《CR及質粒提取》PPT課件.ppt

PCR技術,聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，是分子克隆技術中的常用技術之一。 PCR具有反應快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應用于分子生物學的各個領域。,實驗目的：掌握PCR原理，學習PCR操作過程。 實驗原理：在微量離心管中，加入適量的緩沖液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA聚合酶，一對引物，以高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個反應為一個循環(huán)，經過2535次循環(huán)，最終使特異區(qū)段的DNA擴增數百萬倍，滿足分子生物學下游操作。,PCR擴增反應體系：,1. PCR擴增反應體系,2. PCR擴增程序設置,預變性 94 5 變 性 94 30 退 火 60 30 延 伸 72 40“ 補充延伸 72 10 8 保存,30個循環(huán),堿裂解法提取質粒DNA,質粒 (plasmid) 是存在于細菌染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA。具有可自主復制、傳給子代、也可丟失及在細菌之間轉移等特性，與細菌的遺傳變異有關。 作用： 攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，在基因克隆、表達中具有重要作用。,基因克隆操作步驟（五字經） 分載體和目的基因的分離 切限制性內切酶的應用 接載體和目的基因拼接成重組體 轉重組體的轉化 篩DNA重組體篩選與鑒定,質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。 本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒的提取過程。,實驗目的：掌握堿裂解法提取質粒的原理、步驟及各試劑的作用。,實驗原理：在堿性環(huán)境中，細菌染色體DNA變性分開，而質粒DNA雖變性但仍處于纏繞狀態(tài)。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，最后用酚、氯仿抽提純化得到質粒DNA。,1. 將1.5 ml過夜培養(yǎng)菌液放于EP管中，10 000 r/min離心1分鐘，棄去上清液。 2. 加100 l 溶液，劇烈震蕩使菌體懸浮均勻，室溫放置5分鐘。 3. 加200 l 溶液（現配現用），輕柔顛倒混勻46次，室溫放置5分鐘。 4. 加入150l預冷的溶液 ，輕柔顛倒混勻46次，冰上放置10分鐘。,操作過程,溶液I： 50 mmol/L葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA， pH 8.0 溶液II： 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 溶液III：29.4g乙酸鉀，11.5ml冰乙酸， H2O至100ml。,5. 12 000 r/m離心15 分鐘(如果上清液仍然渾濁，可將上清液移出，再次離心5分鐘）。將上清液轉移至EP管中，加等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提一次（12 000r/min離心10分鐘）。 6. 吸出上清液，加2.5倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置10分鐘，12 000r/min離心10分鐘，沉淀DNA。 7. 70%乙醇洗滌沉淀2次，自然揮干。 8. 所得DNA溶于3050 l TE中，-20保存?zhèn)溆谩?操作過程,TE溶液：10 mm