果蠅神經(jīng)粘附分子Neuroligin4誘餌蛋白載體的構(gòu)建.doc

果蠅神經(jīng)粘附分子Neuroligin4誘餌蛋白載體的構(gòu)建 林子英任妮娜劉剛 【摘要】目的構(gòu)建果蠅神經(jīng)粘附分子Neuroligin4誘餌蛋白載體。方法根據(jù)Neuroligin4基因的特點，分別設(shè)計胞外段和胞內(nèi)段的引物序列，通過PCR、酶切等手段將目的片段接入誘餌載體中。結(jié)果 經(jīng)酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建Neuroligin4胞外端和胞內(nèi)端誘餌蛋白質(zhì)粒。結(jié)論Neuroligin4誘餌載體的成功構(gòu)建為研究Neuroligin4基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】Neuroligin4神經(jīng)粘附分子誘餌載體 【Abstract】Objective ToconstructthebaitprotienofdrosophilaneuraladhesionmoleculeNeuroligin4.Methods RespectivelyaordingtothecharacteristicsoftheNeuroligin4genes，wedesignedprimersequencesofextracellularandintracellular，andconnectedpurposefragmentwithbaitplasmidbyPCRandenzymedigestion，etc.Results Withidentificationbytheenzymedigestionandsequencingappraisalarray，theNeuroligin4extracellularandintracellularbaitplasmidsweresuessfullycontructed.ConclusionNeuroligin4baitcarriersuessfullybuildinghaspavedthewayforthefunctionresearchofNeuroligin4gene. 【Keywords】Neuroligin4，Neuraladhesionmolecule，Baitcarrier 【Authorsaddress】GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang，Guangdong，524023，China doi：10.3969/j.issn.1671-332X.xx.12.005 起初的研究發(fā)現(xiàn)，孤獨癥存在染色體異常，繼而通過連鎖分析法更加深入探討了相關(guān)基因的作用。迄今為止，已明確的伴有孤獨癥表型的單基因遺傳病有Angelman綜合癥、Tett綜合癥、脆性X綜合癥、結(jié)節(jié)性硬化癥等。對于孤獨癥神經(jīng)生物學(xué)的研究，集中在突觸可塑性上，認為樹突的發(fā)育異?？赡軐?dǎo)致孤獨癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)編碼核心的跨突觸成分Neurexin/Neuroligin/PSD-95/SAPAP/Shank的基因都是孤獨癥的易感基因。Neuroligin作為Neurexin的配體，在突觸的發(fā)育形成，功能維持起著極其重要的作用。Neuroligin家族蛋白大多數(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)表達，而且在人類、哺乳動物、小鼠、線蟲、果蠅等系統(tǒng)中都有不同的同源基因。Neuroligins是典型的單跨膜蛋白，它們包含4個不同的結(jié)構(gòu)域：位于N端的可被切除的信號肽、一個乙酰膽堿酯酶類似結(jié)構(gòu)域（但是沒有催化活性）、一個高度保守的單跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短的細胞內(nèi)序列PDZ結(jié)合基序（具有高度保守的C末端序列）。通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)，果蠅中存在著四個編碼Neuroligin分子的基因，分別命名為DNlg1，DNlg2，DNlg3和DNlg4。他們與人類Neuroligin1的同源性分別是19.3%，22.4%，25.9%，22.2%1。其中，DNlg1和DNlg2都有相應(yīng)的報道，它們對突觸形成，突觸后分化有著重要的影響2-4。近期果蠅Neuroligin4（CG34139）基因研究尚無報導(dǎo)，它如何調(diào)控其上下游蛋白以及在神經(jīng)突觸發(fā)生的機制尚有待進一步研究和闡明。本研究以Neuroligin4的胞外端和胞內(nèi)端片段作為誘餌蛋白體系，試圖利用這個體系通過酵母雙雜交技術(shù)5從果蠅cDNA文庫中篩選與Neuroligin4相互作用的蛋白，對于進一步闡明DNlg4在體內(nèi)的生理功能具有重大意義。 1材料與方法 1.1材料 果蠅Neuroligin4cDNA模板、pGBKT-7、pGBT-9、大腸桿菌DH5a由本實驗室保存。LB培養(yǎng)基，氨芐抗生素，卡那抗生素由上海生工生物公司購買。各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs等由TaKaRa公司購買。引物及克隆測序均由英濰捷基公司提供，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。 1.2儀器 PCR儀5531，高速離心機（Eppendorf公司）；凝膠成像分析儀GDS800（UVP公司）；生物培養(yǎng)箱Thermofisher144L（Thermo公司）等。 1.3方法 1.3.1PCR擴增目的片段參考Flybase登錄的Neuroligin4基因的cDNA序列分別設(shè)計N端和C端片段引物，N端上游引物序列為：5-AACGAATTCATGGGGGAAAGTCAGCTGCT-3（下劃線為EcoRI酶切位點），下游引物為5-ATCCTGCAGGCAGGGCCGTCGAATAGGCCG-3（下劃線為PstI酶切位點）；C末端上游引物為-AACGAATTCCAGCGCGACAAGACGCGGCT-3（下劃線為EcoRI酶切位點），下游引物為5-ATCGTCGACGGACGCGCATCTCGTCCATCG-3（下劃線為SalI酶切位點）。PCR反應(yīng)體系50l：高保真DNATaq酶0.5l，cDNA1l。擴增條件：58退火30s，72延伸，每個循環(huán)延伸30s，30個循環(huán)反應(yīng)。最后瓊脂糖電泳，膠回收目的條帶。 1.3.2目的片段與誘餌載體的酶切與連接將擴增產(chǎn)物與誘餌載體pGBKT-7分別用EcoRI和PstI酶切，得到的酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳后回收。得到的酶切產(chǎn)物進行連接，體系20l：DDW11.5l，10XLigaseBuffer2l，載體3l，目的片段3l，T4連接酶6l。16過夜連接。 1.3.3轉(zhuǎn)化和克隆鑒定得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)中，過夜培養(yǎng)12h后，挑取單克隆篩選重組質(zhì)粒，雙酶切進一步驗證。驗證后的質(zhì)粒送至測序。 2結(jié)果 果蠅Dneuroligin4基因位于果蠅3號染色體的右臂92D5-8，由17個外顯子，12個內(nèi)含子組成?；蛉L40665bp，其中CDS為3843bp，可以編碼1281個氨基酸，預(yù)計表達蛋白分子經(jīng)糖基化等修飾后大小約為140kD。它的蛋白包括一個長的胞外端，其中含有一個較大的類乙酰膽堿酯酶結(jié)構(gòu)域，因其決定酯酶活性的關(guān)鍵位點的絲氨酸轉(zhuǎn)變成了甘氨酸，因此，這個結(jié)構(gòu)域不具備酯酶活性。在跨膜區(qū)的胞外端是一段含有多個糖基化位點的區(qū)域，在跨膜區(qū)的胞內(nèi)端是一段特異性較高的無規(guī)卷曲區(qū)域，如圖1A。在C末端是一個保守的ELRV序列，是典型的PDZ結(jié)合基序。 鑒于DNlg4的定位和分布，可以確定DNlg4是一個神經(jīng)相關(guān)蛋白，又由于DNlg4是一個I型跨膜蛋白，因此整個蛋白不適合用于酵母雙雜交系統(tǒng)。但是因為胞外端和胞內(nèi)端的結(jié)構(gòu)和功能迥異，可以將其分為胞外端和胞內(nèi)端兩個部分分別來研究。所以我們將DNlg4蛋白分為兩部分當做誘餌蛋白去篩庫，既能清晰的確定蛋白相互作用的Domain，又能推斷DNlg4各部分功能，最終實現(xiàn)整個蛋白功能的推斷，如圖1A。 DNlg4胞外端所設(shè)計的引物位于起始密碼子到2472bp處，引入EcoRI和PstI酶切位點，首先用PCR方法從全長cDNA中擴增目的片段，并將其接入pGBKT7誘餌載體中，轉(zhuǎn)化得到克隆，經(jīng)EcoRI和PstI雙酶切鑒定，條帶約為2500bp，與目的片段大小一致，如圖1B。 DNlg4胞內(nèi)端所設(shè)計的引物位于2542bp到終止密碼子處，引入EcoRI和SalI酶切位點，首先用PCR方法從全長cDNA中擴增目的片段，并將其接入pGBT9誘餌載體中，轉(zhuǎn)化得到克隆，經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切鑒定，條帶約為1300bp，與預(yù)計大小一致，如圖1C。 3討論 xx年10月KNIGHTD等1對果蠅中Neuroligin和NRX作了相關(guān)的報道，對DNl1和DNl2的表型和功能作了相應(yīng)的比較。xx年DANIEL等1揭示果蠅Neuroligin1能夠在谷氨型NMJ中促進生長和突觸后分化的作用。他指出，DNl1的null突變表型引起NMJ中突觸Bouton數(shù)量的大幅度減少，以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量也明顯下降。當DNl1缺失的情況下，突觸后分化明顯出現(xiàn)障礙。而當Dnl1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域缺失（即DNl1-GFPcyto）的情況下，呈現(xiàn)出明顯的顯性負效應(yīng)現(xiàn)象。這是因為DNl1-GFPcyto仍然保留了胞外端部分，使得DNl1仍然能夠形成復(fù)合體，但是本身已經(jīng)失去功能。盡管胞外端能夠與NRX相互作用起到很重要的作用，但是胞內(nèi)端的作用似乎對DNl1的功能及對突觸前Bouton是必需的。這是由于胞內(nèi)端部分能夠與突觸后膜下骨架蛋白相互作用，這個結(jié)論已經(jīng)在哺乳動物中已被證實。比如NL2就能在抑制型突觸GABAergic與PSD蛋白Gephyrin和Collybistin相互作用。接著，xx年SUN等2發(fā)表了關(guān)于DNl2的報道。DNl2缺失突變體呈現(xiàn)出NMJ表型的許多結(jié)構(gòu)性缺陷，表現(xiàn)為軸突管分支的減少和突觸Bouton數(shù)量的減少，但是神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量增加，每個Bouton中AZs數(shù)量的增加但是SSR厚度變小。還表現(xiàn)出突觸后谷氨酸受體數(shù)量的減少，以及谷氨酸受體組分發(fā)生改變。Null突變體的這些表型能夠被突觸后Dnl2的表達所挽救。他還證明了DNl2確實能夠與突觸前的Nrx相互作用。當DNl2和DNRX雙突變的情況下出現(xiàn)蛹期致死或突 圖1酶切鑒定結(jié)果 A：Dneuroligin4（DNlg4）基因組結(jié)構(gòu)特點以及DNlg4的胞外端ECD和胞內(nèi)端ICD的選取片段； B：酶切檢測pGBKT7-DNlg4-ECD重組質(zhì)粒； C：酶切檢測pGBT9-DNlg4-ICD重組質(zhì)粒。 觸發(fā)育障礙等表型。這些實驗證據(jù)表明，DNl2是突觸后成熟和功能所必須的分子。目前，國內(nèi)外對Neuroligin4的基因功能做了大量的研究，但是對Neuroligin4真正功能的探索的報道相對比較貧乏。 綜上所述，本研究根據(jù)Neuroligin基因結(jié)構(gòu)的特點，分別截取胞外段和胞內(nèi)段，去掉跨膜結(jié)構(gòu)，設(shè)計引物，將這兩段序列通過PCR、酶切的方式接到誘餌載體上，測序結(jié)果顯示所得的兩個克隆與目的序列比對成功，表明我們成功獲得了Neuroligin基因的兩個誘餌蛋白質(zhì)粒，為后續(xù)研究Neuroligin基因的功能提供了良好的基礎(chǔ)。 參考文獻 1KNIGHTD，WXIE，GBOULIANNE.NeurexinsandNeuroligins：RecentInsightsfromInvertebratesJ.MolecularNeurobiology，xx，44（3）：26-440. 2SUNM，XINGG，YUANL，etal.Neuroligin2IsRequiredforSynapseDevelopmentandFunctionattheDrosophilaNeuromuscularJunctionJ.TheJournalofNeuroscience，xx，31（2）：687-699. 3BANOVICD，KHORRAMSHAHIO，KHORRAMSHAHIO，etal.DrosophilaNeuroligin1PromotesGrowthandPostsynapticDifferentiationatGlutamatergicNeuromuscularJunctionsJ.Neuron，xx，66（5）：724-738. 4IIDAJ，HIRABAYASHIS，SATOY，etal.Synapticscaffoldingmoleculeisinvolvedinthesyna