抗體技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化.ppt

抗體技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化,細(xì)胞表 面抗原,血型抗原,組織相容性 抗原,白細(xì)胞分化抗原,CD2 CD3 CD25 CD10 CD20 CD38 CD45 CD71 CD41 CD42 CD8,.,腫瘤相關(guān) 抗原,胃癌,肺癌,肝癌,鼻咽癌,大腸癌,宮頸癌,乳腺癌,結(jié)腸癌,卵巢癌,胰腺癌,喉癌,腦膠質(zhì)瘤,骨肉瘤,病毒,HFRSV,新城疫,甲肝,輪狀,登革,乙肝,RSV,乙腦,流感,馬雅羅 Mayaro,基孔貢亞 Chikungunya,Ross River,羅斯河,蓋塔 Getah,柯薩奇,狂犬,新培斯 Sindbis,細(xì)菌,大腸桿菌,沙門氏菌,痢疾桿菌,軍團(tuán)桿菌,結(jié)核桿菌,綠膿桿菌,麻風(fēng)桿菌,霍亂弧菌,寄生蟲,血吸蟲,瘧原蟲,弓形蟲,旋毛蟲,絲蟲,毛滴蟲,絳蟲,利什曼原蟲,可溶性 抗原,酶,血漿 蛋白,毒素,細(xì)胞 因子,補(bǔ)體,激素,小分子 化合物,抗體技術(shù)的研究和抗體的研發(fā)，是生物技術(shù)發(fā)展的永恒主題 抗體廣泛用于臨床疾病的診斷和研究 目前在美國單克隆抗體類藥物已占FDA所批生物藥的3/4,第一章 抗體類型和抗體技術(shù)發(fā)展,第一代 多克隆抗體 第二代 單克隆抗體 第三代 基因工程抗體 第四代 全人抗體 ？,鼠源單抗臨床應(yīng)用的障礙, 血清半衰期短，20h 抗原抗體結(jié)合力、親和力不夠 募集效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生副作用 HAMA反應(yīng)：810天出現(xiàn)，2030天高峰，anti-id封閉與抗原結(jié)合位點(diǎn)，抗鼠抗體加速單抗清除 過敏性休克,影響單抗與靶細(xì)胞或抗原結(jié)合,引起變態(tài)反應(yīng)和器官損害,HAMA反應(yīng)示意圖,第一代 多克隆抗體 第二代 單克隆抗體 第三代 基因工程抗體 第四代 全人抗體 ？,小鼠抗體,嵌合抗體,重構(gòu)抗體,人源抗體,鼠 100% 33% 10% 0 人 0 67% 90% 100%,第一代 多克隆抗體 第二代 單克隆抗體 第三代 基因工程抗體 第四代 全人抗體 ？,小鼠抗體,嵌合抗體,重構(gòu)抗體,人源抗體,鼠 100% 33% 10% 0 人 0 67% 90% 100%, 人鼠嵌合抗體 改型抗體（又稱人源化抗體） 小分子抗體 雙特異抗體 抗體融合蛋白,基因工程抗體的類型,1、嵌合抗體 將人Ig C區(qū)與鼠Ig V區(qū)相連接，從而在同一抗體分子中含有不同屬來源的抗體。,構(gòu)建嵌合抗體的基本原理，從雜交瘤細(xì)胞基因組中分離和鑒別出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因相連接，插入適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成人鼠嵌合的重鏈和輕鏈基因，然后共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合抗體。,表1 FDA批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物,2、改型抗體 應(yīng)用CDR移植技術(shù)，即將鼠單抗V區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）序列取代人源抗體相應(yīng)CDR序列，重構(gòu)成既具有鼠源性單抗特異性，又保持人抗體親和力的CDR移植抗體（CDR-grafted Ab），也稱為改型抗體或人源化抗體。,表1 FDA批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物,3、小分子抗體 利用細(xì)菌表達(dá)決定抗體特異性的結(jié)構(gòu)域，所獲抗體片段大小僅為IgG分子的1/3-1/12，因此稱之為小分子抗體。,小分子抗體包括： Fab 1/3 Fv 1/6 ScFv 1/6 單域抗體 1/12 MRU,Fab片段 Fab片段由重鏈VH加CH1及完整的輕鏈構(gòu)成，在細(xì)菌的啟動子控制下，在大腸桿菌中表達(dá)而合成Fab，大小為完整抗體的1/3，其結(jié)構(gòu)與木瓜蛋白酶消化完整抗體后所產(chǎn)生的Fab片段一致。用DNA重組技術(shù)制備的嵌合Fab片段，其V區(qū)為鼠源性，而CH1、C為人源性的。,FV片段 FV片段由VH和VL組成，是抗體的抗原結(jié)合部位，分子量只有完整分子的1/6。采用共價(jià)結(jié)合的FV片段，在不改變其分子大小的情況下，可避免VH或VL的解離。,單域抗體和最小識別單位 單域抗體是指VH或VL，其分子大小僅為完整抗體的1/12。由單個CDR構(gòu)成的小分子抗體稱為最小識別單位（MRU）。,單鏈抗體 單鏈抗體分子是由一條單一肽鏈按VH-Linker-VL 或VL-Linker-VH 的順序組成。分子大小是完整抗體分子的1/6，ScFv是抗體與抗原結(jié)合的最小單位。,ScFv具有以下特點(diǎn)： 具有與原親本抗體相同的特異性和親和力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整抗體不易到達(dá)靶細(xì)胞、清除慢和易引起超敏反應(yīng)及組織損傷等缺點(diǎn)； 制備流程較其他基因工程抗體簡單，可由大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生；, 無Fc段，所以減少了與非靶細(xì)胞上Fc受體結(jié)合，使其更特異性集中于靶細(xì)胞部位，有利于作為載體用于藥物的導(dǎo)向治療； 易進(jìn)行分子改造，ScFv基因片段還可以與適當(dāng)?shù)拿富蚧蚨舅氐鞍谆蛑亟M，轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)，可產(chǎn)生出酶聯(lián)抗體或具有與抗原結(jié)合特異性和細(xì)胞毒性的重組免疫毒素。,4. 雙特異抗體(bispecific antibody,BsAb) 一個抗體分子中的兩個抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原決定簇。,制備： 化學(xué)偶聯(lián)技術(shù) 基因工程技術(shù) 二次雜交瘤技術(shù),在導(dǎo)向治療中的應(yīng)用 藥物導(dǎo)向 腫瘤細(xì)胞抗原 BsAb 效應(yīng)物（細(xì)胞毒素等） 細(xì)胞導(dǎo)向 腫瘤細(xì)胞抗原 BsAb 效應(yīng)細(xì)胞（CTL、LAK等）,雙特異性抗體,抗人肝癌單抗 /抗人 CD3單抗 抗Her2/neu單抗/抗人CD16單抗 抗人CD20單抗/抗人CD3單抗 抗人卵巢癌單抗/抗人CD3單抗,5. 抗體融合蛋白和免疫毒素 將編碼抗原結(jié)合部位的基因片段（Fab或Fv段）與毒素或酶的基因融合在一起，可將特定的生物活性物質(zhì)導(dǎo)向特定部位。,抗體融合蛋白,抗人卵巢癌單抗-IL-12,血吸蟲病抗獨(dú)特型抗體-IL-12,表1 FDA批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物,重組免疫毒素,借助DNA重組技術(shù)，將編碼抗體和毒素的基因連接在一起，產(chǎn)生的免疫毒素為重組免疫毒素。 白喉毒素 相思豆毒素 假單胞菌外毒素 優(yōu)點(diǎn)：高效、非特異性毒性較低、體內(nèi)穩(wěn)定性較好、易穿透腫瘤、安全,全人抗體的研究,鼠-人雜交瘤 人-人雜交瘤 轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠 抗體庫技術(shù) 非雜交瘤技術(shù)制備單抗,通過基因轉(zhuǎn)染方法改良鼠骨髓瘤細(xì)胞，篩選穩(wěn)定的鼠-人嵌合細(xì)胞，使融合的雜交瘤細(xì)胞遺傳性穩(wěn)定，不易丟失染色體，可長期、穩(wěn)定地分泌全人單克隆抗體。,鼠-人雜交瘤技術(shù),鼠-人雜交瘤技術(shù),問題： 鼠源成分殘留 穩(wěn)定性差 染色體丟失,人-人雜交瘤技術(shù),問題： 能穩(wěn)定分泌抗體的親本細(xì)胞很難獲得 穩(wěn)定性差 染色體易丟失,人-人雜交瘤技術(shù) 英國劍橋大學(xué)Karpas A(2001)報(bào)道建立了人-人雜交瘤技術(shù)，獲得Karpas 707H人骨髓瘤細(xì)胞株，可制備全人抗體。,轉(zhuǎn)入人的Ig基因組,免疫動物,全人抗體,基因敲除小鼠,轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠,抗體庫技術(shù),基礎(chǔ)： PCR技術(shù)的建立 抗體分子在大腸桿菌的功能性表達(dá) 噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展,抗體庫的種類： 初期的抗體庫 噬菌體抗體庫 大容量抗體庫,人淋巴細(xì)胞 抗原篩選產(chǎn)生特異克隆 RT-PCR 輕鏈重鏈基因 轉(zhuǎn)印至NC DNA重組 組合抗體庫 E.coli隨機(jī)表達(dá),1.初期抗體庫,噬菌體抗體（phage antibody）是將克隆的人Ab V區(qū)基因與一種絲狀噬菌體DNA上的基因-或基因精確連接，轉(zhuǎn)染細(xì)菌后在其膜表面表達(dá)Fab段（或單鏈抗體）-噬菌體外殼蛋白 （基因-或基因產(chǎn)物） 的融合蛋白。,2. 噬菌體抗體庫,這種噬菌體在一定意義上講相當(dāng)于一個人B細(xì)胞克隆，將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來與噬菌體DNA相連，導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)使之表達(dá)，可制備人全套抗體，稱為噬菌體抗體庫。,問題： 1、從未經(jīng)免疫動物的抗體庫獲得的抗體其親和力不高,抗體體內(nèi)生成的理論,抗原刺激前，機(jī)體具有抗體初級庫 抗原刺激后，抗體生成的細(xì)胞群體被選擇，并發(fā)生克隆性增殖。 在抗原的反復(fù)刺激下，抗體的V區(qū)發(fā)生高頻率突變，產(chǎn)生高親和力抗體的細(xì)胞被選擇，抗體進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換，最終抗體成熟。,抗體親和力改造,鏈替換(Chain Shuffling),計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)下的定點(diǎn)突變,高親和力克隆的選擇,2、抗體庫的庫容不足以涵蓋某種動物的抗體多樣性,3.大容量抗體庫 ? 天然抗體庫 半合成抗體庫 全合成抗體庫,抗體庫的優(yōu)點(diǎn)： 1.多數(shù)外源抗原對人體有害，不能隨意對人體進(jìn)行免疫。噬菌體抗體無須免疫，可直接從非免疫動物抗體庫中篩選出特異性抗體，并能篩選針對該物種自身抗原的抗體； 2.輕、重鏈隨機(jī)組合的多樣性多于供體B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多樣性，構(gòu)建一種噬菌體抗體文庫，可供產(chǎn)生針對多種特異性抗原的人源抗體，從而克服了難以建立人-人雜交瘤的困難； 3.細(xì)菌增殖快，培養(yǎng)成本低廉，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，為臨床大量應(yīng)用抗體提供了可能。,總抗體庫（master library） 人們將有望在原核系統(tǒng)模擬體內(nèi)免疫過程，并任意克隆針對任何抗原的抗體。,非雜交瘤技術(shù)制備單抗,人B淋巴細(xì)胞,轉(zhuǎn)染EB病毒及生長因子,B細(xì)胞永生化,Humira是Abbott/CAT公司開發(fā)的一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗體藥物， 2002年上市，是完全人源化單抗，這是抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事，預(yù)示著抗體藥物一個迅猛發(fā)展的新時代的來臨。2003年有4億美元的銷售額，2005年達(dá)到11億美元。 Avastin 2003年上市的治療結(jié)腸癌的抗體藥物，也是第一個從抗體庫中篩選出的 Fab 段抗體藥物。 Avastin的上市使公司的股價(jià)上升了90億美元。,第二部分 抗體的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化研究,單克隆抗體的應(yīng)用,基礎(chǔ)研究,預(yù) 防,治 療,診 斷, 抗體是生化、免疫學(xué)、生物芯片等多種診斷試劑中的核心生物原料，在各種疾病的診斷領(lǐng)域具有廣泛的用途。我國目前用于臨床診斷方面的抗體80% 依靠進(jìn)口。國外已批準(zhǔn)的診斷性單抗有600多種，我國僅60余種。,單克隆抗體用于診斷,單克隆抗體用于疾病診斷,傳染病診斷,腫瘤診斷,免疫性疾病診斷,內(nèi)分泌疾病診斷,血液病診斷, 心腦血管疾病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、傳染病、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌性疾病等日益威脅著人類的健康。針對這些重要疾病，要不斷研究和開發(fā)新的治療藥物。雖然化學(xué)藥物一直占據(jù)主流地位，但抗體藥物導(dǎo)向性強(qiáng)、 副作用小、半衰期長等優(yōu)勢吸引了 越來越多的投資。,單克隆抗體用于治療,單克隆抗體用于疾病治療,腫瘤,自身免疫性疾病,器官移植,心血管疾病,感染性疾病,表1 FDA批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物,美國已上市18種單克隆抗體藥物 2002年銷售額 29億美元 2003年 40億美元 2005年 90億美元 2008年 150億美元 2010年 300億美元,2002年完全人源化單抗humira獲得批準(zhǔn)上市，這是單克隆抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事。Humira是Abbott/CAT公司開發(fā)的一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的單克隆抗體藥物，2003年有4億美元的銷售額，2005年達(dá)到11億美元。,Avastin 是美國FDA批準(zhǔn)的治療結(jié)腸癌的抗體藥物，也是第一個從抗體庫中篩選出的 Fab 段抗體藥物。 Avastin的上市使公司的股價(jià)上升了90億美元。,赫賽?。ㄓ⑽拿?Trastuzumab ），抗人表皮生長因子受體-2(HER-2)的人源化單克隆抗體，用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌。 有25%-30%原發(fā)性乳腺癌患者HER2過度表達(dá)。,抗體藥物臨床應(yīng)用廣泛，市場需求巨大。抗體藥物已占FDA批準(zhǔn)生物技術(shù)藥的3/4，所有新研發(fā)藥物的1/3。,我國治療用抗體的研制現(xiàn)狀,中國僅有3個治療性單抗藥物獲準(zhǔn)上市 抗乙腦中和抗體（鼠源） 肺癌治療性抗體（嵌合抗體） 肝癌治療性抗體（鼠源片斷）,血吸蟲病治療性抗體 狂犬病治療性抗體 禽流感治療性抗體 鼻咽癌治療性抗體 肝癌治療性抗體, 抗獨(dú)特型抗體疫苗（anti-id Ab vaccine）,單克隆抗體用于預(yù)防, 動 物 保護(hù)力（%） 昆明種 50.46 C57BL/6 42.05 BALB/c 39.53 山羊 42.78 BALB/c（同濟(jì)） 40.50 ,血吸蟲病抗獨(dú)特型抗體疫苗動物保護(hù)性試驗(yàn),單克隆抗體用于基礎(chǔ)研究,細(xì)胞種類及亞型的分析,細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究,細(xì)胞膜受體及其功能研究,蛋白質(zhì)分離、純化,基因分離及功能研究,單克隆抗體用于食品與環(huán)境監(jiān)測,食品,水,土壤,抗體的大