苦參素抗病毒和臨床應(yīng)用的若干問題探討.ppt

苦參素抗病毒和臨床應(yīng)用的 若干問題探討,第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院 繆曉輝 2005.9.25,,對(duì)當(dāng)前抗HBV藥物的評(píng)價(jià),干擾素 核苷類似藥 苦參素（我國自主研發(fā)） 其他：膦甲酸鈉、胸腺肽、中醫(yī)中藥,第一部分 初步認(rèn)識(shí)苦參素,,苦豆子,,認(rèn)識(shí)苦參素,苦豆子,,認(rèn)識(shí)苦參素,我們的國寶 豐富的資源 高純度的產(chǎn)品 抗病毒和抗肝纖維化的療效確 實(shí),,認(rèn)識(shí)苦參素,苦參素，即氧化苦參堿，是由中藥苦豆子中提取的一種生物堿，苦參素注射液及其膠囊中含有氧化苦參堿98%以上。是我國草藥中有效成分被純化的“三素”（另有黃連素、青蒿素）之一。,,認(rèn)識(shí)苦參素,氧化苦參堿（Oxymatrine，OM）的分子量282，分子式為C15H22O2N2，結(jié)構(gòu)式為：,O,N,O,N,,認(rèn)識(shí)苦參素,羰基的作用,以芳香族苯環(huán)結(jié)構(gòu)為主,氧化后，與苦參堿的區(qū)別,苦參素的分子結(jié)構(gòu)給我們的提示,,認(rèn)識(shí)苦參素,芳香族苯環(huán)的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的過程以 及入胞后作用機(jī)制可能比較復(fù)雜，有必要進(jìn)一步 研究 有必要也有可能對(duì)該藥的抗病毒分子機(jī)制進(jìn)行 進(jìn)一步研究作用于病毒分子結(jié)構(gòu)的什么部位？ 有可能通過改變分子結(jié)構(gòu)，比如引入某些化學(xué) 基團(tuán)以期增加水溶性或脂溶性，達(dá)到提高進(jìn)入細(xì) 胞內(nèi)的濃度和腸道吸收利用度（膠囊）的目的,第二部分 苦參素的作用機(jī)制,,作用機(jī)制,一、細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果 苦參素能抑制含有HBV全基因的HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg和HBsAg，對(duì)二者的抑制率分別達(dá)93%和63%，并且細(xì)胞毒性低。結(jié)果表明其抗病毒效應(yīng)不需要免疫細(xì)胞的介入，可能為“直接”作用。,,作用機(jī)制,如何理解直接效應(yīng)？ 直接作用于病毒，殺滅或抑制病毒，與 抗菌藥物有何不同？ 通過受感染細(xì)胞發(fā)揮作用，不需要免疫 系統(tǒng)參與 從上述意義上講，干擾素通過雙重機(jī)制 發(fā)揮抗病毒作用。干擾素活性測(cè)定方法 能夠解釋這個(gè)問題。 苦參素直接發(fā)揮效應(yīng)的依據(jù),,,作用機(jī)制,,作用機(jī)制,,作用機(jī)制,二、轉(zhuǎn)基因小鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果 我們采用乙型肝炎病毒全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，進(jìn)行了苦參素對(duì)乙型肝炎病毒作用的研究。,,作用機(jī)制,不同劑量氧化苦參堿作用30天后 小鼠肝組織內(nèi)HBeAg的ELISA定量（？）檢測(cè)結(jié)果,,作用機(jī)制,,苦參素治療前肝臟內(nèi)HBsAg的免疫組化照片(400),作用機(jī)制,苦參素治療后肝臟內(nèi)HBsAg的免疫組化照片(400),,作用機(jī)制,,苦參素治療前肝臟內(nèi)HBeAg的免疫組化照片(400),作用機(jī)制,,苦參素治療后肝臟內(nèi)HBeAg的免疫組化照片(400),作用機(jī)制,三、苦參素對(duì)HBV cccDNA的作用 我們實(shí)驗(yàn)室于2003年成功建立了HBV cccDNA定量檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞和HBV DNA陽性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2.2.15細(xì)胞核內(nèi)有較高水平的HBV cccDNA，苦參素作用于細(xì)胞后可以顯著降低其水平，但不能完全清除。另外，無論乙肝患者血清中HBV DNA含量高低，PBMCs中不能檢出HBV cccDNA。,,作用機(jī)制,關(guān)于HepG2.2.15能否作為檢測(cè)cccDNA細(xì)胞模型的問題 HepG2和 HepG2.2.15細(xì)胞 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，目的基因或基因組一定是在染色體 上 成功轉(zhuǎn)入后的目的基因組一定是能夠自身復(fù)制和 形成功能蛋白，就HBV而言，還應(yīng)該產(chǎn)生完整的 病毒顆粒（Dane顆粒） 病毒顆粒能否產(chǎn)生rcDNA? 如果能，rcDNA為什么 不能進(jìn)入細(xì)胞核形成cccDNA?,,作用機(jī)制,清除細(xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA，是評(píng)判抗乙肝病毒藥物的關(guān)鍵指標(biāo)。由此引出兩個(gè)值得思考和探討的熱門話題： 1.現(xiàn)有的抗病毒藥物，有清除cccDNA的作用嗎？ 有：如何證實(shí)？ 無：“長期應(yīng)答者”如何解釋？ 2.HBV究竟能否在肝外組織細(xì)胞中復(fù)制？ 能：如何解釋PBMCs中不含HBV cccDNA的現(xiàn)象？ 否：如何解釋乙肝相關(guān)性腎病等肝外組織HBV感 染的事實(shí)？如何解釋肝移植術(shù)后肝炎復(fù)發(fā) 的現(xiàn)象？,,作用機(jī)制,結(jié) 論 苦參素通過某種機(jī)制，發(fā)揮細(xì)胞的作用，“直接”清除細(xì)胞內(nèi)病毒或顯著抑制病毒復(fù)制；可以顯著降低乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒抗原表達(dá)。在作用機(jī)制上，苦參素對(duì)細(xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA有一定的清除作用。,,作用機(jī)制,四、抗肝臟纖維化作用的動(dòng)物試驗(yàn) 我們研究了氧化苦參堿對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷及肝纖維化的影響。結(jié)果表明：OM不僅可明顯降低大鼠血清ALT和TNF-水平，還可以降低IV-C、HA水平及肝內(nèi)纖維組織含量，在一定范圍內(nèi)增加劑量可明顯提高療效。,,作用機(jī)制,大鼠血清-C、HA及纖維組織含量變化,組別 -C (ng/ml) HA(ng/ml) S- F 正常對(duì)照組 15.33 6.22 98.67 19.95 0.91 0.64 模型組 91.50 25.72 306.00 30.89 12.74 2.98 OM 30mg組 71.83 24.86 236.33 66.87 * 9.83 2.10 * OM 60mg組 24.33 11.48 * 119.50 32.34 * 3.79 0.64 * *: p0.05 , *: p0.01 ,治療組 vs 模型組 *: p0.05 , *: p0.01 , 60 mg組 vs 30 mg組 S- F為肝內(nèi)纖維組織含量(面積密度) 各組6只大鼠,,作用機(jī)制,五、苦參素的其他藥理作用機(jī)制 苦參素有較好的保護(hù)肝細(xì)胞、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的作用；顯著降低四氯化碳、D-半乳糖胺鹽所致小鼠中毒性肝損傷后血清ALT、AST水平，與臨床上觀察到的其具有降低ALT,AST,TBIL水平一致作用。研究表明其保肝作用與下述機(jī)制有關(guān)：,,作用機(jī)制,1.抗肝臟炎癥性損傷: 苦參素可抑制炎性因子 TNF-、IL-1、IL-6的釋放，減少肝組織炎性 細(xì)胞浸潤，抑制肝組織內(nèi)炎癥活動(dòng)，改善肝臟 組織學(xué)病理損害。 2.抗脂質(zhì)過氧化: 苦參素能減少肝組織內(nèi)丙二醛 （MDA）的形成，提高肝組織內(nèi)SOD、谷光甘肽過 氧化物酶（GST-PX）的含量，從而可防止脂質(zhì) 過氧化反應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞膜及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷， 尤其是減輕對(duì)線粒體的損傷，改善肝功能。,,作用機(jī)制,3.誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450酶的合成:苦參素能提高小 鼠肝微粒體內(nèi)某些細(xì)胞色素P-450含量，這些細(xì) 胞色素P-450對(duì)類固醇激素等物質(zhì)以及進(jìn)入人體 內(nèi)某些的藥物和毒物等具有解毒作用。 4.抗肝細(xì)胞凋亡:苦參素對(duì)脂多糖（LPS）加氨基 半乳糖誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭具有保護(hù)作用 ，研究結(jié)果顯示苦參素預(yù)防組小鼠血清ALT、 TNF水平明顯低于模型組，肝組織Fas、FasL 表達(dá)強(qiáng)度及肝細(xì)胞壞死程度明顯低于模型組。,,作用機(jī)制,第三部分 苦參素臨床應(yīng)用研究,,我們應(yīng)用苦參素注射液（600mg,6ml）肌肉注射治療慢性乙型肝炎64例（CPH 13例, CAH 42例, CAH+LC 9例），同時(shí)與采用-干擾素治療的慢性乙型肝炎52例（CPH 8例, CAH 38例, CAH+LC 6例）作對(duì)照。治療時(shí)間為6個(gè)月，數(shù)據(jù)采集是在治療結(jié)束后。證實(shí)苦參素有較好的抗病毒作用 （第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997）,,應(yīng)用研究,一、苦參素治療慢性乙型肝炎,治療后肝生化指標(biāo)復(fù)常率 （近期療效,ETR）,n ALT SB OM 64 40/49(81.6%)* 23/34(69%)* IFN- 52 28/38(73.7%)* 16/25(64.0%)* *P0.05 *P0.05,,應(yīng)用研究,治療后HBeAg和HBV DNA陰轉(zhuǎn)率 （近期療效,ETR）,n HBeAg HBV DNA OM 64 28/63(44.4%)* 29/64(45.3%)* IFN- 52 23/50(46.0%)* 25/52(48.0%)* *P0.05 *P0.05,,應(yīng)用研究,關(guān)于抗病毒療效的幾個(gè)概念 EVR: early virologic response 抗病毒治療開始后12周的病毒學(xué)應(yīng)答反應(yīng) ETR: end of treatment resonse 結(jié)束時(shí)的病毒血應(yīng)答情況（時(shí)間？） SVR: sustaind virologic response 治療結(jié)束后24周的病毒學(xué)檢測(cè)結(jié)果,,上海市仁濟(jì)醫(yī)院消化病研究所曾民德教授牽頭，全市十家醫(yī)院參與，進(jìn)行苦參素膠囊對(duì)慢性乙型肝炎后肝臟纖維化干預(yù)作用的臨床研究。,應(yīng)用研究,二、苦參素對(duì)慢性乙型肝炎后肝臟 纖維化的干預(yù)作用,,病例選擇：經(jīng)生化、乙肝標(biāo)志物和肝穿刺證實(shí)的慢性 乙型肝炎病人，共208例。 方法： 隨機(jī)、雙盲、對(duì)照、多醫(yī)院（多中心） 100例肌注苦參素 50例口服苦參素膠囊 50例肌注+口服膠囊 （8例作為可能的脫落病例準(zhǔn)備） 200例以口服安慰劑作對(duì)照 要求：不用其他任何抗病毒藥物 20%的病人必須在治療前后進(jìn)行2次肝穿刺 每月復(fù)查肝功、B超、血清肝纖維化指標(biāo),應(yīng)用研究,,結(jié)果證實(shí)，苦參素注射組和服膠囊組不僅均有抗乙肝病毒的作用，而且具有明顯的抗肝臟纖維化作用，表現(xiàn)在二次肝組織活檢證實(shí)肝臟炎癥反應(yīng)減輕，纖維化程度減輕。,應(yīng)用研究,,1型糖尿病患者使用苦參素治療后胰島素 使用量明顯減少 乙肝相關(guān)性腎炎患者使用苦參素后腎損 害明顯減輕 使用拉米夫定出現(xiàn)YMDD變異者使用苦參 素后ALT復(fù)常 特別說明：不具備普遍指導(dǎo)意義，循證 醫(yī)學(xué)3級(jí)（專家經(jīng)驗(yàn)）。,,應(yīng)用研究,三、特殊病例簡(jiǎn)介,四、苦參素與其他抗病毒藥物聯(lián)合 應(yīng)用的體會(huì) 與膦甲酸鈉聯(lián)合應(yīng)用（序貫療法） 與干擾素聯(lián)合應(yīng)用（聯(lián)合，聯(lián)合序貫） 與拉米夫丁聯(lián)合應(yīng)用： 由草藥不誘發(fā)細(xì)菌耐藥所想起的； 拉米夫定與干擾素聯(lián)合應(yīng)用無效的啟示。,,應(yīng)用研究,第四部分 臨床應(yīng)用的幾個(gè)問題探討,,1.慢性乙肝患者什么情況下選用苦參素療 效更好？,從嚴(yán)格意義上講，任何藥物對(duì)不同病情的療效的 好壞是相對(duì)的，我們放棄對(duì)抗病毒療效可能在10 以下患者的治療，一味追求當(dāng)前的40以上療效是 否有失公平？ 以血清病毒含量的多少，尤其是下限值更是缺乏 嚴(yán)格依據(jù)的 即使炎癥比較輕微，對(duì)有經(jīng)濟(jì)實(shí)力者使用具有免 疫調(diào)節(jié)作用抗病毒藥可以減少肝癌的發(fā)生率,問題探討,,1.慢性乙肝患者什么情況下選用苦參素療 效更好？, 關(guān)于ALT在“基線水平二倍以上”的概念的提出與 病情和病人的需求的矛盾： ALT正常，肝臟的炎癥持續(xù)存在 ALT不能很敏感地反映肝臟的損害和損害程度 在病程中，ALT會(huì)經(jīng)常輕度升高（flare），沒有 被發(fā)現(xiàn)而已,問題探討,,我們?cè)谟每茖W(xué)發(fā)展觀指導(dǎo)醫(yī)學(xué)科學(xué)的同時(shí)，又陷入循證醫(yī)學(xué)的泥潭甚至誤區(qū)，以至于可能犯了教條主義的錯(cuò)誤。 我們一定要接受循證醫(yī)學(xué)的科學(xué)意義和指導(dǎo)作用，但是我們又必須正視一個(gè)問題：循證醫(yī)學(xué)的“證”可靠嗎？如果“證”不可靠，那么經(jīng)驗(yàn)就顯得非常重要，所幸的是尋證醫(yī)學(xué)分級(jí)者們沒有忽視專家經(jīng)驗(yàn)，即使專家經(jīng)驗(yàn)被排列最后！就慢性乙型肝炎的防治而言，中國專家的發(fā)言權(quán)不能被忽視。,問題探討,,1.慢性乙肝患者什么情況下選用苦參素療 效更好？,苦參素治療乙型肝炎病毒感染沒有絕對(duì)的適應(yīng) 證，甚至沒有絕對(duì)的禁忌證，因?yàn)樗梢杂糜?肝衰竭的治療 有趣的是，對(duì)其他抗病毒藥物治療無效的乙肝 患者，使用苦參素治療可能有效，也可能無效,問題探討,,2.苦參素治療慢性乙型肝炎的療程問題,乙肝病毒基因在感染者體內(nèi)的存在形式： rcDNA：半壽期1224hr（病毒顆粒） cccDNA：65天左右 與染色體整合的DNA 三個(gè)值得思考的特殊問題： (1)病毒的起源與清除病毒的可能性； (2)病毒半壽期是確定抗病毒治療時(shí)間的重要“依 據(jù)”，但不是“根據(jù)”?！鞍搿焙汀扒宄钡母拍?； (3)一旦發(fā)生病毒基因整合染色體，病毒將“終身 與人同在”？,問題探討,,3個(gè)月作為一個(gè)“療程”的概念及其起源 6個(gè)月作為基本療程的依據(jù) 干擾素1年療程的提出 終身治療的提出 苦參素的應(yīng)用療程： 苦參素作用機(jī)制的定位決定其“療程”：抗病毒？抗纖維化？消除炎癥？其他？,問題探討,2.苦參素治療慢性乙型肝炎的療程問題,,3.苦參素與其他抗病毒藥聯(lián)合使用的問題,與核苷類似藥聯(lián)合使用 檢索迄今國內(nèi)外公開發(fā)表的苦參素與LAM聯(lián)合或序貫治療慢乙肝的論文有68篇（未作Meta分析，總體上認(rèn)為： (1)提高ALT,AST,TBiL復(fù)常率 (2)提高HBeAg陰轉(zhuǎn)率, HBeAg血清轉(zhuǎn)換率 (3)對(duì)于HBV-DNA轉(zhuǎn)陰又協(xié)同作用 (4)減少病毒反跳，減少YMDD變異 (5)長期療效優(yōu)于單用LAM (6)不增加不良反應(yīng)的發(fā)生,問題探討,,與核苷類似藥序貫使用 (1)LAM使用612個(gè)月后序貫使用苦參素,可一 定程度上減輕病毒復(fù)發(fā)和YMDD變異,減輕拉 米夫定耐藥。 (2)LAM停藥后肝炎使用苦參素有一定療效。 (3)LAM引起的YMDD變異，可以使用苦參素。,問題探討,3.苦參素與其他抗病毒藥聯(lián)合使用的問題,,與干擾素聯(lián)合使用 國內(nèi)近年來已有十余篇文獻(xiàn)報(bào)道苦參素與干擾素聯(lián)合治療慢乙肝的情況，但是實(shí)際上聯(lián)合使用的情況比較普遍，尤其是與口服苦參素膠囊聯(lián)合，一般認(rèn)為二者聯(lián)合可以達(dá)到抗病毒作用提高，副作用（利用苦參素的升白作用）減少的效果。,3.苦參素與其他抗病毒藥聯(lián)合使用的問題,問題探討,,（1）兒童 （2）孕婦 （3）使用核苷類似藥后出現(xiàn)YMDD變異并耐藥者 （4）慢性乙型肝炎后肝硬化失代償患者 （5）肝衰竭仍有病毒持續(xù)、高水平復(fù)制者 （6）肝衰竭高膽紅素血癥的治療 （7）乙肝基礎(chǔ)上發(fā)生的藥物性肝炎 （8）乙肝患者實(shí)施器官移植術(shù)之后的抗病毒治療,4.苦參素在特殊人群抗病毒治療中的地位,問題探討,,上海仁濟(jì)醫(yī)院采用苦參素注射液治療慢性丙型肝炎17例，每天600mg，療程3月，HCV RNA轉(zhuǎn)陰8