藥品生物檢定技術(shù)簡介.ppt

1,一、教學(xué)目標 1.熟悉生物檢定技術(shù)的概念； 2.熟悉藥品質(zhì)量控制中常用的生物檢定技術(shù)項目； 3.了解有關(guān)藥品生物檢定技術(shù)的原理 4.了解基本的操作技術(shù)。,第八章 藥品生物檢定技術(shù)簡介,2,藥品生物檢定技術(shù)-利用生物體（微生物、細胞、離體組織或動物）對藥物的特定藥性、毒性作用，來測定生物藥品的效價，檢查藥品中的有害物質(zhì)以及對制劑進行微生物限度、無菌檢查的技術(shù)方法。,3,第一節(jié) 無菌檢查 無菌檢查法-檢查藥品 、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。 它是判斷供試品是否被微生物污染的一種方法。,4,一、技術(shù)要求： 純凈度10000級的局部純凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)。 全過程無菌操作。 單向空氣區(qū)、工作臺面、環(huán)境符合國家相關(guān)標準。,5,二 . 培養(yǎng)基（Medium） 1、培養(yǎng)基：是供微生物、植物、動物組織生長 和維持用的人工配制的養(yǎng)料（營養(yǎng)物質(zhì)） 保存： 保存于2-25。 應(yīng)防潮、避光、陰涼處保存 碳水化合物、含N物、無機鹽 一般含有： 維生素、H2O 、 抗菌素、色素,6,2、種類 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基 改良馬丁培養(yǎng)基：（真菌培養(yǎng)基） 選擇性培養(yǎng)基 對氨基苯甲酸培養(yǎng)基（磺胺類） 聚山梨酯80（非水溶性供試品） 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基： 0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基： 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：,7,聚山梨酯80（20，40，60，65，80，85） （吐溫80） tween 80： 0 / W 脂肪酸山梨坦（20，40，60，65，80） （司 盤） Span ： W / 0 親水，親油基團的表示方法,8,3、培養(yǎng)基的適用性檢查： 無菌檢查： 隨機抽 5瓶（或支） 生長 14天，應(yīng)無菌 靈敏度證明所加的菌種能夠在培養(yǎng)基 中生長良好 。 三.方法驗證試驗： 正式測定之前，需要先測定供試品是否具有抑細菌和抑真菌作用、避免假陰性出現(xiàn)。,9,（四）無菌檢查法： 1、檢查數(shù)量：指一次試驗所用供試品最 小包裝容器的數(shù)量。 例：2支（瓶）/2板12粒 檢查量：指一次試驗所用供試品的總量 （g 或 ML） 例： 210=20ML 240.25=6g 2、對照試驗： 陽性對照 陰性對照,10,3、檢查方法： a、薄膜過濾法：應(yīng)用廣、準確性高，適用 于任何藥品、尤其是具有抑菌作用的。 b、直接接種法：操作簡便，適用于無 抑菌 作用的供試品。 （2）培養(yǎng)觀察：培養(yǎng)14天，無細菌生長。,11,（五）結(jié)果判斷： 1、若澄清， 無菌 符合規(guī)定 雖渾濁，但無菌 符合規(guī)定 2、任一管渾濁有菌生長 不符合 3、若試驗無效 重試,12,第二節(jié) 微生物限度檢查 目的： 判斷藥品被污染的程度，細菌數(shù) 越多藥品受污染大 安全性越差。 1. 定義檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料，輔料受微生物污染程度的方法。 項目包括：細菌數(shù)、 真菌數(shù)、 酵母菌數(shù)、控制菌數(shù)。,13,2、技術(shù)要求： 結(jié)凈度10000級以下 區(qū)域、工作臺、環(huán)境符合國家標準 加入輔料（表面活性劑、中和劑、滅活劑）- 證明其對微生物生長存活無影響 30-35（細菌） 23-28 （真菌、酵母菌） 35-37 （控制菌） 結(jié)果報告以1g、1mL、10g、10mL、10 Cm2,14,3、檢驗量：一次試驗所用供試品的量 （g、ml、cm2） 一般供試品為：10g、10mL。 化學(xué)膜劑：100 cm2 中藥膜劑：50cm2 4、供試品制備：按照藥典規(guī)定制備,15,5、菌種： A.細、真、酵 ，對照試驗菌種 ： 大腸埃希菌、 金葡菌、枯草、白色念朱菌、黑曲霉 B.控制菌，對照試驗菌種：大腸、金菌、乙型 副傷寒、銅綠假單胞菌、芽孢梭菌 傳代次 數(shù)： 5 代。 6、培養(yǎng)基：制備的滅菌條件：121 20min 7、方法驗證 ： 確證所用方法適于該菌的計數(shù)檢查,16,8、方法： （1）細、真、酵： 測藥物在單位質(zhì)量 （體積）內(nèi)所存在的活菌數(shù)量。 評價生產(chǎn)過程中原輔料設(shè)備、器具 工藝、環(huán)境、操作者的衛(wèi)生狀況。 （2）方法： 平 皿 法： 法定方法、最常用 薄膜過濾法：,17,（3）控制菌 大腸埃希菌：是糞便污染的指標菌 大腸菌群：是藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生 指標菌 沙門菌： 是人畜共患的腸道病原菌，引起傷 寒、腸炎、食物中毒 銅綠假單胞菌：燒傷、燙傷、眼科、外科 ， 引起化膿性感染 金葡菌 ： 化膿 梭菌： 破傷風(fēng)、肉毒素,18,第三節(jié) 抗生素效價的微生物檢定法 一、管碟法： 1、定義： 利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用 比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn) 生抑菌圈的大小 以 測定供試品效價的一種方 法。,19,2、方法 A. 二劑量法： 碟4 2個 高：低（供試品） 劑距 2：1 或 4：1 2個 高：低（對照品） B. 三劑量法：碟6個 3個 高：中：低 （供試品） 劑距 1：0.8 3個 高：中：低（對照品）,20,二、濁度法 標準曲線法 二劑量法 三劑量法,21,防病、治病的 三大藥源,第四節(jié) 生化藥物的效價測定法 P 257,22,一、生物藥物 利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理和方法制備的一大類藥物。,23,包括： 生化藥物、生物合成藥物、生物制品。,24,*（一）生化藥物（biochemical drugs） 從動物、植物及微生物中提取的，用 生物化學(xué)半合成制備的或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的具有生物化學(xué)活性的物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等。,二、生物藥物的分類,25,生化藥物： 例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。,26,* * 2. 基因工程藥物-采用現(xiàn)代生物基因技術(shù)，借助某些微生物、動、植物來生產(chǎn)出所需的藥品。 基因工程 生物工程 細胞工程 酶工程,27,應(yīng)用前景： 方便臨床用藥； 彌補某些藥物的市場空缺； 有利于臨床治療； 有利于人類健康。 前景非常廣闊,28,*種類： 1. 氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類 2.藥用 酶類與輔酶類 3. 多糖類 4. 脂質(zhì)類 5. 核酸及其降解物和衍生物類藥物,29,常見生化藥物： 復(fù)合氨基酸、腦多肽、牛纖維蛋白原、水蛭素、生長素、催乳素、天花粉蛋白、輔酶Q10、蛋白水解酶、凝血酶、肝素、硫酸軟骨素A、靈芝多糖、透明質(zhì)酸、黃芪多糖、人參多糖、膽酸類、RNA、DNA、ATP、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿糖腺苷、環(huán)胞苷等。,30,門冬酰胺酶（抗腫瘤藥） Ch.P（2005）二部 本品系自埃希大腸桿菌（E.coli ASI.357） 或歐文菌（Er-winia casotovora）中提取制備的 具有酰氨基水解作用的酶。,肝素鈉（抗凝血藥） Ch.P（2005）二部 本品系自豬或牛的腸黏膜中提取的硫酸氨 基葡聚糖的鈉鹽，屬黏多糖類物質(zhì)。,31,門冬酰胺（氨基酸類藥） Ch.P（2005） 本品為門冬酰胺一水合物。按干燥 品計算，含C4H7NO4不得少于98.5%。,32,生物合成藥物是由微生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)共同完成的半合成藥物，如抗生素,（二）生物合成藥物（biosynthetic drugs）,33,（三）生物制品（biological products） 是以微生物、細胞、動物或人源組織 和體液等為原料，運用傳統(tǒng)技術(shù)或現(xiàn)代生 物技術(shù)制成，用于人類疾病預(yù)防、治 療和診斷的藥品。,收載在中國藥典（2010年版）第三部,34,生物制品主要有疫苗、免疫血清、血液制劑、免疫調(diào)節(jié)劑（胸腺肽、免疫核糖核酸）和診斷試劑。,35,三、生物制品的種類和特點,（一）種類 1. 疫苗類 細菌類疫苗 （狂犬疫苗、卡介苗） 病毒類疫苗 （麻疹減毒活疫苗） 聯(lián)合疫苗 雙價疫苗及多價疫苗,36,2. 抗毒素及抗血清類藥物 3. 血液制品 由健康人的血液或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或由重組DNA技術(shù)制成的血漿蛋白組分，以及血液細胞有形成分統(tǒng)稱為血液制品，主要用于臨床治療和被動免疫預(yù)防，如人免疫球蛋白,37,4. 重組DNA制品 采用遺傳修飾，將所需制品的編碼DNA通過一種質(zhì)?；虿《据d體，引入適宜的微生物或細胞系，DNA通過表達和翻譯后成為蛋白質(zhì)，再經(jīng)提取和純化而回收所需制品制得。包括： 細胞因子類（重組人干擾素） 生長因子類（重組人表皮生長因子） 激素類（重組人胰島素） 酶類（重組鏈激酶） 疫苗（重組乙型肝炎疫苗） 單克隆抗體,38,38,重組DNA技術(shù),39,39,國外重組DNA制品,中文名稱 英文名或縮寫 適應(yīng)癥 胰島素 Humulin Novolin Humalog 糖尿病 腫瘤壞死因子 TNF 各種腫瘤 集落刺激因子 Neupogen 人生長激素 Protropin Humatrope NutropinAQ 矮小病 人干擾素 rhuIFN2b rhuIFN2a rhuIFNB 抗癌 rhuIFNrlb HCV, 抗癌 HBV,HVC等 抗癌，多發(fā)硬化癥腎癌，慢性肉芽腫 白細胞介素 rhuIL 化療，抗癌 組織溶纖原激活劑 RhuTpA 腦栓塞，心梗,40,40,我國重組DNA制品,中文名稱 英文名或縮寫 適應(yīng)癥 重組人干擾素a1b rhuIFNaIb 治療病毒性角膜炎 上皮生長因子 (EGF) 燒傷或創(chuàng)傷治療外用藥物 粒細胞集落刺激因子 (GCSF) 癌癥 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF) 癌癥治療引起的白細胞減少癥 紅細胞生成素 (EPO) 治療慢性腎功能衰竭引起的貧血 溶栓藥物鏈激酶 (SK) 治療慢性腎功能衰竭引起的貧血 重組人胰島素 Humulin Novolin Humalog 糖尿病 白細胞介素-2 rhuIL-2 類風(fēng)濕,41,5. 診斷制品 體外診斷制品 體內(nèi)診斷制品 6. 其他制品（如胃蛋白酶）,42,*（二）生化藥物的特點 1. 分子量大、不是定值 2. 結(jié)構(gòu)確認難 ，需采用生化法確證 3. 需檢查生物活性 4. 要求檢查安全性 5. 需做效價測定,43,1. 分子量大、不是定值,肝素 1200015000（未分級） 低分子肝素 8000 （低分子量）,重組人胰島素 5807.89,腺苷鈷胺 1579.60,右旋糖苷70 64000 76000,不定值,測定困難,抗凝血,抗血栓,44,2. 結(jié)構(gòu)確認難 ，需采用生化法確證,理化方法 生化方法 氨基酸序列分析 肽圖,45,例 重組人粒細胞刺激因子注射液 Ch.P（2005） 3.1 原液檢定 3.1.12 肽圖（至少每半年測定1次） 依法測定（附錄 E），應(yīng)與對照品圖形一致。 3.1.13 N-末端氨基酸序列（至少每年測定1次） 用氨基酸序列分析儀測定，其N-末端序列應(yīng)為： Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu。,46,3. 需檢查生物活性,例 細胞色素C溶液 Ch.P（2005） 【檢查】活力 照細胞色素C活力測定 法（附錄 B）測定，不得低于95.0%。,例 尿激酶 Ch.P（2005） 【檢查】凝血質(zhì)樣活性物質(zhì) 凝血質(zhì)樣活性為零值時的供試品酶活力，按每1ml中供試品的單位表示，每1ml應(yīng)大于150單位。,47,4. 要求檢查安全性,例 重組乙型肝炎疫苗（CHO細胞） Ch.P（2005） 制造 細胞外源因子檢查：細菌和真菌、支原體、細胞病毒外源因子檢查均應(yīng)為陰性。 檢定 原液檢定 牛血清白蛋白殘留量，CHO細胞DNA殘留量，CHO細胞蛋白殘留量，無菌檢查，支原體檢查 半成品檢定 無菌檢查，細菌內(nèi)毒素檢查 成品檢定 無菌檢查，異常毒性檢查，細菌內(nèi)毒素檢查,48,5. 需做效價測定,例 門冬酰胺酶 Ch.P（2005） 按干燥品計算，每1mg蛋白含門冬酰胺酶效 價不得低于250單位。,例 肝素鈉 Ch.P（2005） 【效價測定】照肝素生物測定法（附錄 D）測定，應(yīng)符合規(guī)定；測得的結(jié)果應(yīng)為標示量的91%110%。,49,四、生物制品的全程、全面質(zhì)量控制 生物制品多數(shù)為生物活性分子，對人體而言往往是異源物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)都很不穩(wěn)定，又易受到微生物污染，故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等都有嚴格要求。為了生產(chǎn)出藥理活性高、針對性強、毒性低、副作用小、療效可靠及營養(yǎng)價值高的生物制品，必須對其原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品進行全程質(zhì)量控制。,50,* 一、鑒別方法： 理化鑒別法：化學(xué)鑒別法 紫外分光光度法 HPLC法 生化鑒別法：酶法 電泳法 等電聚焦法 生物鑒別法：家兔驚厥試驗,51,（一）理化鑒別法 1.化學(xué)鑒別法： 例：溶菌酶 - CONH- +Cu2+ 絡(luò)合顯色,52,胃蛋白酶 Ch.P（2005） 【鑒別】取本品的水溶液，加鞣酸、沒食 子酸或多數(shù)重金屬鹽的溶液，即生成沉淀,谷氨酸鈉 Ch.P（2005） 【鑒別】（1）取本品約5mg，加水1ml使 溶解，加茚三酮試液數(shù)滴，加熱，溶液顯 藍色至紫藍色。,53,2. 紫外分光光度法,腺苷鈷胺 Ch.P（2005） （1）氯化鉀溶液中：max在264nm、285nm、305nm及460nm （2）磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中， max在261nm、525nm,54,3. 高效液相色譜法,重組人胰島素 Ch.P（2005） 【鑒別】 在效價測定項下記錄的色譜 圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與 對照品溶液主峰的保留時間一致。,55,1. 酶法 高效、專一的催化某些生化反應(yīng)。 如尿激酶的鑒別。,（二）生化鑒別法,56,尿激酶 本品系從新鮮人尿中提取的一種能激活纖維蛋白溶酶原的酶。它是由高分子量尿激酶（Mw 54 000）和低分子量尿激酶（Mw33 000）組成的混合物，高分子量尿激酶含量不得少于90，每1mg 蛋白中尿激酶活力不得少于12萬單位。 本品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)60加熱10小時，以使病毒滅活。,57,【鑒別】 取效價測定項下的供試品溶液，用巴比妥氯化鈉緩沖液（pH 7.8）稀釋成每1ml 中含20單位的溶液，吸取1ml ，加牛纖維蛋白原溶液0.3ml ，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml ，牛凝血酶溶液0.2ml ，迅速搖勻，立即置370.5恒溫水浴中保溫，記時，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在3045秒內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15分鐘內(nèi)重新溶解。以0.9氯化鈉溶液作空白，同法操作，凝塊在2 小時內(nèi)不溶（試劑的配制同效價測定）。,58,牛纖維蛋白酶,+,溶解,59,2. 電泳法,例 肝素鈉 Ch.P（2005） 【鑒別】（1）取本品與肝素標準品，分別加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，照電泳法（附錄F第三法）試驗，供試品和標準品所顯斑點的遷移距離之比應(yīng)為0.91.1。,60,61,三、生物鑒別法,血清學(xué)法 體外抗原抗體試驗 2. 生物學(xué)法 利用生物體對藥物的反應(yīng)來鑒別藥物 如 ：利用小鼠的驚厥反應(yīng)來鑒別胰島素,62,利用胰島素的降糖作用。 給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50% GS，驚厥停止。,63,第五節(jié) 藥品的安全性檢查 P258,一、特殊雜質(zhì)檢查,1. 宿主細胞（菌）蛋白殘留量的檢查,2. 外源性DNA殘留量的檢查,3. 產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的檢查,4. 殘余抗生素的檢查,64,二、安全性檢查,1. 熱原檢查,家兔法: 觀察體溫升高情況,2. 細菌內(nèi)毒素檢查 鱟試劑 方法 : 凝膠法 光度測定法,65,鱟試劑法 (簡單、快捷、靈敏、準確） 大多數(shù)重組產(chǎn)品具有很高的生物活性，特別是細胞因子類產(chǎn)品本身就有很強的致熱原作用，因此采用細菌內(nèi)毒素檢查代替熱原檢查。,66,3. 異常毒性檢查與特異性毒性檢查,使動物急性中毒死亡的物質(zhì)的限量檢查。 以動物死亡與否為終點。 試驗動物：小鼠或豚鼠 檢 查：急性毒性物質(zhì),67,觀察小鼠給藥后48h是否死亡。 靜注：Iv 靜滴：iv.gtt 皮下注射：i H 口服：p.o 肌注: im 腹腔注射: i.p 皮內(nèi)注射: I.D 灌胃注射: ig,68,4. 過敏反應(yīng)檢查,檢查藥物中的 ：異性蛋白。,實驗動物：豚鼠,69,過敏反應(yīng):(超敏/變態(tài)反應(yīng)) 型(速發(fā)型):青霉素過敏性休克、過敏性哮喘 花粉,真菌,塵螨,動物皮毛 型（細胞毒型）：血細胞減少癥，新生兒溶血, ABO 血型不合 （免疫復(fù)合物型）：血清病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎, 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE） 型（遲發(fā)型）： 接觸性皮炎、移植排斥, 傳染性變態(tài)反應(yīng),70,5. 升壓物質(zhì)：大 鼠 血壓上升 降壓物質(zhì)：麻醉貓 血壓下降 檢查：導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)、組胺、 類組胺 血 壓：單位面積血液對管壁的側(cè)壓力， 通常指的是動脈血壓. （arterial blood pressure ),71,1 mmHg=0.133 kpa SBP (收縮壓): 100-120mmHg DBP(舒張壓): 60-80mmHg 脈 壓: 30-40mmHg 心率(Heart rate) : 60-100次/min 心率平均次數(shù) : 75次/min,72,6. 無菌檢查法,檢查藥物中是否染有活菌。 許多生化藥物不能高溫滅菌，需在無菌條件下制備。,73,生物制品的含量測定方法： 1.理化分析法： 化學(xué)分析法：重量測定法、滴定分析法 電化學(xué)分析法： 光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法 色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、 HPIEC 、 HPGFC、灌注色譜法、HPCE法 2.酶法：酶活力測定法、酶分析法 3.電泳法 4.生物檢定法,返 回,74,結(jié)果表示方法： 百分含量適用于成分已知、結(jié) 構(gòu)明確的生物制品 生物效價或酶活力單位 適用于蛋白質(zhì)、酶類,75,一、理化分析法 （一） 滴定法,例 甘氨酸 Ch.P（2005） 【含量測定】 取本品約70mg，精密稱定，加無水甲酸1.5ml使溶解，加冰醋酸25ml，照電位滴定法（附錄 A），用高氯酸滴定液（0.1mol /L）滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于7.507mg的C2H5NO2。,76,（二） 光譜分析法 1. 紫外可見分光光度法 （1）比色法 （2）紫外分光光度法 2. 熒光分光光度法,77,例 細胞色素C溶液 Ch.P（2005） 【含量測定】 精密量取含鐵量項下的供試品溶液1ml，置50ml量瓶中，用鑒別（2）項下的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，加連二亞硫酸鈉約15mg，搖勻，照紫外-可見分光光度法（附錄 A），在約550nm的波長處，以間隔0.5nm找出最大吸收波長，測定吸光度，按細胞色素C吸收系數(shù)（ ）為23.0計算，即得。,78,例 五肽胃泌素 Ch.P（2005） 【含量測定】取本品適量，精密稱定，加0.01mol/L氨溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中約含50g的溶液，照分光光度法（附錄 A），在280nm的波長處測定吸收度，按C37H49N7O9S的吸收系數(shù)（ ）為70計算，即得。,79,（三） 高效液相色譜法,1. 反相高效液相色譜法,2. 離子對色譜法,3. 分子排阻色譜法,80,輔酶Q10 Ch.P（2005） 固定相 十八烷基硅烷鍵合硅膠 流動相 甲醇-無水乙醇（1：1） 檢測波長 275nm,環(huán)孢素 Ch.P（2005） 固定相 十八烷基硅烷鍵合硅膠 流動相 乙腈-水-四丁基甲醚-磷酸 （430：520：50：1） 檢測波長 210nm,81,二、生化分析法,（一）電泳法 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。