǎn)是包在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可免受細(xì)胞DNA酶降解。,花粉管通道法,將外源DNA涂于授粉的枝頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細(xì)胞壁的卵、合子及早期的胚胎細(xì)胞。 這一方法技術(shù)簡(jiǎn)單，一般易于掌握，且能避免體細(xì)胞變異等問題，故有一定的應(yīng)用前景。,5.2.4.2 重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,病毒種類多樣及病毒DNA或RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)的各異，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程各不相同，主要有三種類型： 一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。 二，帶有目的基因的毒病是缺陷性的，須同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞在受體細(xì)胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。 三，雖然帶目的基因的SV40病毒是早期轉(zhuǎn)錄缺陷型的，但被感染的COS細(xì)胞系的基因組中整合有SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以沒有必要用輔助病毒作混合感染。,病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法,磷酸鈣轉(zhuǎn)染法,其依據(jù)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。 DNA磷酸鈣共沉淀復(fù)合物中DNA的數(shù)量、共沉淀物與細(xì)胞接觸的保溫時(shí)間、以及DMSO和甘油等促進(jìn)因子作用的持續(xù)時(shí)間均會(huì)影響DNA的轉(zhuǎn)染效率。,DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法,二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一種高分子質(zhì)量的多聚陽(yáng)離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間的有效表達(dá)。 目前有關(guān)DEAE-葡聚糖的作用機(jī)制一般認(rèn)為DEAE-葡聚糖能與外源DNA形成復(fù)合物，保護(hù)DNA免受核酸酶的降解；其次是DEAE-葡聚糖可作用于受體細(xì)胞膜，增加其通透性，便于DNA進(jìn)入。 此方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性高，并且轉(zhuǎn)染效率高于磷酸鈣法。,聚陽(yáng)離子-DMSO轉(zhuǎn)染法,采用聚陽(yáng)離子poly-brene處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞，增加細(xì)胞表面對(duì)DNA的吸附能力、然后再用25-30DMSO短暫處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對(duì)DNA的捕獲量。,顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù),應(yīng)用顯微注射器可以把重組DNA直接注入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 用此方法轉(zhuǎn)基因的效率很高。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量取決于注射的DNA的性質(zhì)。,電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù),原理同植物的電穿孔轉(zhuǎn)移DNA法。 在電脈沖處理之前，先用乙酰甲基秋水仙堿預(yù)處理細(xì)胞10h，可提高轉(zhuǎn)化效率3-10倍。這很可能是由于預(yù)處理導(dǎo)致中期停頓的細(xì)胞中，細(xì)胞核處于無(wú)膜狀態(tài)，或者核膜具有較高的通透性所致。,脂質(zhì)體介導(dǎo)法,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有實(shí)用潛力。 由于脂質(zhì)體具有無(wú)毒、無(wú)免疫原性的特點(diǎn)，不僅可用于體外受體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化，而且可以在動(dòng)物體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞或靶組織、靶器官位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)瞬間表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)，成為基因治療的一種有效工具。,5.3 重組子的篩選,5.3 克隆子的篩選 概念 克隆子 轉(zhuǎn)化子 重組子,將攝取外源DNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱為克隆子。 把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做轉(zhuǎn)化子（導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子 ），現(xiàn)在這兩者有通用的趨向。 含有重組DNA分子的克隆子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽(yáng)性克隆子或期望重組子 。 在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，一般僅有少數(shù)受體細(xì)胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細(xì)胞背景中篩選出期待的克隆子。 經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽(yáng)性克隆子的過程稱為克隆子的篩選。,5.3.1遺傳表型直接篩選法,5.3.1.1 根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子 在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí)，通常在載體DNA分子中組裝了一種或兩種選擇標(biāo)記基因，在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。,一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的受體細(xì)胞接種在合適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長(zhǎng)溫度條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況挑選出轉(zhuǎn)化子。 常用的選擇標(biāo)記基因主要是抗性基因以及表達(dá)產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因，相應(yīng)的選擇條件是可以被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素和除草劑，可以使基因產(chǎn)物發(fā)光的光線，或者是可以使基因產(chǎn)物顯色的試劑。 選擇培養(yǎng)基是根據(jù)宿主細(xì)胞類型配置的培養(yǎng)基，對(duì)于細(xì)菌受體細(xì)胞而言，通常用LB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物即為選擇培養(yǎng)基。選擇物是由載體DNA分子上攜帶的選擇標(biāo)記基因所決定。,（1）抗藥性篩選,（2）插入失活篩選法,（3）插入表達(dá)篩選法,利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標(biāo)記基因的表達(dá)，由此進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。 有些載體在設(shè)計(jì)時(shí)，在篩選標(biāo)記基因前面連接上一段負(fù)調(diào)控序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時(shí)，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)。 例如pTR262質(zhì)粒載體，它由pBR322衍生而來(lái)，其Tcr基因的上游含有一段噬菌體DNA的CI阻遏蛋白編碼基因及其調(diào)控序列，CI基因表達(dá)的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表達(dá)。當(dāng)外源DNA片段插入CI基因的Hin d或Bgl 位點(diǎn)上時(shí)，CI基因失活Tcr基因因阻礙解除而得以表達(dá)，故陽(yáng)性重組子為Tcr表型而質(zhì)粒本身為Tcs表型，當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布在Tc平板上時(shí)，只有含有外源DNA插入片段的陽(yáng)性重組子的轉(zhuǎn)化菌才能生長(zhǎng)成菌落。,（4）顯色互補(bǔ)篩選法,lacZ 基因上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，這種互補(bǔ)現(xiàn)象稱為-互補(bǔ)。 具有完整乳糖操縱子的菌體能轉(zhuǎn)譯-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal時(shí)，產(chǎn)生蘭色沉淀物，使菌落成為藍(lán)色。如果在載體DNA上組入-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ)則重組DNA分子轉(zhuǎn)化lacZ互補(bǔ)型菌落，會(huì)在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子是藍(lán)色菌落。,lac Z是-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lac Z的重組載體轉(zhuǎn)化lac Z互補(bǔ)型菌株，可轉(zhuǎn)譯-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基-硫代半乳糖苷）的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化子成為藍(lán)色菌落，而lac Z互補(bǔ)型菌株本身為白色菌落。當(dāng)lac Z區(qū)插入外源基因后，再轉(zhuǎn)化lac Z互補(bǔ)型菌株，由于不能翻譯-半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化子即使在含有Xgal和IPTG的培養(yǎng)基上也只能長(zhǎng)成白色菌落。這樣可以區(qū)分含外源基因和不含外源基因的轉(zhuǎn)化子。 此方法主要用于原核生物。, 互補(bǔ)的檢測(cè),以顯色劑x-gal作為選擇物時(shí)，DNA對(duì)照組不應(yīng)出現(xiàn)任何菌落，感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照組長(zhǎng)出的菌落應(yīng)全是藍(lán)色的，感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照組長(zhǎng)出的菌落中應(yīng)有白色的，其中一項(xiàng)不符，就有可能挑出假的轉(zhuǎn)化子菌落。,（5）利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞,報(bào)告基因：系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測(cè)定，常用來(lái)判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞（器官或組織）并檢測(cè)其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因。 在植物轉(zhuǎn)基因研究中，在有選擇壓力的情況下，可利用報(bào)告基因在受體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從大量非轉(zhuǎn)化克隆中選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞；同時(shí)，報(bào)告基因可以和某些目的基因構(gòu)成嵌合基因，從報(bào)告基因的表達(dá)了解目的基因的表達(dá)情況及推測(cè)基因調(diào)控序列。常用的報(bào)告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他持殊產(chǎn)物的基因等。,新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt）抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等抗生素，成為篩選動(dòng)植物轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記基因。 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）賦予轉(zhuǎn)化子能抗潮霉素，作為選擇標(biāo)記基因主要用于篩選動(dòng)植物轉(zhuǎn)化子。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)慎重。 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）也被用于篩選動(dòng)植物轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因。,-葡萄糖酸酶基因（gus）,gus的基因產(chǎn)物-葡萄糖酸酶（GUS）能夠催化4-甲基傘形花酮-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形花酮，以此篩選含gus基因的轉(zhuǎn)化子。 由于植物細(xì)胞GUS本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。 尤其是gus基因的3端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。,螢火蟲熒光素酶基因（luc）,luc表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以與熒光素和ATP底物發(fā)生反應(yīng)，形成與酶結(jié)合的腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物，經(jīng)過氧化脫羧作用后，該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測(cè)定儀快速靈敏地檢測(cè)出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報(bào)告基因。 Luc基因檢測(cè)十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測(cè)對(duì)人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成的危害，也沒有內(nèi)源熒光產(chǎn)牛的背景干擾，因此，Luc是一種理想的報(bào)告基因。,抗除草劑bar基因,bar基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），使轉(zhuǎn)化子對(duì)含有磷化麥黃酮（PPT）成分的除草劑具有抗性。,冠癭堿合成酶基因,主要包括胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成基因兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段。 冠癭堿合成酶基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)植物基因細(xì)胞的篩選。 冠癭堿合成酶基因在植物基因工程早期應(yīng)用較多，現(xiàn)已逐漸被其他更為理想的報(bào)告基因所取代。,（6）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Npt)基因也可用于哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選。 常用的標(biāo)記基因還有： - 胸腺核苷激酶基因（tk）、 - 二氫葉酸還原酶基因（dhfr） - 次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprt） - 細(xì)菌的黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecogpt)等。,胸腺核苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）及次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprt）等的表達(dá)產(chǎn)物直接或間接參與核苷酸合成代謝。 這些基因缺失的缺陷型細(xì)胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡，只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)。如果用這樣的缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞，導(dǎo)入含有這些基因的外源DNA，補(bǔ)充原來(lái)缺失的基因，使核苷酸合成代謝恢復(fù)正常，可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。 根據(jù)這一性質(zhì)可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化子。,胸腺核苷激酶基因,胸苷激酶(TK)是核苷酸合成代謝途徑中的一種酶，能夠把胸苷轉(zhuǎn)換為胸苷-磷酸，保證核苷酸的順利合成。胸苷激酶的編碼基國(guó)(tk)，幾乎在所有的真核細(xì)胞中都能有效地表達(dá)，因此可采用這種基因作為遺傳選擇記號(hào)以確定哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移相應(yīng)的受體細(xì)胞為遺傳標(biāo)記遺傳表型的缺陷型。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞篩選方式：HAT選擇法、共轉(zhuǎn)化選擇法 HAT選擇法：由于選擇培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸苷（T），主要針對(duì)含有選擇標(biāo)記的目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選。 基本原理：利用培養(yǎng)基中的葉酸類似物氨基蝶呤(APT)阻斷細(xì)胞核苷酸的正常合成途徑，啟動(dòng)以次黃嘌呤為底物的補(bǔ)救合成途徑（不受氨基蝶呤的抑制，能繼續(xù)合成出所需核苷酸）。HAT培養(yǎng)基中有外源的胸苷，通過胸苷激酶的作用，tk+能以其為底物合成出TTP，則tk+細(xì)胞可繼續(xù)存活；而tk-細(xì)胞無(wú)這種合成作用，則死亡。,分離不具有這種選擇記號(hào)的外源基因轉(zhuǎn)化子則采用共轉(zhuǎn)化選擇法。 共轉(zhuǎn)化是指兩種無(wú)關(guān)聯(lián)的DNA混合物、能夠以磷酸鈣沉淀的方式同時(shí)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。 共轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選仍可采用以HAT法進(jìn)行。,二氫葉酸還原酶基因,二氫葉酸還原酶(DHFR)在真核細(xì)胞核苷酸生物合成過程中可催化二氫葉酸(DHF)還原成四氫葉酸(THF)。dhfr突變體細(xì)胞無(wú)法合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但如果在常規(guī)培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤和胸苷，則突變體細(xì)胞可以借助補(bǔ)救合成途徑維持生長(zhǎng)。,應(yīng)用dhfr基因作為選擇記號(hào)的一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是，由于基因擴(kuò)增的結(jié)果，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠合成大量的野生型的DHFR，檢測(cè)比較方便。,黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因,XGPRT是由大腸桿菌Ecogpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中缺少這種酶，但存在著它的類似物次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)。XGPRT酶能夠有效地把黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S苷磷酸(XMP)，最終形成鳥苷-磷酸(GMP)。HGPRT酶則只能利用次黃嘌呤-鳥嘌呤，催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S苷-磷酸(IMP)。 根據(jù)這些特性，Ecogpt基因可以作為哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移的一種顯性選擇記號(hào)。,可見哺乳動(dòng)物的HGPRT酶無(wú)法合成GMP。 但當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得外源的Ecogpt基因，并能有效地表達(dá)的話，它們就能夠克服霉酚酸和甲氨蝶呤的抑制作用，利用黃嘌呤合成GMP，使細(xì)胞能夠在這種補(bǔ)加有黃嘌呤和腺嘌呤的抑制培養(yǎng)基中存活下來(lái)。,5.3.1.2 營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè)法,根據(jù)目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)，篩選含目的基因的克隆子。如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。 例如要從某種生物的cDNA文庫(kù)中釣出dhfr，則可根據(jù)二氫葉酸還原酶能降解三甲氧芐二氨嘧啶的性質(zhì)(該化合物會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng))，將cDNA文庫(kù)的一系列克隆子接種在含有適量三甲氧芐二氨嘧啶的培養(yǎng)基上，能正常生長(zhǎng)的克隆子中含有dhfr基因。,5.3.1.3 形成噬菌斑篩選法,對(duì)于DNA載體系統(tǒng)而言，重組DNA分子大小必須在野生型DNA長(zhǎng)度的75-105范圍內(nèi)，才可以在體外包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌，在培養(yǎng)基上形成噬菌斑，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體菌繼續(xù)正常生長(zhǎng)。 如果在重組過程中使用的是取代型載體，則噬菌斑中的噬菌體即為重組子，因?yàn)榭蛰d的DNA分子不能被包裝，難以進(jìn)入受體細(xì)胞產(chǎn)生噬菌斑。 如使用插入型載體，由于空載的DNA大于包裝下限，所以也能被包裝成噬菌體顆粒并產(chǎn)生噬菌斑，此時(shí)篩選重組子可以利用載體上的篩選標(biāo)記基因，如lacZ。當(dāng)外源DNA片段插入lacZ基因時(shí)，重組噬菌斑無(wú)色透明，非重組噬菌斑則呈藍(lán)色。,通過系列篩選方法獲得轉(zhuǎn)化子后，為了確定獲得的轉(zhuǎn)化子是真正需要的重組子，還須進(jìn)一步分析鑒定重組子基因組中的外源DNA片段、目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或翻譯的多肽（蛋白質(zhì)、酶）。,5.3.2 依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法,5.3.2.1 快速裂解菌落鑒定分子大小 主要是根據(jù)有外源DNA片段插入載體后的重組DNA與載體DNA之間的大小差異來(lái)鑒定重組子。 分別提取不同轉(zhuǎn)化子的DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，由于重組DNA是載體DNA中插入了外源DNA片段，其分子量大于載體DNA分子，在瓊脂糖凝膠板上出現(xiàn)的DNA帶中，落后的帶是重組DNA的帶。 這是對(duì)重組子進(jìn)行分析鑒定的最基本、最簡(jiǎn)單的方法，直觀快捷，只須獲得質(zhì)粒DNA分子的粗制裂解液即可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，尤其適用于插入片段較大的重組子的篩選。 此方法只用于重組子的初步鑒定。,5.3.2.2 限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析法 通過快速裂解菌落鑒定分子大小的方法難以區(qū)分期望重組子和非期望重組子，因?yàn)橹亟M質(zhì)粒DNA分子中，質(zhì)粒載體可能會(huì)與一個(gè)以上的外源DNA片段連接重組。 采用限制性核酸內(nèi)切酶分析法不僅可以進(jìn)一步篩選鑒定重組子，且能判斷外源DNA片段的插入方向及分子質(zhì)量大小等。 基本做法是從轉(zhuǎn)化菌落中隨機(jī)挑選出少數(shù)菌落，快速提取質(zhì)粒DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶酶解，并通過凝膠電泳分析來(lái)確定是否有外源基因插入及其插入方向等。,全酶解法,簡(jiǎn)單操作過程是，用一種或兩種能將外源DNA片段從重組質(zhì)粒上切割下來(lái)的限制性核酸內(nèi)切酶酶解質(zhì)粒DNA，凝膠電泳后重組質(zhì)粒分子較單一載體質(zhì)粒多出一條泳帶，據(jù)此將重組子和非重組子分離開來(lái)。如果插入片段與載體質(zhì)粒大小相近，則最好用合適的酶將之線性化，通過比較大小確定其是否為重組分子。進(jìn)一步利用在外源DNA片段上具有識(shí)別位點(diǎn)的一種或一種以上的限制性核酸內(nèi)切酶酶解重組質(zhì)粒分子，根據(jù)酶切圖譜分析即可判明插入片段的方向等。,部分酶解法,通過一種或數(shù)種限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒DNA分子進(jìn)行部分酶解分析，根據(jù)部分酶解產(chǎn)生的限制性片段大小，確定限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置及各個(gè)片段的準(zhǔn)確排列方式，從而將期望重組子篩選出來(lái)。 部分酶解法較全酶解法簡(jiǎn)單易行，兩者通常用于當(dāng)載體和外源DNA片段連接后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化菌落比任何一組對(duì)照連接反應(yīng)(如只有酶切后的載體或只有外源DNA片段)都明顯多時(shí)的重組篩選。,5.3.2.3 利用PCR方法篩選確定重組子 由于在載體DNA分子中，外源DNA插入位點(diǎn)的兩側(cè)序列多數(shù)是已知的，可以設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的PCR引物，以待鑒定的轉(zhuǎn)化子或重組子的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)特異性擴(kuò)增DNA帶，并且其分子量同預(yù)期的一致，則可確定含此重組DNA分子的重組子是期待的重組子。,5.3.3 核酸分子雜交檢測(cè)法,基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸(DNA或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則高度特異地復(fù)性形成雙鏈。 該技術(shù)也可用于重組子的篩選鑒定，雜交的雙方是待測(cè)的核酸序列和用于檢測(cè)的已知核酸片段(稱為探針)。,基本做法是將待測(cè)核酸變性后，用一定的方法將其固定在硝酸纖維膜(或尼龍膜)上，這個(gè)過程也稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移，然后用經(jīng)標(biāo)記示蹤的特異核酸探針與之雜交結(jié)合，洗去其他的非特異結(jié)合核酸分子后，示蹤標(biāo)記將指示待測(cè)核酸中能與探針互補(bǔ)的特異DNA片段所在的位置。 根據(jù)待測(cè)核酸的來(lái)源以及將其分子結(jié)合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子雜交檢測(cè)法可分為菌落印跡原位雜交、斑點(diǎn)印跡雜交、southern印跡雜交和Nothern印跡雜交四類。,分子雜交,核酸雜交：兩種不同來(lái)源單鏈DNA或RNA相互配對(duì)的過程。 分子雜交：生物大分子之間通過相互作用結(jié)合在一起：核酸之間通過堿基互補(bǔ)配對(duì)；蛋白質(zhì)之間通過抗原、抗體反應(yīng)；核酸、蛋白質(zhì)之間通過疏水作用，氫鍵進(jìn)行相互作用。,5.3.3.1 Southern印跡雜交,Southern blot DNA雜交由 E.Southern于1975年提出。 DNA瓊脂糖凝膠電泳 轉(zhuǎn)移到NC膜上 DNA或RNA探針雜交 放射自顯影顯雜交帶 Southern印跡雜交，有時(shí)又稱為DNA印跡雜交或Southern DNA印跡雜交等。,它是根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。,其基本原理是將待檢測(cè)的DNA樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào)。通過Southern雜交可以判斷被檢測(cè)的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長(zhǎng)度。 該項(xiàng)技術(shù)廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測(cè)、DNA指紋分析和PCR產(chǎn)物判斷等研究中。,Southern雜交,紀(jì)念發(fā)明者 Edward Southern （1）提取總DNA （2）酶解 （3）電泳 （4）轉(zhuǎn)移到濾膜 （5）變性解鏈 （6）DNA探針及雜交 （7）洗脫 （8）放射自顯影 （9）比較分析,演示,在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它也存在一些不足之處： 第一、硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固。 第二、硝酸纖維素濾膜質(zhì)地校脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹(jǐn)慎(待別是經(jīng)烘烤后)。 第三