蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展.ppt

蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展,蛋白質(zhì)組學(xué)的含義 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段 蛋白質(zhì)組信息學(xué) 差異蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)組研究意義及前景,講授內(nèi)容,一、蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展（晏本菊） 二、核酶、抗體酶（陳惠） 三、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化DNA Shuffling 技術(shù)（陳惠） 四、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、肽核酸（楊婉身）,生物化學(xué)專題,主講教師 楊婉身 晏本菊 陳惠,蛋白質(zhì)組學(xué)的含義,蛋白質(zhì)組(Proteome)一詞最早由澳大利亞學(xué)者 等于1994年提出,指的是由一個(gè)基因組geneome或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有protein。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體。 同基因組學(xué)一樣,蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組序列與基因功能之間的橋梁。,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容,蛋白質(zhì)表達(dá)模式(或蛋白質(zhì)組組成)的研究 蛋白質(zhì)組組成的分析鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)中的與基因組學(xué)相對(duì)應(yīng)的主要內(nèi)容。它要求對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行表征,即實(shí)現(xiàn)所有蛋白質(zhì)的分離、鑒定及其圖譜化。雙向凝膠電泳(2-D)和質(zhì)譜(Mass spectrometry)技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù),蛋白質(zhì)組功能模式(目前主要集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系)的研究,原核及簡單真核生物的蛋白質(zhì)組研究,流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究 大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究 致病微生物的蛋白質(zhì)組研究 釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究,流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究 流感嗜血桿菌(Hae mophilus influenzae)是第一個(gè)獲得基因組全序列的生物.瑞士的一個(gè)小組通過2-DPAGE研究了流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組分,在3-10的范圍內(nèi)鑒定了約300個(gè)蛋白質(zhì)組分,然后用有兩個(gè)尿素濃度的麥黃酮(tricine)膠分離了很難分離到的5-20ku范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),還鑒定了其中的80種.另外用肝素親和層析將堿性蛋白質(zhì)富集后,在6-11的范圍內(nèi)又鑒定了102個(gè)蛋白質(zhì),其中許多是核酸結(jié)合蛋白尤其是核糖體蛋白.華盛頓大學(xué)的另一個(gè)小組將雙向電泳得到的流感嗜血桿菌303個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定了263個(gè)蛋白質(zhì),其中大部分是外膜蛋白,以及與能量代謝和大分子合成相關(guān)的蛋白質(zhì).另外發(fā)現(xiàn)了幾種不能在基因組中找到對(duì)應(yīng)序列的蛋白質(zhì).令人驚奇的是,大約22%的被鑒定了的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與預(yù)計(jì)不同的等電點(diǎn)與分子質(zhì)量,顯示它們可能經(jīng)過了翻譯后加工.,大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究 大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的序列已被測定,人們想到如果把雙向電泳得到的蛋白質(zhì)譜與基因組分析結(jié)果聯(lián)合起來,就會(huì)得到更多有用的信息.基于此想法,建立蛋白質(zhì) 基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫,希望籍此來回答以下幾方面的問題: 所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置, 各種蛋白質(zhì)的豐度, 不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化, 各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位, 某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平.目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù),其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物),對(duì)于這些蛋白質(zhì),這個(gè)數(shù)據(jù)庫可以提供基因名稱、蛋白質(zhì)名稱、EC 編號(hào)、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫編號(hào)、enbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度).,致病微生物的蛋白質(zhì)組研究 蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要應(yīng)用是在闡明新抗生素作用機(jī)理的研究上.當(dāng)今,細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素都有了抗性,尋找作用于細(xì)菌內(nèi)新的靶子的研究工作已經(jīng)展開,找到了許多有效的抗菌化合物.但目前遇到的困難在于難以揭示新的化合物的作用靶子及其作用機(jī)理.有時(shí)雖在體外發(fā)現(xiàn)新化合物能夠使某種蛋白質(zhì)失活,但在體內(nèi)是否有這種現(xiàn)象和這是否是抗菌的主要機(jī)制仍然未知,現(xiàn)在雙向電泳分析提供了一個(gè)有效手段.例如在研究抑制核糖體類抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制時(shí),對(duì)12種作用于翻譯過程的不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察,發(fā)現(xiàn)其中8種誘導(dǎo)冷休克反應(yīng)的一系列蛋白質(zhì),另4種誘導(dǎo)一系列熱休克反應(yīng)的蛋白質(zhì),因此預(yù)計(jì)新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反應(yīng),并且籍此可以推測大腸桿菌對(duì)冷熱的反應(yīng)發(fā)生于核糖體水平上.蛋白質(zhì)組研究的重要優(yōu)勢在于能夠從整體水平上分析不同條件下蛋白質(zhì)譜的變化.例如作為一種差異顯示技術(shù),這一技術(shù)已被用于比較結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌蛋白的不同,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些在基因水平上很類似的蛋白在蛋白質(zhì)水平上有很大差別,這可能部分解釋近年來牛痘作為結(jié)核病疫苗會(huì)出現(xiàn)失敗的現(xiàn)象,釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究 利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的工作早于蛋白質(zhì)組概念的提出.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因組的完成及其蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫在互聯(lián)網(wǎng)上的建立,大大加速了這一工作.最新版的數(shù)據(jù)庫包括6000多頁,每頁代表一個(gè)已知或推測的酵母蛋白.它包含以下幾方面的信息: 以序列為基礎(chǔ)的已知和推測的酵母蛋白的特征信息,如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、多肽片段大小等; 一些研究得到的關(guān)于各種蛋白質(zhì)在翻譯后加工、亞細(xì)胞定位、功能分類方面的信息; 從以往的超過5000篇關(guān)于酵母蛋白研究的文章中獲得的有關(guān)各種蛋白質(zhì)功能、相互作用、突變表型的信息.借助數(shù)據(jù)庫的有力推動(dòng),在雙向電泳蛋白質(zhì)譜上最明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的大部分得到鑒定.,正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失的缺陷型酵母的雙向蛋白質(zhì)圖譜.初步的研究表明,缺失單一基因?qū)?dǎo)致的結(jié)果并不只是缺乏此基因編碼的蛋白質(zhì),而是能導(dǎo)致其他一系列蛋白質(zhì)量的改變.一些蛋白質(zhì)減少而另一些蛋白質(zhì)增多,當(dāng)然還有一些蛋白質(zhì)被加工修飾而導(dǎo)致性狀改變.單一基因缺失的結(jié)果總是引起蛋白質(zhì)組全局性的變化.大約20%的酵母基因缺失是致死性的,另外80%則不然,這時(shí)機(jī)體能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來對(duì)抗這種內(nèi)源性的變化.這種基 因缺失的研究可能會(huì)告訴我們一些關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間相互“對(duì)話”和“作用”的重要信息,如蛋白質(zhì)間的物理聯(lián)系(這些蛋白質(zhì)可能會(huì)組成蛋白質(zhì)復(fù)合物)、信號(hào)傳遞途徑,以幫助我們了解細(xì)胞是如何構(gòu)成的以及是如何協(xié)同工作的。,多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究 線蟲的蛋白質(zhì)組研究 果蠅的蛋白質(zhì)組研究 人類的蛋白質(zhì)組研究 植物的蛋白質(zhì)組研究,果蠅的蛋白質(zhì)組研究 不同性別果蠅()成蟲的頭、胸、腹部的蛋白質(zhì)組圖譜已被分別作出,總共約有1200個(gè)蛋白質(zhì)被檢出,其中的大多數(shù)在頭、胸、腹中是相同的,但也發(fā)現(xiàn)了一部分其部位、性別特異的蛋白質(zhì).,人類的蛋白質(zhì)組研究 人類的蛋白質(zhì)組研究吸引了最多的注意力.由于人有著大量的組織、細(xì)胞類型和發(fā)育階段,對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特異的組織、細(xì)胞和疾病上.已有的證據(jù)表明,盡管人的不同組織有著很大的功能差別,但其中的許多蛋白質(zhì)是看家蛋白,因此它們的雙向圖譜可能也是近似的.這點(diǎn)與簡單生物不同,簡單生物在不同的發(fā)育階段有著極不相同的蛋白質(zhì)組.因此對(duì)于人類來說,一個(gè)高質(zhì)量的基本的雙向圖譜是非常有用的,它可以作為其他組織、細(xì)胞的參照?qǐng)D譜.人的各種組織、器官、細(xì)胞乃至各種細(xì)胞器已被廣泛研究.,植物的蛋白質(zhì)組研究,人的各種體液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等)都被用于研究與某些疾病的關(guān)系.最近澳大利亞科學(xué)家利用雙向電泳技術(shù)研究眼淚中的蛋白質(zhì)與生理狀態(tài)的關(guān)系.他們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì),這個(gè)蛋白質(zhì)非常相似于在乳腺癌細(xì)胞里高表達(dá)的另一種蛋白質(zhì).這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提供疾病診治的新的手段.在一項(xiàng)利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)進(jìn)行的酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用,導(dǎo)致許多糖蛋白的糖基缺乏,如轉(zhuǎn)鐵蛋白。,腫瘤至今仍是人類的一個(gè)頑敵.癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其他蛋白質(zhì)的翻譯后加工及許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平.腫瘤的蛋白質(zhì)組研究能提供一些以往其他技術(shù)所不能提供的早期診斷依據(jù),例如利用不同細(xì)胞組織的特征蛋白質(zhì)譜,可以判別一些難以判定來源的腫瘤細(xì)胞的來源.丹麥的一個(gè)小組利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)結(jié)合組織冰凍切片技術(shù)分析了150例膀胱癌病人的組織,發(fā)現(xiàn)在所有的鱗狀細(xì)胞瘤的尿液中均能發(fā)現(xiàn)一種化學(xué)引誘劑銀屑素(),推測其極可能作為這種腫瘤的早期標(biāo)志物.,基因組計(jì)劃無疑為醫(yī)療、醫(yī)藥領(lǐng)域帶來一場革命,但也應(yīng)該看到,單純的遺傳分析很難診斷多因素的疾病.復(fù)雜的基因間相互作用,細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)和環(huán)境的影響都會(huì)影響基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的翻譯后加工.因此,可靠的診斷和治療應(yīng)基于機(jī)體漸進(jìn)發(fā)展過程的調(diào)控及失調(diào),并且必須考慮到環(huán)境因素的影響.蛋白質(zhì)組的研究正是探索這一領(lǐng)域的有力武器.人們不難預(yù)期,基因組計(jì)劃的不斷推進(jìn)會(huì)給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫;生物信息學(xué)的發(fā)展會(huì)給蛋白質(zhì)組計(jì)劃提供更方便有效的計(jì)算機(jī)分析軟件;國際互聯(lián)網(wǎng)會(huì)使各國各領(lǐng)域科學(xué)家有關(guān)蛋白質(zhì)組研究的成果出現(xiàn)新的集成;新的技術(shù)會(huì)不斷涌現(xiàn),蛋白質(zhì)組研究方法會(huì)象技術(shù)一樣易于操作,并滲透到人類活動(dòng)的方方面面,對(duì)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生各行各業(yè)帶來新的革命,功能蛋白質(zhì)組學(xué),功能蛋白質(zhì)組學(xué)的提出及概念 功能蛋白質(zhì)組學(xué)是指從動(dòng)態(tài)和整體的角度研究蛋白質(zhì)的功能及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是位于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組研究之間的層次。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容 蛋白質(zhì)群體研究,數(shù)據(jù)庫 說明 WWW地址 蛋白質(zhì)序列庫: SWISS-PROT 內(nèi)容豐富,提示詳盡 http:/www.expasy.ch/sport/ PIR較 /pir/pir-psi.html TrEMBL (EMBL的翻譯) http:/www.expasy.ch/sprot /OWL (非冗余庫) http:/www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html 核苷酸數(shù)據(jù)庫: EMBL 歐州分子生物學(xué)http:/www.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db/ebi/topembl.html GenBank美國生物工程信息中心/Web/Search/index.htm ldbESTCDNA序列標(biāo)記/dbEST/,模體與域: PROSITE 序列模體 http:/www.expasy.ch/sport/prosite.html BLOCKS 保守序列 / ProDom蛋白質(zhì)域http:/protein.toulouse.inra.fr/prodom.html SBASE蛋白質(zhì)域http:/base.icgeb.trieste.it/sbase/ 二維電泳(2DPAGE): WORLD-2DPAGE國際2DPAGE庫的完整索引http:/www.expasy.ch/ch2d/2d-index.htm lLinksto2DPAGEPhoretix公司的連絡(luò)表/links.htm 2DWG二維電泳圖譜元庫/2dwgDB/ Flicker成對(duì)電泳圖譜比較/flicker/ 三維結(jié)構(gòu)庫: PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)庫/ SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu)http:/www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html SWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示http:/www.expasy.ch/sw3d/ DSSP二級(jí)結(jié)構(gòu)命名ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dssp FSSP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)家族ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/fssp/,翻譯后修飾: O-GLYCBASE糖基化http:/www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/ PHOSPHOBASE磷酸化http:/www.cbs.dtu.dk/databases/PhosphoBase/ deltamass翻譯后修飾匯編.au/WWWDOCS/SVIMRDOCS/MassSpec/deltamassV2.html 基因組庫: dblist基因組庫目列http:/www.expasy.ch/amos-www-links.html#organisms,GDB基因組庫/ OMIM遺傳病表型/omim/ GeneCards生物醫(yī)學(xué)知識(shí)http:/bioinfo.weizmann.ac.il/cards/,代謝庫: Boehringer圖代謝路徑圖http:/www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-index ENZYME酶及其反應(yīng)的命名http:/www.expasy.ch/sprot/enzyme.html Ecolyc大腸桿菌中間代謝/ecocyc/ecocyc.html HinCys嗜血流感中間代謝/ecocyc/hincyc.html WIT酶和代謝途徑/WIT/ 相互作用: GIF-DB果蠅發(fā)育中的基因相互作用http:/gifts.univ-mrs.fr.GIF-DB/GIF-DB-home-page.html KEGG基因相互作用http:/www.genome.ad.jp/kegg Deletion酵母功能基因組/group/yeast-deletion-project/deletion.html,表3 用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫搜索軟件 屬性參數(shù)/軟件名稱 WWW地址蛋白質(zhì)質(zhì)量+蛋白質(zhì)序列標(biāo)記PeptideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.html TagIdenthttp:/expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html 蛋白質(zhì)的肽質(zhì)印記: MassSearchhttp:/cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1-3.html MS-Fithttp:/falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htm PetideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.html ProFound/PROWL/prot-id-main.html,表3 用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫搜索軟件 屬性參數(shù)/軟件名稱 WWW地址蛋白質(zhì)質(zhì)量+蛋白質(zhì)序列標(biāo)記PeptideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.html TagIdenthttp:/expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html 蛋白質(zhì)的肽質(zhì)印記: MassSearchhttp:/cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1-3.html MS-Fithttp:/falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htm PetideSearchhttp:/www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.html ProFound/PROWL/prot-id-main.html MultiIdenthttp:/expasy.hcuge.ch/sprot/multiident.html,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段,蛋白質(zhì)組分析概述,蛋白質(zhì)組研究的核心用于分離的雙向電泳(2 -DE),蛋白質(zhì)組研究的百科全書數(shù)據(jù)庫(database),蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱鑒定技術(shù)(Identication),蛋白質(zhì)組技術(shù)的規(guī)模高流通量篩選(HTS),目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(SPOT),而一個(gè)細(xì)胞系可以表達(dá)上萬個(gè)基因,加上蛋白質(zhì)加工修飾的多樣性,一個(gè)樣品中的蛋白種類可達(dá)106種。因此,對(duì)于一些低拷貝蛋白,通常先將蛋白粗提液通過親和柱純化,再由一維或二維電泳分離。單向電泳的優(yōu)點(diǎn)在于幾乎所有蛋白質(zhì)均溶于,分子量在10000-300000范圍內(nèi)均能有效分離,極酸、極堿蛋白極易檢出。雙向凝膠電泳(2-dimensional gel electrophoresis)原理簡明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿梯度分離,至各自的等電點(diǎn);隨后,在沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。80年代固相化梯度(,IPG)的發(fā)明和完善,解決了梯度不穩(wěn)的問題,使2-的重復(fù)性和上樣量大為改善。,雙向凝膠電泳（2-DE）,樣品的制備,高分辨率和重復(fù)性,分離后的斑點(diǎn)檢測(spot detection),概念,蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心. 雙向電泳由arrell，s于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè) 蛋白,并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的,而是隨環(huán)境而變化 。雙向電泳原理簡明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿梯度分離至各自的等電點(diǎn),隨后,再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離. 目前,隨著技術(shù)的飛速發(fā)展,已能分離出10000個(gè)斑點(diǎn)(),樣品制備和溶解同樣事關(guān)2- 的成效,目標(biāo)是盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚,以提高分辨率 用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白,兩者聯(lián)合有協(xié)同作用 對(duì)樣品的預(yù)處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物質(zhì) 。理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的完全處理 。低豐度蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能,代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”,故分高低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn)亞細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)、提高加樣量(已達(dá)到115級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)) 、應(yīng)用敏感性檢測,可以提高其敏感性 如一種多肽免疫2 -印跡是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來分析和檢測提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白的分離是另一難點(diǎn)， 由于堿性范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流的產(chǎn)生,對(duì)pI超過10的堿性蛋白,通過產(chǎn)生010%的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之， 亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質(zhì)的穩(wěn)定性。,2 -面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性 ：高分辨率確保蛋白最大程度的分離,高重復(fù)性允許進(jìn)行凝膠間配比.對(duì)2-而言,有3種方法分離蛋白: 1)ISO-DALT以Farrell,s技術(shù)為基礎(chǔ) 第一向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì),在管膠內(nèi)建立梯度 隨著聚焦時(shí)間的延長,梯度不穩(wěn),易產(chǎn)生陰極漂.2)NEPH用于分離堿性蛋白(7.0) 如果聚焦達(dá)到平衡狀態(tài),堿性蛋白會(huì)離開凝膠基質(zhì)而丟失 因此,在等電區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成,但很難控制 3)IPG-DALT發(fā)展于80年代早期.由于固相梯度的出現(xiàn)解決了梯度不穩(wěn)的問題 .通過immobiline共價(jià)偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的梯度,克服了的缺點(diǎn),從而達(dá)到高度的重復(fù)性 目前可以精確制作線性、漸進(jìn)性和型曲線,范圍或?qū)捇蛘奶荻? 新的酸性3-5或堿性6-11的IPG凝膠梯度聯(lián)合商品化的4-7的梯度可對(duì)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)組重疊群從而有效分離.,分離后的斑點(diǎn)檢測()亦很重要 .所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外,還需考慮反應(yīng)的線性、飽和閾/動(dòng)態(tài)范圍、敏感性、對(duì)細(xì)胞蛋白群的全體定量分析的適應(yīng)性、可行性. 目前,沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和及分離后分析技術(shù). 銀染已成為一種檢測2- D的流行方法,可檢測少到25的蛋白,因此較考馬斯亮藍(lán)- 250敏感. 多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色,一些有機(jī)染料不適于膜 放射性標(biāo)記不依賴其代謝的活性,并僅適于對(duì)合成的蛋白質(zhì)檢測.另有一種改良的2- (差異凝膠電泳),即應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個(gè)樣品,使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個(gè),避免了幾種2 -的比較,可在納克級(jí)進(jìn)行檢測.,蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱鑒定技術(shù),與質(zhì)譜(mass spectrometry)相關(guān)的技術(shù) 氨基酸組分分析 圖象分析技術(shù)(Image analysis) 微量測序(micro-sequencing),肽質(zhì)指紋術(shù)（peptide mass fingerprint,PMF）,肽片段（peptide fragment)的部分測序,質(zhì)譜技術(shù)的現(xiàn)狀 質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用,質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用,蛋白質(zhì)和DNA的序列測定 分析復(fù)合體的蛋白質(zhì)組 研究蛋白質(zhì)修飾 分析單核苷酸多態(tài)性 研究生物分子的相互作用 鑒定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),圖象分析技術(shù),“滿天星”式的2 圖譜分析不能依靠本能的直覺,每一個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失,都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生,必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理,進(jìn)行定量分析 在一系列高質(zhì)量的2 凝膠產(chǎn)生(低背景染色,高度的重復(fù)性)的前提下,圖象分析包括斑點(diǎn)檢測、背景消減、斑點(diǎn)配比和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建。 首先,采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合(charge cou