酵母作為研究病原菌致病效應(yīng)分子的工具.ppt

,酵母作為研究病原菌致病效應(yīng)分子的工具,文獻(xiàn)閱讀：游明亮 2019/7/18,病原菌,病原菌（pathogenic bacteria）是指那些導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病的細(xì)菌。是一群高度特化了的微生物，為了自身的生存，已適應(yīng)而且必須在宿主生物體內(nèi)持續(xù)存在或增殖，有時(shí)可造成宿主發(fā)病。,細(xì)菌致病性的確定,經(jīng)典柯赫法則 第一，特殊的病原菌應(yīng)在同一疾病中查見(jiàn)，在健康者不存在；第二，此病原菌能被分離培養(yǎng)而得到純種；第三，此純培養(yǎng)物接種易感動(dòng)物，能導(dǎo)致同樣病癥；第四，自實(shí)驗(yàn)感染的動(dòng)物體內(nèi)能重新獲得該病原菌的純培養(yǎng)。,柯赫法則隨在確定一種新的病原體時(shí)非常重要，但其有一定的局限性，某些情況并不符合該法則。如健康帶菌或隱性感染，有些病原菌迄今仍無(wú)法在體外人工培養(yǎng)，有的則沒(méi)有可用的易感動(dòng)物。另外，該法則只強(qiáng)調(diào)了病原微生物一方面，忽略了它與宿主的相互作用，是不足之處。,基因水平的柯赫法則,第一，應(yīng)在致病菌株中檢出某些毒力或其產(chǎn)物，而無(wú)毒力菌株中則無(wú)；第二，如有毒力菌株的某個(gè)基因被損壞，則菌株的毒力應(yīng)減弱或消除?；蛘邔⒋嘶蚩寺〉綗o(wú)毒菌株內(nèi)，后者成為有毒力菌株；第三，將細(xì)菌接種動(dòng)物時(shí)，這個(gè)基因應(yīng)在感染的過(guò)程中表達(dá)；第四，在接種動(dòng)物檢測(cè)到這個(gè)基因產(chǎn)物的抗體，或產(chǎn)生免疫保護(hù)。,細(xì)菌的致病性在很大程度上取決于其毒力因子，包括侵襲力與毒素，以及毒力因子的分泌系統(tǒng)。 細(xì)菌致病性的現(xiàn)代觀點(diǎn)是將病原菌、宿主及二者的相互的作用綜合考慮，糾正了只調(diào)節(jié)細(xì)菌本身的片面性，是認(rèn)識(shí)的深化。,尋找一種模式生物來(lái)研究細(xì)菌致病性顯得尤為重要,酵母,酵母（Yeast）是人類文明史中被應(yīng)用得最早的微生物。 例如：用于制作面包和饅頭等食品及釀酒。 酵母是屬于簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真菌，易于培養(yǎng)，且生長(zhǎng)迅速，被廣泛用于現(xiàn)代生物學(xué)研究中。如釀酒酵母作為重要的真核模式生物，是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究材料。,酵母作為高等真核生物特別是人類基因組研究的模式生物，其最直接的作用體現(xiàn)在生物信息學(xué)領(lǐng)域。 1996年4月，公布測(cè)得釀酒酵母的完整基因組順序，稱為遺傳學(xué)上的里程碑。,Liu Qing， 2000,第一次獲得真核生物基因組的完整核苷酸序列,第一次獲得一種易于操作的實(shí)驗(yàn)生物系統(tǒng)的完整基因組,優(yōu)勢(shì),酵母是一種單細(xì)胞生物，能夠在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，使得實(shí)驗(yàn)者能夠通過(guò)改變物理或化學(xué)環(huán)境完全控制其生長(zhǎng)。 酵母在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均能生長(zhǎng)，并能在實(shí)驗(yàn)條件下較為方便地控制單倍體和二倍體之間的相互轉(zhuǎn)換，對(duì)其基因功能的研究十分有利。 酵母的生命周期很適合經(jīng)典的遺傳學(xué)分析，使得在酵母16條染色體上構(gòu)建精細(xì)的遺傳圖譜成為可能。,可利用異源基因與酵母基因的功能互補(bǔ)以確證基因的功能。 在酵母中進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)無(wú)疑是一種研究人類基因功能的捷徑。如果一個(gè)功能未知的人類基因可以補(bǔ)償酵母中某個(gè)具有已知功能的突變基因，則表明兩者具有相似的功能。而對(duì)于一些功能已知的人類基因，進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)也有重要意義。,相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù),多克隆抑制效應(yīng)因子靶蛋白 酵母雙雜交相互作用蛋白 熒光標(biāo)記技術(shù)效應(yīng)因子的亞細(xì)胞定位 DNA翻譯圖譜分析宿主翻譯水平的反應(yīng) 全基因組文庫(kù)基因篩選、分離 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究效應(yīng)因子具體功能,酵母為模式生物研究病原菌致病效應(yīng)分子,多克隆抑制-Multi-copy suppression,Helena Gaweska et al, 2004,用于篩選靶向的基因或者表達(dá)產(chǎn)物,酵母雙雜交,酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。,-摘自生物谷,基于基因芯片的翻譯圖譜分析,利用基因芯片進(jìn)行高通量的基因翻譯圖譜的分析，可以快速進(jìn)行宿主對(duì)于病原菌效應(yīng)因子的反應(yīng)表達(dá)分析。,/wiki/DNA_microarray,熒光標(biāo)記的亞細(xì)胞定位,亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位。如僅在核內(nèi)存在，還是胞質(zhì)內(nèi)存在，還是細(xì)胞膜上存在。 FM4-64等是有效的研究分泌活動(dòng)的選擇性膜表面熒光標(biāo)記物,它們?cè)谒嘀袥](méi)有熒光, 當(dāng)它們插入脂質(zhì)膜后則顯示較強(qiáng)的熒光, 囊泡膜胞吐后會(huì)使細(xì)胞表面熒光增加 。,Xie Xiaoyan et al, 2004,Pathogenic genetic array（PGA）,系統(tǒng)性的構(gòu)建雙突變型來(lái)分析與宿主的基因的聯(lián)系。 酵母中缺失某些基因的菌株能在有致病效應(yīng)因子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，證明這些基因與效應(yīng)因子發(fā)揮功能是有關(guān)系的。 但這個(gè)生長(zhǎng)只是部分恢復(fù)，說(shuō)明除了被敲除的基因外，效應(yīng)因子還和其他基因有相互作用。,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),許多致病菌利用分泌系統(tǒng)將受體蛋白傳遞到宿主細(xì)胞中，調(diào)節(jié)宿主的信號(hào)傳遞途徑，進(jìn)而阻斷或調(diào)節(jié)宿主免疫相關(guān)的信號(hào)通路 ，從而達(dá)到致病效果。 有些效應(yīng)因子具有類似信號(hào)通路中激酶的作用，如GTP激活因子。,傳統(tǒng)的藥物篩選,基于體外的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)小分子來(lái)抑制酶活性的方法來(lái)篩選靶向位點(diǎn) ，沒(méi)有考慮到藥物進(jìn)入細(xì)胞膜的通透性和靶向丟失效應(yīng) 。 這種方法具有很強(qiáng)的特異性，能減少靶向缺失的問(wèn)題。細(xì)菌效應(yīng)因子的特異靶向還可以承受更少的選擇壓力，因?yàn)榧?xì)菌的生長(zhǎng)是不受影響的，這樣可以減少對(duì)藥物的抗性。,基于細(xì)胞的高通量的篩選方法,未來(lái)研究的方向,不是所有的效應(yīng)因子都能在酵母中研究，因?yàn)樗麄兊陌邢蜻^(guò)程在酵母中不是保守的。 單倍體缺失能同時(shí)于分析酵母中必需基因和非必需基因在效應(yīng)因子作用后，其基因產(chǎn)物對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響。,文獻(xiàn)的閱讀