p16ink4a基因的分子生物學(xué)研究進展(1).doc

p16ink4a基因的分子生物學(xué)研究進展張毅彬關(guān)鍵詞：p16ink4a基因；CDK4 / 6；細胞周期；腫瘤發(fā)生【摘要】 抑癌基因p16ink4a在特異地抑制 CDK4及CDK6在控制細胞生長、抑制腫瘤發(fā)生、 促進細胞衰老等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，該基因失活后導(dǎo)致了細胞周期的調(diào)控失常,使得細胞異常增殖,導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，本文就近幾年來有關(guān)它在染色體上的定位、結(jié)構(gòu)以及在細胞增殖、癌變過程中的研究進展作一綜述。p16ink4a基因最早作為腫瘤抑制基因由美國冷泉實驗室在1994年發(fā)現(xiàn)，屬于細胞周期依賴性激酶抑制基因INK4家族的一員1，在正常細胞中具有調(diào)控細胞周期的作用，負調(diào)節(jié)細胞增殖及分裂，在人類50%腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)有缺失、突變或者表觀遺傳上的沉默2。1p16ink4a基因的結(jié)構(gòu)和定位人類p16ink4a基因位于第9號染色體斷臂的2區(qū)1帶，即9P21的CDKN2A位點，CDKN2A基因位點包含INK4A和ARF兩個重疊基因，因閱讀框不同分別編碼蛋白p16ink4a和p14ARF，p16ink4a基因全長約8.5kb，由 3個外顯子exon1（126bp）,exon2(307bp),exon3(11bp)加上2個內(nèi)含子構(gòu)成，其編碼的p16ink4a蛋白由148個氨基酸組成，定位于細胞核內(nèi)。2p16ink4a與細胞周期調(diào)控在正常增殖的組織細胞中，p16ink4a蛋白的表達處于一個較低的水平，并通過p16ink4a-CDK4/6-Rb途徑調(diào)控細胞周期。Rb基因即成視網(wǎng)膜瘤基因，是一種重要的抗癌基因，細胞中的Rb基因在激活狀態(tài)下可編碼Rb蛋白，并通過Rb蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，從而最終調(diào)節(jié)細胞周期。處于G0/G1期細胞中的Rb蛋白處于去磷酸化狀態(tài)，并與轉(zhuǎn)錄因子E2F組成復(fù)合體，從而阻斷E2F與順式作用元件的結(jié)合,進而阻遏基因的表達。如Rb蛋白與E2F結(jié)合后,可阻斷編碼DNA聚合酶、胸苷激酶、二氫葉酸還原酶等的相關(guān)基因的表達,使這些酶類不能合成,DNA的生物合成亦受阻，因此抑制了細胞的生長。當在有絲分裂信號的激活作用下，G1期細胞中的CDK4/6與cyclin D組成復(fù)合物，介導(dǎo)Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白失去活性，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，轉(zhuǎn)錄因子E2F與DNA啟動子近端元件結(jié)合后,促進轉(zhuǎn)錄預(yù)始復(fù)合物(PIC)的組裝,使結(jié)構(gòu)基因穩(wěn)定表達，細胞通過G1/S期檢查點，從而促進細胞生長。p16ink4a的調(diào)控作用主要表現(xiàn)在p16ink4a蛋白直接與CDK4/6分子結(jié)合，從而競爭性抑制CDK4/6與cyclin D的結(jié)合，保持Rb蛋白的去磷酸化狀態(tài)，進而使細胞停滯于G0/G1期無法進入S期啟動染色體的復(fù)制以完成增殖活動3, 4，除此之外，p16ink4a還能擾亂CDK4/6與其他CDKI的結(jié)合，導(dǎo)致這些非p16的CDKI的釋放，進一步抑制細胞周期5。當細胞出于一些較明顯的異常狀態(tài)時，如DNA損傷、原癌基因過度表達及細胞生理性老化時，就能啟動p16ink4a的表達6。3p16ink4a基因與腫瘤在人類腫瘤中，在接近50%的腫瘤類型中發(fā)現(xiàn)p16ink4a基因有不同程度的失活7，p16在不同腫瘤中失活的評估幾率如下：乳腺癌：20%；非小細胞肺癌：65%；結(jié)直腸癌：30%；膀胱癌：60%；頭頸部鱗狀細胞癌：50-70%；黑色素瘤：60%；白血?。?0%；食道癌：70%；多發(fā)性骨髓瘤：60%；胰腺癌：85%8。在這些腫瘤中，許多p16失活的機制已經(jīng)被闡明，包括基因純合性缺失、雜合性缺失、點突變以及表觀遺傳上的啟動子甲基化9, 10，p16的失活導(dǎo)致細胞過度增殖，并可使G1期未充分發(fā)育的細胞提前進入S期，引起增殖性疾病的發(fā)生，并且每一種腫瘤具有自己特有的失活類型，比如48%的胰腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)p16純合性缺失，而在胃癌中，p16啟動子甲基化是主要原因，比例高達34%，p16基因缺失和突變只占2%11，Chang等人發(fā)現(xiàn)膀胱癌中60%的p16基因啟動子存在高度甲基化現(xiàn)象12，Hernandez等分析了4 2例慢性粒細胞白血病(CML)病人p16ink4a 基因外顯子2的缺失和啟動子甲基化情況，發(fā)現(xiàn)29%的淋巴細胞白血病急性變中存在p16ink4a基因的純合性缺失，而慢性期和髓樣細胞白血病中均未發(fā)現(xiàn)缺失，也未發(fā)現(xiàn)p16ink4a基因啟動子的異常高甲基化，p16ink4a基因的缺失與臨床特征無明顯相關(guān)，提示p16ink4a基因的缺失與否并不能影響病人的預(yù)后13。Kwong等人分析了亞洲人種喉鱗狀上皮細胞癌細胞系的p16ink4a的失活機制和功能，發(fā)現(xiàn)了啟動子甲基化、外顯子2和3的純合性缺失、外顯子1的框移突變導(dǎo)致了其轉(zhuǎn)錄失活和蛋白突變體的產(chǎn)生14。Grafstrom等運用實時定量PCR方法研究了86個病人p16ink4a基因的缺失情況及其與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)純合性缺失是皮膚惡性黑色素瘤最重要的遺傳學(xué)改變，且與不良預(yù)后密切相關(guān)15。另外，在小鼠腫瘤模型中, p16ink4a和 p14ARF 協(xié)同作用的缺失已經(jīng)在一些腫瘤發(fā)生模型,包括在對特定致癌物質(zhì)、黑素瘤、惡性膠質(zhì)瘤和胰腺癌的反應(yīng)中確立。此外，盡管大量的研究表明p16ink4a作為一個腫瘤抑制基因在腫瘤中的表達是下調(diào)的，但是也有部分報道認為p16ink4a在腫瘤中有過表達的情況，例如在子宮頸鱗癌和結(jié)腸癌的研究中，有報道p16ink4a在腫瘤細胞中過表達的現(xiàn)象發(fā)生16，并且p16ink4a高表達與病毒感染有關(guān)，如在人類乳頭瘤病毒HPV相關(guān)口腔鱗狀細胞癌中，高風(fēng)險類型的HPV感染口腔細胞后，HPV所表達的E7蛋白能與細胞中Rb蛋白結(jié)合，阻止Rb與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，因此E2F具有活性，引起細胞分裂，又因為Rb-E2F復(fù)合物能負反饋抑制p16的表達，而E7蛋白與Rb蛋白結(jié)合后，Rb-E2F復(fù)合物不足，所以導(dǎo)致了p16ink4a高表達17, 18。而在非HPV感染的頭頸部鱗癌中，p16ink4a低表達，癌細胞分裂活躍，而HPV感染的頭頸部鱗癌中, p16ink4a因E7蛋白的緣故而高表達19，但即使p16ink4a在癌細胞中高表達，仍無法對抗癌細胞的異常增殖20。不過，這種p16ink4a高表達的口腔腫瘤對放射療法的敏感性更高，并且p16ink4a可作為口腔癌臨床預(yù)后的標志物，p16ink4a高表達陽性類型的預(yù)后較p16ink4a高表達陰性的更好21。另外，在腫瘤癌前病變組織中也可以監(jiān)測到p16ink4a的高表達，可以認為這種變化是為了抑制病變的繼續(xù)發(fā)展22。4p16ink4a與細胞衰老 細胞衰老也稱細胞老化,一般是指細胞在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下不可逆地脫離細胞周期并喪失增生能力后進入的一種相對穩(wěn)定狀態(tài)。細胞衰老是生物體中普遍存在的一種不可逆的生長停滯現(xiàn)象,是器官衰老的基礎(chǔ),存在于任何生命的任何時期,在不同情況下其速率與程度有所差別。己有研究證明基因是細胞衰老的關(guān)鍵效應(yīng)物，是遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)，它通過定途徑調(diào)控細胞周期，影響細胞的生物鐘細胞壽命和端粒長度，而非激活端粒酶起作用，細胞衰老的遺傳原因有很多種,其中有一個原因是突變的癌基因所產(chǎn)生的信號導(dǎo)致細胞衰老。目前發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與p16ink4a- Rb和p14ARF-p53這2條途徑有關(guān), Rb和p53是衰老信號通路網(wǎng)絡(luò)中的 2個重要的控制點23。在人類腎臟組織細胞和皮膚細胞的衰老過程中都顯示出p16ink4a的表達上升24，提示這個腫瘤抑制基因在細胞衰老中的重要作用。除此之外，有報道發(fā)現(xiàn)p16ink4a在衰老的成纖維細胞中過度表達25，在氧化應(yīng)激和DNA損傷中也有被報道有過表達現(xiàn)象的發(fā)生26, 27。Janzen等發(fā)現(xiàn)p16ink4a的表達在HSCs 、NSCs和胰腺干細胞中都顯示了其促進衰老和抗增生能力,這表明在這些干細胞中p16ink4a的表達能夠通過抑制增生和自我更新而促進衰老,是引起衰老的原因之一28, 29。Han 等研究發(fā)現(xiàn)p16ink4a蛋白能增加p21蛋白的穩(wěn)定性，p21蛋白則通過轉(zhuǎn)錄因子SP1 激活p16ink4a基因的表達，二者協(xié)同抑制細胞周期，細胞周期的停滯則是細胞衰老的前提，說明p16ink4a基因可能通過促進p21基因的表達導(dǎo)致細胞衰老30. 盡管諸多的報告顯示p16ink4a與細胞衰老有千絲萬縷的聯(lián)系，但目前p16ink4a在細胞衰老過程中的完整的具體機制尚未明了31。5p16ink4a基因表達的調(diào)控作為調(diào)控因子，已知有一些腫瘤相關(guān)因子或分子信號通路影響p16ink4a的表達。其中最好的研究就是通過激活 Ras 及其下游效應(yīng)器B-Raf的突變來誘導(dǎo) ERK/MAPK通路。已有研究證明RAS活化可能導(dǎo)致p16ink4a表達,包括ERK介導(dǎo)的 Ets1/2活化誘導(dǎo)p16ink4a的表達和Jun介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子DMP 1活化誘導(dǎo)p14ARF的表達，另外polycomb 家族 ( PcG) 基因 ( BMI - 1、Cbx 7、Mel 18) 等也抑制p16ink4a的表達。在成纖維細胞中,Ets1、Ets2轉(zhuǎn)錄因子可通過與p16ink4a啟動子中的Ets結(jié)合位點(GGCC)結(jié)合而使其激活,促進p16ink4a轉(zhuǎn)錄。在低代齡(30代)成纖維細胞中大量存在的Ets2對p16ink4a的誘導(dǎo),可被Ras-Raf-MAPK激酶信號所加強,同時可被Id1的直接作用所抑制32。E蛋白是一類含有bHLH結(jié)構(gòu)域并通過與E-box結(jié)合來激活轉(zhuǎn)錄的蛋白家族,它包括E12、E47、E2-2、HEB4個成員。p16ink4a啟動子內(nèi)含有2個E-box結(jié)構(gòu)，E蛋白以其bHLH結(jié)構(gòu)域結(jié)合這兩個E-box,上調(diào)p16ink4a的轉(zhuǎn)錄水平,誘導(dǎo)衰老表型出現(xiàn)。Id1也是E-box結(jié)合蛋白序列特異性轉(zhuǎn)錄抑制因子33。在細胞中, 具有鋅指結(jié)構(gòu)的Sp(specificityprotein)家族轉(zhuǎn)錄因子與GC盒相互作用，目前已知有Sp1Sp88種蛋白質(zhì)。p16ink4a啟動子無TATA盒,其啟動子上GC含量豐富,且含有5個Sp家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,Sp家族中轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過與這些GC盒結(jié)合來促進p16ink4a的轉(zhuǎn)錄24。LI等認為p16ink4a啟動子-426到-433區(qū)域含有一個HMG盒包含蛋白1（HBP1），其與p16ink4a啟動子的結(jié)合能上調(diào)p16ink4a的表達34。哺乳動物的AP1蛋白能以同源二聚體或異源二聚體的形式組成bZIP蛋白，包括C-JUN、junB等等，在小鼠p16ink4a啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)3個AP1樣結(jié)合位點，bZIP蛋白與AP1樣位點結(jié)合后能促進p16ink4a的表達35。Id家族可抑制Ets蛋白對p16ink4a的轉(zhuǎn)錄激活作用。在成纖維細胞中,Ets1和Ets2可通過與p16ink4a啟動子中的Ets結(jié)合位點結(jié)合,促進p16ink4a轉(zhuǎn)錄,但同時可被Id1的直接作用所抑制。因此,在該細胞中雖然大量表達Ets2,但可能由于Id1抵消了Ets2對p16ink4a的促進作用,使p16ink4a在年輕細胞中只有低水平表達;而在衰老細胞中,Ets2和Id1水平下降,Ets1水平上升,這樣仍可使p16ink4a的表達顯著增加32。甲基化對p16ink4a的轉(zhuǎn)錄有負調(diào)控作用，其中p16ink4a基因5端啟動子區(qū)及第一、二外顯子的CpG島甲基化使其不能完成轉(zhuǎn)錄是導(dǎo)致抑癌基因失活的重要原因, 如腦部腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤、肺小細胞肺癌和非霍奇金病等疾病中都有相關(guān)報道36。polycomb 家族 ( PcG) 基因通過染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，與細胞的增殖、分化和腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，從生化和功能上它可以分成兩個主要的核心蛋白復(fù)合體PRC1(Polycomb repressive complex 1)和PRC2(Polycomb repressive complex 2)，BMi1、Cbx7、Ring1b以及Phc2都屬于PcG基因，如BMi1基因的靶基因就是CDKN2A位點，在小鼠模型和細胞實驗中，都確認了BMi1能下調(diào)p16ink4a及p14ARF的表達37。6其他 在細胞的其他一些活動過程中，p16ink4a也扮有相關(guān)作用，例如細胞凋亡、細胞侵襲、血管生成等等，并且這些活動與它在腫瘤中的過表達有一定聯(lián)系。另外在紅細胞發(fā)育過程中，p16通過調(diào)節(jié)bcl-X與NF-KB通路來促進紅細胞分化和凋亡38。Harada發(fā)現(xiàn)在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，p16ink4a能下調(diào)VEGF的表達，從而抑制腫瘤的血管生成過程39。7展望 在這篇綜述中，我們簡單地闡述了p16ink4a基因的結(jié)構(gòu)、功能、相關(guān)疾病的關(guān)系以及眾多轉(zhuǎn)錄因子對其復(fù)雜的正、負調(diào)控，盡管在探索P16分子在細胞中的相關(guān)作用及表達產(chǎn)物的功能研究上已經(jīng)取得一定的成果，但我們?nèi)晕慈媪私馇宄?，尤其是p16ink4a與細胞衰老發(fā)生的機制方面還需要更多的探索與研究，拓展其在細胞和機體中以及在更多不同疾病中相關(guān)功能的認識，無疑將有助于人們更好的掌握細胞生長規(guī)律，這樣才能為新的治療方法和策略指明方向。參考文獻：1.Kamb, A., et al., A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. 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