白血病淋巴瘤免疫分型.ppt

1,白血病/淋巴瘤免疫分型 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所 衛(wèi)生部 血栓與止血重點(diǎn)實驗室 朱明清 2010年8 月 杭州,2,流式細(xì)胞術(shù)的基本概念,流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選 研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量,3,散射光信號和熒光信號,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射激光的前向散射光信號 細(xì)胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信號 細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性 熒光素與特異抗體結(jié)合，熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強(qiáng)。,4,CD45/SS示意圖,5,實驗對照的設(shè)計,空白對照：ALL 陰性對照：常用同型抗體對照 單色分析：設(shè)同型抗體對照 多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正） 陽性對照：檢測陰性時,6,空白對照和陰性對照的比較：,7,需要用多少的標(biāo)志來確證感興趣的細(xì)胞群? 它們在細(xì)胞上的分布是不是很近? 它們是否在不同的細(xì)胞上表達(dá)不同? 他們表達(dá)強(qiáng)還是弱?,抗原表達(dá),CD3,CD4,8,抗原分布,表面,胞漿,核內(nèi) 是共同檢測還是分別檢測?,CD3,4,8, tetramer + Cytokines,CD3,4,8, tetramer + DNA,Cytokines + DNA,CD3,4,8, tetramer + Cytokines + DNA,9,設(shè)門,08-03307,10,設(shè)門,全部 細(xì)胞,門內(nèi)細(xì)胞,08-03307,11,12,13,血液腫瘤分類進(jìn)程,14,目前最完善的血液腫瘤免疫分型文獻(xiàn),15,白血病免疫分型的理論基礎(chǔ),白血病/淋巴瘤免疫分型采用的抗原標(biāo)志是表達(dá)于正常造血細(xì)胞不同分化發(fā)育階段的分化抗原。雖然是惡性腫瘤細(xì)胞，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對白血病/淋巴瘤進(jìn)行免疫分型。為了正確分析白血病/淋巴瘤細(xì)胞，必須對正常造血細(xì)胞分化抗原的表達(dá)模式有充分的了解。只有熟悉正常細(xì)胞的抗原表達(dá)模式，才能辨認(rèn)白血病/淋巴瘤細(xì)胞的存在。,16,細(xì)胞類型鑒定,Borowitz et al (1993) AJCP 100:534-40. Steltzer et al (1993) Ann NY Acad Sci 667:265-280,17,CD45/SS示意圖,正常骨髓細(xì)胞 血液腫瘤細(xì)胞 老化粒細(xì)胞 、噬酸細(xì)胞 早幼成熟粒細(xì)胞 M3、CML 單核細(xì)胞 M4、M5 LGL 淋巴細(xì)胞 CLL、ALL、CLD 正常前體細(xì)胞 M0、M1、M2、 嗜堿性粒細(xì)胞 M4、M5、ALL 成熟紅細(xì)胞、血小板 M6、M7、MM 細(xì)胞碎片 Pre-B-ALL 非血液來源細(xì)胞,18,B淋巴細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine,19,T淋巴細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine,20,粒細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine,21,單核細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine,22,非腫瘤T淋巴細(xì)胞表型,23,非腫瘤B淋巴細(xì)胞表型,24,非腫瘤粒細(xì)胞、單核細(xì)胞表型,25,非腫瘤粒細(xì)胞、單核細(xì)胞表型,26,白血病免疫分型,根據(jù)白血病細(xì)胞表達(dá)的系列相關(guān)抗原，確定其系列來源。如：淋系T/B、粒單系、紅系、巨核系等。 根據(jù)白血病細(xì)胞表達(dá)的系列分化其相關(guān)抗原進(jìn)一步分型。如：早前B，前B，普通B,27,EGIL，1998年白血病積分系統(tǒng),分值 B系 T系 髓系 2 CD79a CD3 MPO (cyt)CD22 TCR/ (cyt)IgM TCR/ 1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD65 0.5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64 *當(dāng)髓系和一個淋系積分均2分時，則診斷為急性混合細(xì)胞型白血病。,28,急性白血病的四大免疫類型,單表型急性白血病 表達(dá)某一個系列抗原為主的急性白血病 雙表型/雙克隆急性白血病 未分化型急性白血病,29,初治急白分型,Acute Leukemia Blasts Present 20%,紅系和巨核系的鑒定需要另外增加二線抗體。 如:CD71、GPA、CD41、CD61,30,AML-M1,31,AML-M1,32,AML-M2,33,AML-M2,34,AML-M3,35,AML-M4,36,AML-M4,37,AML-M5,38,AML-M6,39,初治急淋分型,Common Thymocyte,Mature Thymocyte,CD2+ CD5+ Dual CD4+/CD8+ sCD3-,CD2+ CD5+ CD4+ or CD8+ sCD3+,CD2-/+ CD5-/+ sCD3- CD4- CD8-,TdT+ CD10- clg- sig-,Pre-B,CD10+ cig+ TdT+ sig-,B,sig+ CD10+/- clg+/- TdT-,Common,TdT+ CD10+ clg- sig-,Early Thymocyte,Early B- Precursor,40,B細(xì)胞系A(chǔ)LL的免疫分型 亞型 CD19 CD20 HLA-DR CD10 CyIg SmIg FAB分型 早前B-ALL + + L1,L2 前 B-ALL + /+ + + + L1 普通B-ALL + +/ + + L1,L2 成熟B-ALL + + + +/ /+ + L3,41,B-ALL,42,Pre-BALL,43,Common-B-ALL,44,T細(xì)胞系A(chǔ)LL的免疫分型 亞型 CD7 CD1a CD2 TdT FAB分型 早前T-ALL + + L1,L2 胸腺皮質(zhì)T-ALL + + + + L1,L2 T-ALL + + + L1,L2,45,T-ALL,46,T-ALL,47,HAL（T/M雙克隆）,48,49,白血病免疫分型的價值,確定ALL的細(xì)胞類型（B細(xì)胞或T細(xì)胞）和 ALL的分化階段。 鑒定AML的特征。 對形態(tài)學(xué)上未分化的急性白血病有助于鑒定細(xì)胞類型。 診斷一些少見類型的白血病。如：M6、M7、M0等。,50,診斷雙表型/混合細(xì)胞型急性白血病。 鑒別診斷ALL伴有髓系抗原表達(dá)（My+）或AML伴有淋系抗原表達(dá)（Ly+）。 鑒別急性白血病與其他造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)惡性腫瘤。 根據(jù)一些特殊的免疫表型特征診斷與某核型異常相關(guān)的亞型。如：M3/t(15;17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。,51,淋巴瘤免疫分型,非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)是淋巴系統(tǒng)的一類具有組織和生物學(xué)異質(zhì)性的惡性克隆性疾病。世界衛(wèi)生組織（WHO）結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫表型、基因分型、正常細(xì)胞組成及臨床行為，新修訂了歐美淋巴瘤分類系統(tǒng)（REAL分類）對淋巴系統(tǒng)腫瘤的分類。這種分類方法在觀察者的組內(nèi)及組間的重復(fù)率為85-95%。WHO淋巴瘤分類是建立在疾病病理形態(tài)、免疫表型、遺傳學(xué)特征、臨床特點(diǎn)的綜合資料基礎(chǔ)上：病理形態(tài)是分類的基礎(chǔ)，大多數(shù)淋巴瘤僅靠病理形態(tài)就能做出明確診斷；免疫表型和遺傳學(xué)特征是確定每一淋巴瘤的重要指標(biāo)，是達(dá)成共識的客觀依據(jù)，有助于提高診斷的可重復(fù)性，具有鑒別診斷和預(yù)后判斷的輔助作用，但在淋巴瘤診斷中并非必不可少；臨床特點(diǎn)，特別是腫瘤原發(fā)部位，如節(jié)內(nèi)或節(jié)外（皮膚、中樞神經(jīng)、胃腸、縱膈、鼻腔），是確定某些淋巴瘤的重要指標(biāo)。雖然定義淋巴瘤是綜合考慮的結(jié)果，但在具體確定一種淋巴瘤時其側(cè)重點(diǎn)有所不同。,52,淋巴瘤病理分類的演進(jìn) 形態(tài)學(xué)（Kiel分期） 形態(tài)學(xué)加臨床特點(diǎn)(IWF) 形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳特點(diǎn)和臨床特點(diǎn) (REAL WHO分類）,53,WHO認(rèn)為，淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴瘤為同一種疾?。簜鹘y(tǒng)上淋巴瘤和白血病是兩種不同的疾病，現(xiàn)在從形態(tài)、免疫和遺傳學(xué)來看，淋巴瘤和白血病是同一疾病的不同時相（瘤體期或彌散期/循環(huán)期），將它們分開純粹是人為的。淋巴瘤的臨床行為決定了臨床工作中的治療策略，WHO分類系統(tǒng)更多的采用與生物學(xué)特點(diǎn)相關(guān)的淋巴瘤診斷和分類方法，基于淋巴瘤的免疫和分子生物學(xué)特點(diǎn)的治療方法也不斷涌現(xiàn)，這些在將來會大大提高針對淋巴瘤的不同特點(diǎn)進(jìn)行的治療。,54,淋巴瘤免疫分型意義,淋巴瘤免疫分型可以區(qū)分反應(yīng)性與瘤性細(xì)胞：活檢、細(xì)針穿刺與體液標(biāo)本均可；確定腫瘤細(xì)胞的系列：T、B、組織細(xì)胞、髓系、非造血系。分類中根據(jù)免疫表型和DNA含量，可確定低、中、高度惡性程度。區(qū)別不同類型腫瘤細(xì)胞：伯基特細(xì)胞，淋巴母細(xì)胞，濾泡型細(xì)胞（小細(xì)胞混合和/或大細(xì)胞），小淋巴細(xì)胞，套細(xì)胞，彌散小細(xì)胞或大細(xì)胞，免疫母細(xì)胞。確定淋巴瘤的分期：檢測有否血液、骨髓和體液的累及。疾病監(jiān)測：微小殘留病的監(jiān)測，判斷療效（血液、骨髓、細(xì)針穿刺標(biāo)本），確定瘤細(xì)胞表型變化，監(jiān)測Retuximab(抗CD20)治療前后的CD20定量變化，自體干細(xì)胞移植中干細(xì)胞收獲時的瘤細(xì)胞檢測等等.,55,淋系腫瘤WHO分類,56,淋巴瘤診斷的必查項目,根據(jù)淋巴結(jié)或骨髓活檢進(jìn)行診斷,至少需要對一個腫瘤組織的石蠟塊的所有切片進(jìn)行血液病理學(xué)檢查.如果認(rèn)為樣本組織不能確診,則需要重新活檢。 腫塊細(xì)針穿刺（FNA）不宜作為淋巴瘤初始診斷的依據(jù)。但是在某些情況下，F(xiàn)NA結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)檢查也可以為診斷提供足夠的信息，特別是在診斷CLL時。 某些情況下還需要進(jìn)行免疫組化、分子/細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。,57,流式細(xì)胞術(shù)檢測到的成熟淋巴細(xì)胞常見異常表型,淋巴細(xì)胞某一亞群的擴(kuò)增 異?？乖磉_(dá)高/低/缺失/異常共表達(dá) 細(xì)胞形態(tài)增大,58,淋巴細(xì)胞,正常淋巴細(xì)胞,淋巴細(xì)胞增殖性疾?。寺U(kuò)增）,59,B 細(xì)胞可隆性的確定是通過檢測證實所以B細(xì)胞僅表達(dá)一種輕鏈或重鏈: Light chains: “kappa” or “l(fā)ambda” Heavy chains: IgG, IgA, IgM,60,B細(xì)胞的不同克隆性表達(dá),Normal: k 50; 39,k 2; 98 +,k 3; 93 +,k 86 ; 1,k 1; 99,k 5; 84 +,k 99+; 1,K99+; 1,61,慢性淋巴細(xì)胞增殖性疾病 （Chronic Lymphoproliferative Disease）,CLL來源于B細(xì)胞，具有免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因重排，CLL細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SIgM、SIgD弱表達(dá)，B系抗原為CD19、CD20、CD23、CD79a與CD5共表達(dá)。而CD38,ZAP-70,Ki67等抗原的表達(dá)與CLL預(yù)后有密切關(guān)系。CLL與其它某些淋巴瘤在形態(tài)學(xué)上相似，但在免疫表型上卻各有特點(diǎn)。,62,慢淋和B淋巴瘤分類,CLL and Non-Hodgkins Lymphoma,CD5-,CD10-,CD10+,Follicular Cell Or Burkitts Lymphoma,SLVL or Marginal Zone Lymphoma or Hairy Cell Leukemia,CD5+,B-CLL or Mantle Cell Lymphoma,MCL：t(11;14)；NCCN要求對所有CLL患者檢測t(11;14)或CCND1表達(dá),63,ALL/CLL?,64,評估CLD的抗體,First: CD5,CD19,kappa,lamda CD3,CD20,CD23,CD10,CD45 B-cell:CD22,FMC7,CD11c,CD103 CD38,CD25,CD79b,heavychain (約12-15Ab) T-cell:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56 CD16, TCR/，TCR/ 特殊用途: CD30,bcl-2,TdT CD1a,CD34,CD71 Total:約12-16個b,65,B-CLL與類似淋巴瘤的免疫表型,Antigen B-CLL HCL Mantle Cell Lymphoma SLVL Follocular Lymphoma SIg +/- + + + + CD5 + + CD19 + + + + + CD20 + + + + CD22 +/- + + + + CD23 + CD79b +/- + + + + FMC-7 + + + CD10 + CD103 + CD25 + + _ +/- CD11c +/- + +/- Antigen：抗原；SIg：膜免疫球蛋白；B-CLL：B慢淋；HCL：毛細(xì)胞型白血??；Mantle Cell Lymphoma：套狀淋巴瘤：SLVL：絨毛樣脾淋巴瘤：Follocular Lymphoma：濾泡型淋巴瘤,66,濾泡中心B細(xì)胞,淋巴瘤,增殖,67,慢性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-CLL）積分系統(tǒng),B-CLL：3-5分；非B-CLL：0-2分,68,ALL/CLL？-MZL,69,CLL,70,CLL,71,MCL,72,HCL,73,HCL,74,FL,75,FL,76,DLBCL,77,DLBCL,78,CLL and Non-Hodgkins Lymphoma,NK LGL,CD2+ CD3+,T-Cell Lineage,CD38+ CD2-, CD19-,Plasma Cell Leukemia/ Myeloma,B-Cell Lineage,CD19+ Clonal Ig,CD16+ and/or CD56+ CD2+, CD3-,CD4+,T-Cell CLL T-Cell Lymphoma T-PLL,ATLL (Adult T-Cell Leukemia),T-Cell LGLL,CD8+,CD7-,Sezary Syndrome,慢淋和T淋巴瘤分類,79,T-CLL與類似淋巴瘤的免疫表型,Antigen T-CLL ATLL T-PLL T-LGL (CD3+) NK-LGL(CD3-) TdT CD1 CD2 + + + + + CD3 + + + + CD5 + + + + CD7 +/- +/- +s + + CD16 +/- + CD56 +/- + CD57 + + CD4+CD8+ +/- +/- CD4-CD8+ +/- + +/- CD4+CD8- + + + CD25 +/- +s +/- +/- NR HLADR +/- +/- + +,80,81,T-PLL,82,T-PLL,83,T細(xì)胞克?。═CR V分析）,84,單克隆T細(xì)胞,85,86