課件：基因治療原理與研究進(jìn)展.pptVIP

2019/9/1,1,第十三章 基因治療原理與研究進(jìn)展,2019/9/1,2,基因治療的概念,將某個(gè)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。,2019/9/1,3,基因治療分類,體細(xì)胞(somatic cell)基因治療 生殖細(xì)胞(germline)基因治療,只限于某一體細(xì)胞的基因的改變 只限于某個(gè)體的當(dāng)代 對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正 當(dāng)代及子代,2019/9/1,4,內(nèi)容提要,第一節(jié) 基因治療的策略 第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 第三節(jié) 基因干預(yù) 第四節(jié) 治療基因的受控表達(dá) 第五節(jié) 基因治療的應(yīng)用研究 第六節(jié) 基因治療的問(wèn)題與展望,2019/9/1,5,第一節(jié) 基因治療的策略,一、基因置換,二、基因添加,三、基因干預(yù),四、自殺基因治療,五、基因免疫治療,2019/9/1,6,一、基因置換（gene replacement）,定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過(guò)定位重組，導(dǎo)入的正?；?，以置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。,目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行校正。 特點(diǎn)：對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。,2019/9/1,7,定向整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實(shí)現(xiàn)。 基因同源重組技術(shù)又稱為基因打靶(gene targeting）,基因同源重組技術(shù),2019/9/1,8,基因同源重組技術(shù),重組載體,染色體,校正后的染色體,2019/9/1,9,二、基因添加 (gene augmentation),定義：通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。 類型： 在基因缺陷的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；颍a(bǔ)償缺陷基因的功能，細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去； 向靶細(xì)胞中導(dǎo)入其本來(lái)不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。,2019/9/1,10,定義：采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使 之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。 例如反義核酸、核酶或干擾RNA技術(shù)等。,三、基因干預(yù)（gene interference）,2019/9/1,11,原理：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。 為惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。,四、自殺基因治療,2019/9/1,12,自殺基因的作用機(jī)制,2019/9/1,13,TK/GCV：?jiǎn)渭儼捳畈《荆╤erps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無(wú)毒的核苷類似物丙氧鳥(niǎo)苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。,（一）自殺基因系統(tǒng),CD/5-FC：大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無(wú)毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。,2019/9/1,14,旁觀者效應(yīng)(bystander effect)：“自殺基因”導(dǎo)入后，不僅使導(dǎo)入了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰或遠(yuǎn)處的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。 明顯增強(qiáng)了自殺基因的腫瘤殺傷作用。,（二）旁觀者效應(yīng),2019/9/1,15,五、基因免疫治療,通過(guò)將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。,2019/9/1,16,第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)移技術(shù),一、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),二、非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),2019/9/1,17,1. ex vivo（經(jīng)活體） 是指在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。 2. in vivo（活體內(nèi)） 是指將目的基因直接應(yīng)用于患者體內(nèi)。,根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑不同，基因治療分為：,2019/9/1,18,基因轉(zhuǎn)移的兩種途徑,in vivo,ex vivo,靶細(xì)胞,將目的基因直接輸入體內(nèi),將目的基因?qū)牖颊甙屑?xì)胞,體外培養(yǎng),將重組靶細(xì)胞回輸體內(nèi),2019/9/1,19,一、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。,2019/9/1,20,（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）載體,人類免疫缺陷病毒 （HIV）,2019/9/1,21,逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期,2019/9/1,22,兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR。 LTR由U3、R和U5三部分組成，內(nèi)含增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、poly(A)加尾信號(hào)及病毒整合序列(IS) 。 病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因： gag、pol和env基因（編碼包裝蛋白）。 5端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（） 等。,1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),2019/9/1,23,2. 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,保留病毒顆粒的包裝信號(hào)，而缺失病毒顆粒包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。,2019/9/1,24,2. 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),輔助細(xì)胞株 它由另一種缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建而成。該細(xì)胞株能合成包裝蛋白，用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝。由于缺乏包裝型號(hào)，本身不能被包裝成病毒顆粒。,2019/9/1,25,逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng),2019/9/1,26,逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。 逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因缺失，但不影響其他部分的活性。 前病毒通過(guò)LTR高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。 包裝好的假病毒顆粒易于分離制備。,3. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn),2019/9/1,27,4. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn),隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。,2019/9/1,28,（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體,2019/9/1,29,腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無(wú)包膜DNA病毒。它通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。,2019/9/1,30,1.腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn),基因?qū)胄矢撸?宿主范圍廣； 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無(wú)關(guān)； 重組腺病毒可通過(guò)口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注； 腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因。,2019/9/1,31,2. 腺病毒載體缺點(diǎn),不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。治療基因表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短。 宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。 部分環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。 靶向性差。,2019/9/1,32,（三）腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）載體,AAV是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5 kb，無(wú)包膜。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。,2019/9/1,33,腺相關(guān)病毒基因組的結(jié)構(gòu),：包裝信號(hào)序列； REP:病毒復(fù)制基因； CAP:編碼衣殼蛋白的基因； ITR：反向末端重復(fù)序列,2019/9/1,34,1. AAV的特點(diǎn),以潛伏感染為主； 高效定點(diǎn)整合至人染色體中，避免隨機(jī)整合可能帶來(lái)的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性。,2019/9/1,35,2. AAV載體的缺陷：,AAV載體容量小，最多只能容納5 kb外源DNA片段。 感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。 在40%80%的成人中存在過(guò)感染，可能會(huì)引起免疫排斥。,2019/9/1,36,可編輯,2019/9/1,37,二、非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),（一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 基本原理：利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。,2019/9/1,38,脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖,2019/9/1,39,（二）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù),將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。,2019/9/1,40,受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖,2019/9/1,41,（三）基因直接注射技術(shù) 如：肌內(nèi)注射攜帶凝血因子 基因的重組AAV注射液，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子 。,2019/9/1,42,第三節(jié) 基因干預(yù),一、反義RNA 二、RNA干擾 三、核酶,2019/9/1,43,一、反義RNA （一）反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控 指能與特定基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合的一類RNA,可抑制一些有害基因的翻譯。 關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題： 1. 專一性轉(zhuǎn)移問(wèn)題 2. 反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題,2019/9/1,44,（二）受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù),受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)可以實(shí)現(xiàn): 受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高； 被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。,2019/9/1,45,（三） 反義RNA的應(yīng)用前景,（1）安全性高,（2）反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便,（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng),（4）能直接作用于一些RNA病毒,2019/9/1,46,二、RNA干擾 （RNA interference，RNAi）,由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象：與其有同源序列的mRNA被降解，從而抑制了該基因的表達(dá)。,2019/9/1,47,（一）RNA干擾的機(jī)制,2019/9/1,48,（二）RNA干擾的應(yīng)用前景,1. 研究基因功能的新工具,2. 腫瘤的基因治療,3. 病毒性疾病的基因治療,2019/9/1,49,三、核酶(ribozyme),具有酶活性的RNA，可降解特異的mRNA序列。,核酶,靶RNA,2019/9/1,50,核酶的作用機(jī)制,2019/9/1,51,（一）核酶的設(shè)計(jì),用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列（guide sequences）。,引導(dǎo)序列,2019/9/1,52,（二）核酶的應(yīng)用,與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來(lái)，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。,2019/9/1,53,第四節(jié) 治療基因的受控表達(dá),治療基因的受控表達(dá)包括控制治療基因表達(dá)的時(shí)間、空間和水平三個(gè)方面。 其策略包括：基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制、基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等。,2019/9/1,54,利用特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件來(lái)控制治療基因表達(dá)的細(xì)胞或組織特異性。,一、基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制,使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件，例如酪氨酸酶基因的利用。 使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件，例如甲胎蛋白(AFP)基因的利用。,2019/9/1,55,二、基因外部的調(diào)節(jié)機(jī)制,通過(guò)施加外部刺激，比如對(duì)病灶局部進(jìn)行熱處理或電離輻射等，促進(jìn)治療基因在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)。,2019/9/1,56,三、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá),利用病灶特異的微環(huán)境及其特異表達(dá)的基因來(lái)控制治療基因的表達(dá)。如腫瘤組織往往會(huì)出現(xiàn)葡萄糖缺乏或缺氧等微環(huán)境，其中高表達(dá)的GRP78/Bip蛋白編碼基因的啟動(dòng)子即可用于控制治療基因的腫瘤組織的特異表達(dá)。,2019/9/1,57,四、治療基因的誘導(dǎo)表達(dá) 可誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)能防止治療基因表達(dá)不再受外界控制。 這種系統(tǒng)的必要成分：一種是轉(zhuǎn)錄激活物，它與DNA結(jié)合的活性受某種誘導(dǎo)藥物控制；另一種則是特異性基因表達(dá)調(diào)控元件，僅對(duì)這種轉(zhuǎn)錄激活物有所響應(yīng)。,2019/9/1,58,四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng),四環(huán)素操縱子中的抗性基因的轉(zhuǎn)錄受阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控，而阻遏蛋白的活性又受到四環(huán)素藥物的調(diào)控，其在四環(huán)素存在時(shí)會(huì)優(yōu)先結(jié)合藥物而無(wú)法與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合，即不能發(fā)揮阻遏轉(zhuǎn)錄的作用。 。,（一）四環(huán)素操縱子中的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控,2019/9/1,59,（二）四環(huán)素操縱子在治療基因誘導(dǎo)表達(dá)系 統(tǒng)中的應(yīng)用,Tet-Off系統(tǒng)：轉(zhuǎn)錄激活物保留了原阻遏蛋白的四環(huán)素結(jié)合特性，即與四環(huán)素結(jié)合時(shí)將不能與對(duì)應(yīng)的表達(dá)調(diào)控元件結(jié)合，而無(wú)法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。 Tet-On系統(tǒng)：轉(zhuǎn)錄激活物改造了原阻遏蛋白的四環(huán)素結(jié)合特性，即與四環(huán)素結(jié)合時(shí)才能與對(duì)應(yīng)的表達(dá)調(diào)控元件結(jié)合，而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。,2019/9/1,60,2019/9/1,61,第五節(jié) 基因治療的應(yīng)用研究,一、遺傳病的基因治療研究,1腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏癥 2珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病 3血友病和其他血漿蛋白缺乏癥 4苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病 5萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征 6家族性高膽固醇血癥 7囊性纖維化病,2019/9/1,62,二、惡性腫瘤基因治療研究,常用基因治療策略： 基因增補(bǔ) 基因干預(yù)技術(shù) 自殺基因治療分子化療 腫瘤的免疫基因治療 提高化療效果的輔助基因治療 （藥物增敏基因治療；耐藥基因治療）,2019/9/1,