液相色譜法分離手性藥物.ppt

,液相色譜法分離手性藥物,概念,許多藥物中存在著分子組成與構(gòu)造完全相同但分子的立體結(jié)構(gòu)不同的化合物，他們是立體異構(gòu)體，不能完全疊合但能互為鏡像，（如左手與右手），這就是手性(chirality)。,手性藥物,藥物作用的靶分子都是手性的，因此藥物分子與靶分子的不對(duì)稱性必須相匹配（手性識(shí)別手與手套）。 另外，分子藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，含有手性因素的化學(xué)藥物對(duì)映體，在人體內(nèi)的藥理活性、代謝過程和毒性存在著顯著差異。在通常情況下，只有一個(gè)對(duì)映體具有藥理作用，而另一個(gè)對(duì)映體不僅無藥理作用，還會(huì)產(chǎn)生一定副作用。 如20世紀(jì)60年代，鎮(zhèn)靜藥反應(yīng)停（thalidomide,沙利度胺）的消旋體用作緩解妊辰反應(yīng)作用，后來發(fā)現(xiàn)在歐洲服用過的孕婦不少產(chǎn)下海豚狀畸形兒。隨后研究表明：反應(yīng)停右旋體（R型）有鎮(zhèn)靜作用，左旋體（S型)具有胚胎毒性和致畸作用。,研究背景,1992年FDA發(fā)布手性藥物指導(dǎo)原則，要求所有在美國(guó)上市的消旋體新藥，生產(chǎn)者均需提供詳細(xì)報(bào)告，說明藥物中所含對(duì)映體各自的藥理作用、毒性和效果。 顯然，單一異構(gòu)體的試驗(yàn)次數(shù)比較單純，經(jīng)濟(jì)上更合算。 目前普遍使用的2000多種合成藥物中有600余種為手性藥物，而活性的單一對(duì)映體藥物不足100種，其它500余種都是左右旋混在一起的消旋體藥物。 1999年，手性藥物市場(chǎng)第一次超過1000億美元，單一異構(gòu)體藥物銷售額達(dá)到1150億美元，占世界藥品市場(chǎng)3600億美元的32%。,常用的手性藥物測(cè)定技術(shù),高效液相色譜 (HPLC) 氣相色譜 (GC)(樣品需具有一定的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性） 毛細(xì)管電泳(HPCE) 超臨界流體色譜（SFC),HPLC,80年代初HPLC法迅速成為藥物對(duì)映體分離和測(cè)定最為廣泛應(yīng)用的方法。 特別適用于極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的手性藥物的分析。 HPLC用于手性分離概括起來可分為兩大途徑：間接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。,液相色譜法分離手性藥物,直接法（CMPA、CSP）： 對(duì)映體之一與手性固定相或手性流動(dòng)相添加劑間發(fā)生分子間的三點(diǎn)作用（較穩(wěn)定），另一對(duì)映體發(fā)生兩點(diǎn)作用；形成暫時(shí)的非對(duì)映異構(gòu)體的結(jié)合物質(zhì)，通過洗脫分離。 間接法（CDR) 又稱為非對(duì)映體拆分法或柱前手性衍生化法 對(duì)映體混合物在預(yù)處理中進(jìn)行柱前衍生組成一對(duì)非對(duì)映體(Diastereoisomers) ，依其理化性質(zhì)的差異，在非手性柱上得以分離。,間接法：柱前衍生,優(yōu)點(diǎn)： *可采用通用的非手性柱分離； *通過衍生化可提高檢測(cè)靈敏度； *分離條件簡(jiǎn)單； *分離效果好 缺點(diǎn)： *要有可被衍生化的基團(tuán)； *要有高光學(xué)純度的手性試劑； *對(duì)個(gè)對(duì)映體衍生化率速和平衡常數(shù)應(yīng)一致； *衍生化和色譜過程中不能發(fā)生消旋化；,直接法：,手性流動(dòng)相添加劑（CMPA）法： （又可稱為手性流動(dòng)相(CMP)拆分法或手性洗脫法） & 環(huán)糊精(Cyclodextrins)類（主要是-、-和-環(huán)糊精及其衍生物）； & 手性離子對(duì)配合劑(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟腦磺酸、奎寧和奎尼丁等； & 配位體交換型手性流動(dòng)相添加劑（Chiral Ligand-exchange Complexs, CLEC) 。 手性固定相（CSP）法,手性固定相（CSP）法,優(yōu)點(diǎn)是： 能廣泛適用于各類化合物，適于常規(guī)及生物樣品的分析測(cè)定； 除非必須衍生化，否則無需高光學(xué)純度試劑； 樣品處理步驟簡(jiǎn)單。 制備分離方便，定量分析的可靠性較高； 缺點(diǎn)是： 樣品有時(shí)也須作柱前衍生（但不一定是手性衍生化試劑）， 對(duì)樣品結(jié)構(gòu)有一定限制，其適用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那樣廣泛。 迄今為止，CSP柱商品已有40多種，價(jià)格大多昂貴，尚未有一種具有類似ODS柱的普遍適用性。,常用的手性固定相（CSP）法,& 刷（Brush）型或稱為Prikle型 & 手性聚合物固定相（如纖維素、淀粉，合成的手性聚合物）； & 含肽或蛋白質(zhì)手性固定相； & 含環(huán)糊精（Cyclodextrin）及其衍生物的手性固定相； & 大環(huán)抗生素（Macrocyclic antibiotics）型 & 配位交換（|Ligand exchange）型 & 冠醚（Crown ethers）型,在手性拆分中，溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識(shí)別能力，但可能引起色譜峰變寬而導(dǎo)致分離變差。因此確定手性分析方法過程中要考慮柱溫的影響，確定最優(yōu)柱溫。 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇合適的CSP柱是非常重要的。 Chiral Technologies Europe(法國(guó))和Chiral Technologies(美國(guó)，是日本Daicel化學(xué)工業(yè)公司的全資子公司 )是專門為制藥和農(nóng)業(yè)化學(xué)及相關(guān)工業(yè)提供對(duì)映體分離服務(wù)的公司。服務(wù)的領(lǐng)域包括分析方法的開發(fā)和cGMP噸級(jí)單一對(duì)映體的分離和商業(yè)規(guī)模工藝的開發(fā)等。 手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicel公司制造的Chiralcel柱。 Daicel固定相的廣泛選擇性和高負(fù)載性能，使Chiral Technologies及整個(gè)Daicel集團(tuán)成為手性色譜產(chǎn)品和服務(wù)市場(chǎng)的領(lǐng)先者。Daicel的手性固定相是以纖維素為基礎(chǔ)的，如將甲酰(3，5-二甲苯胺)基引入纖維素的羥基。,合適的CSP柱,手性聚合物固定相Chiralcel柱類型與應(yīng)用,經(jīng)驗(yàn),CHIRALPAK AD-H CHIRALCEL OD-H(50-60%) CHIRALCEL OJ-H # CHIRALPAK AS-H (20%),DAICEL 柱使用的溶劑,流動(dòng)相采用烷烴-醇混合物體系（主要是正己烷-異丙醇），極性溶劑乙醇、甲醇、乙腈容許存在。 以下溶劑一點(diǎn)也不可以存在（會(huì)破壞柱子）： 丙酮、氯仿、DMF、DMSO、THF、甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、吡啶,流動(dòng)相添加劑,酸性化合物：TFA乙酸、甲酸 堿性化合物：DEA乙醇胺、丁醇胺 加入量0.1-0.2，不超過0.5。 柱子穩(wěn)定的PH范圍：2.0-7.0。,樣品溶解性,樣品含量0.5mg/ml1.0mg/ml. 酸性化合物和堿性鹽，可加添加劑來增加樣品的溶解性。 仍不好溶，可溶于100醇（甲醇、乙醇、異丙醇）;若流動(dòng)相中有烷烴則不可用乙腈. 水溶性化合物最好用反相柱，如OD-R、OD-RH、OJ-RH、AD-RH、AS-RH; 可用醇-水、乙腈-水作流動(dòng)相。,柱子壓力過高,原因：可能是雜質(zhì)堵住了柱頭（frit）。 可更換在線過濾器（in-line filter)或保護(hù)柱，或注射前過濾樣品。 由于