蛋白質工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應用.ppt

蛋白質工程的應用,第一節(jié) 抗體工程,抗體(antibody)是抗原刺激人或動物機體的免疫系統(tǒng)后，由B淋巴細胞轉化為漿細胞產(chǎn)生的、能與抗原特異性結合的免疫球蛋白。 抗體可與細菌、病毒或毒素等抗原結合，并通過特定的方式清除異物。,第一節(jié) 抗體工程,抗體工程(antibody engineering)是通過對抗體分子結構和功能關系的研究，有計劃地對抗體蛋白序列進行改造，改善抗體某些功能的技術。,抗體的分類,根據(jù)抗體的制備方法和技術，將抗體分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體三類。,抗體的分類,多克隆抗體：傳統(tǒng)的抗體制備的方法是將天然抗原經(jīng)過各種途徑免疫動物，因為抗原性物質具有多種抗原決定簇，所以刺激機體產(chǎn)生了多種B細胞克隆針對不同抗原決定簇產(chǎn)生的混合抗體，并合成和分泌各抗體到血清和體液中，這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫血清。,單克隆抗體 當抗原進入體內(nèi)，在機體中就會誘導出針對不同抗原決定簇的多種抗體，如果要把這些抗體一一分開，用現(xiàn)有的生物化學或物理化學方法是根本辦不到的。1975年科勒和米爾斯坦將小鼠免疫細胞與腫瘤細胞融合，培養(yǎng)出既能迅速生長繁殖又可分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。從而獲得針對某一特殊抗原決定簇的單克隆抗體。,6,南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院,抗體的分類,單克隆抗體：同一克隆的細胞可合成和分泌在理化性質、分子結構、遺傳標記及生物學特性等方面都完全相同的均一性抗體。,1 人一鼠嵌合抗體(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。,構建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。,構建重組表達載體,克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術分離。 人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調(diào)整其效應。,人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關抗原)的嵌合抗體。,2 鼠單抗可變區(qū)的人源化,盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術。 CDR即互補決定區(qū)。Ig超變區(qū)氨基酸殘基的種類和順序特別多變，這些部位與識別抗原直接相關，為Ig分子的抗原結合部位，故稱為互補決定區(qū)。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。,經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力保持不變，結合半抗原及全抗原(如細胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）,人源化抗體的構建可用全合成法或定點突變法。 全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質粒中，進一步即可用于構建和表達改形抗體。,定點突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。,研究表明，在構建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構建時還必需包括對影響抗原結合位點的空間結構的框架序列進行操作。,定點突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。,研究表明，在構建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構建時還必需包括對影響抗原結合位點的空間結構的框架序列進行操作。,小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。 小分子抗體有很多優(yōu)點: 可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低; 分子小，穿透力強; 不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應; 在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。,3 小分子抗體,Fv,ScFv,單區(qū)抗體,最小識別單位,Fab,由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽的作用下Fab進入質周腔，裝配折疊后，它具有結合抗原的活性。,(1)Fab,Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,Fv,ScFv,連接肽,Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩(wěn)定。 在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。 連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應具有柔軟性，側鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。,單鏈抗體的構建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法; 在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時，可用定點突變法在其兩端造成適當?shù)膬?nèi)切酶位點，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達載體中; 如果從雜交瘤細胞系構建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當?shù)谋磉_載體上。,單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式: 一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達細菌蛋白總量的5%-20%，但需進行變性復性，使其形成正確的立體結構，恢復抗體活性; 二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。,即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。,(3)單域抗體,VH,約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。,(4)最小識別單位,CDR,4 雙特異抗體和多價抗體,雙鏈抗體 （Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。,雙特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應腫瘤相關抗原。另1種為對應效應成分。 即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞,將效應細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引發(fā)分子結合,激活效應細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。,Hollinger等巧妙地將抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質粒中,構建成雙鏈抗體的表達質粒,目前報道的表達質粒均為雙順反子。表達后,VLA VHB與VHA VLB交叉連結,形成雙特異性抗體。,所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應細胞再導向至腫瘤細胞處,從而使效應細胞的抗腫瘤活性增強,發(fā)揮免疫導向作用,這是腫瘤治療的新突破。,抗體庫技術是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達，然后篩選出所需的特異基因和抗體。 PCR技術; 免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達; 噬菌體表面展示文庫技術。,5 抗體庫技術,初期的抗體庫技術是從淋巴細胞中提取總RNA，反轉錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達后篩選。,它是在PCR技術和Phage Display的基礎上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與P 或P相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。,噬菌體抗體庫技術,1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。,噬菌體表面展示系統(tǒng)(phage surface display system ),噬菌體表面展示文庫技術的要點:,外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端,將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導系列的緊靠下游,隨機克隆入相應載體形成組合文庫,從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段,用固相化抗原經(jīng)“親和結合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。,使翻譯出的抗體分泌到細菌的質周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。,篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉入大腸桿菌，,該項技術的優(yōu)點: 將抗體的基因型和表型緊密