12C6+離子輻射對細胞存活增殖及模擬失重和輻射對家蠶卵發(fā)育的影響.doc

12C6+離子輻射對細胞存活增殖及模擬失重和輻射對家蠶卵發(fā)育的影響作者：續(xù)惠云羅明志孟芮張維高翔李文建商澎【摘要】目的：觀察重離子輻射后人骨肉瘤細胞MG63、人胚胎皮膚成纖維細胞ESF1和人胚胎肝正常細胞HEL1的生存和增殖情況，及重離子輻射和模擬失重環(huán)境處理后家蠶卵的孵化和發(fā)育情況，初步探討重離子輻射對細胞及復(fù)合環(huán)境對家蠶卵的一些生物學(xué)效應(yīng).方法：利用超導(dǎo)磁體模擬失重環(huán)境，利用重離子加速器產(chǎn)生12C6+離子，用不同劑量輻射細胞和家蠶卵，檢測在重離子輻射后細胞的存活和克隆形成能力及復(fù)合條件下家蠶卵的發(fā)育情況.結(jié)果：HEL1細胞在0.1Gy時存活率已經(jīng)開始降低，且隨輻射劑量的增大這種影響也增加，到1.5Gy時存活率降低50%.ESF1細胞在1.5Gy時存活率下降約20%，但輻射對骨肉瘤MG63細胞的存活率影響不大.HEL1和ESF1細胞受到0.1Gy的輻射后克隆形成能力就明顯降低90.2%和79.1%，而MG63細胞一直保持較高的克隆形成率，直到1.5Gy時迅速降低75%.家蠶的出蟻率隨輻射劑量的增大而降低，到30Gy時出蟻率降到2.22%.當(dāng)輻射劑量為010Gy時，家蠶卵在兩種不同重力條件下的孵化率沒有明顯差異.但當(dāng)輻射劑量增加到15,20和30Gy時，失重環(huán)境明顯促進了家蠶卵的孵化.另外，失重環(huán)境下家蠶卵的孵化時間比正常條件下縮短約3d左右.同時，高劑量的輻射處理會延遲家蠶幼蟲的生長.結(jié)論：重離子輻射降低了細胞的存活和增殖能力，同時影響了家蠶從受精卵到幼蟲的發(fā)育，降低了出蟻率.失重環(huán)境可以縮短家蠶卵的孵化時間.【關(guān)鍵詞】重離子輻射；失重；輻射效應(yīng)；細胞增殖；家蠶卵；發(fā)育0引言輻射和微重力在深空環(huán)境同時存在，且都是對航天員生命安全威脅很大的環(huán)境因素1，研究兩者的復(fù)合生物學(xué)效應(yīng)，可以為深空探測中航天員的健康保障提供理論支持.對此，國外已經(jīng)進行了地基水平和真實空間的一些研究，如2002年開始在國際空間站啟動的ALTEA/ALTEINO計劃，研究了復(fù)合效應(yīng)對航天員中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，并做了地基的對照實驗1-2.我國科學(xué)家對復(fù)合效應(yīng)的研究還剛剛起步，進行了一些地基實驗，主要集中在對這兩種危害的防護方面3-4.本研究利用中國科學(xué)院蘭州近代物理研究所的重離子加速器（HIRFL）作為地面模擬深空輻射的平臺，利用大梯度強磁場超導(dǎo)磁體作為模擬失重環(huán)境的地基平臺，初步探討重離子輻射對細胞及復(fù)合環(huán)境對家蠶卵的一些生物學(xué)效應(yīng).1材料和方法1.1材料大梯度強磁場超導(dǎo)磁體由西北工業(yè)大學(xué)自行設(shè)計、日本制造.人胚胎皮膚成纖維細胞ESF1和人胚胎肝正常細胞HEL1購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞庫，人骨肉瘤細胞MG63購自中國科學(xué)院上海細胞庫.家蠶品種為大造P50，蠶卵購自江蘇省鎮(zhèn)江蠶業(yè)研究所.飼養(yǎng)用家蠶人工養(yǎng)殖飼料購自山東蠶業(yè)研究所.1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)ESF1細胞和HEL1細胞培養(yǎng)在含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，MG63細胞培養(yǎng)在含100mL/L胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中.輻射前1d將細胞接種在直徑35mm的培養(yǎng)皿中，置于37,50mL/LCO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行輻射.1.2.2家蠶飼養(yǎng)蠶卵在溫度25，相對濕度70%下孵化，孵化后，均在常規(guī)條件下飼養(yǎng).1.2.3重離子輻射重離子種類為12C6+，LET為49.3keV/m，劑量率為200mGy/m，能量為45MeV/A.根據(jù)以前的一些實驗結(jié)果，細胞的輻射劑量定為0，0.1，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3Gy.家蠶卵隨機分為兩組，一組用0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，5，10，15，20，30Gy的劑量進行幅照后常規(guī)孵化，另一組在這些劑量輻射后放入超導(dǎo)磁體進行孵化.1.2.4細胞存活實驗輻射后細胞放置4h，用40g/L臺盼藍染色，分別對死活細胞進行計數(shù)，檢測重離子輻射對三種細胞存活率的急性影響.1.2.5細胞克隆形成實驗輻射后將細胞稀釋成單細胞懸液，按不同的預(yù)置數(shù)接種在60培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10d，固定染色后統(tǒng)計多于50個細胞的集落數(shù).細胞克隆生成率=(集落數(shù)/接種細胞數(shù))100%.1.2.6家蠶卵孵化發(fā)育實驗輻射后在25培養(yǎng)箱中孵化家蠶，計算其孵化率.并將孵化出的蠶進行飼養(yǎng)，觀察其生長過程和結(jié)繭時間，計算孵化率.從孵化第12日開始稱量家蠶幼蟲體質(zhì)量.每2d稱量1次，每組隨機稱量30頭，繪制生長曲線.待蠶結(jié)繭后，稱量繭質(zhì)量（每組隨機稱量30個蠶繭）.統(tǒng)計學(xué)處理：所有實驗數(shù)據(jù)都利用Prism3.0軟件采用t檢驗方法進行統(tǒng)計分析.2結(jié)果2.1重離子輻射對細胞存活率的影響HEL1細胞受到輻射的影響最大，在0.1Gy時存活率已經(jīng)開始降低，且隨輻射劑量的增大這種影響也增大，到1.5Gy時存活率降低50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）.ESF1細胞在1.5Gy時存活率下降約20%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而MG63細胞的存活率在輻射后4h時受到的影響很?。▓D1），差異無統(tǒng)計學(xué)意義.圖1重離子輻射對細胞存活率的影響2.2重離子輻射對細胞克隆形成能力的影響與0Gy時相比，HEL1細胞和ESF1細胞在0.1Gy的輻射劑量時克隆形成的能力降低90.2%和79.1%，并隨輻射劑量變化有一些波動，但其下降都在50%以上.而MG63細胞一直保持比正常細胞更高的克隆形成能力，直到0.5Gy才開始降低，并在1.5Gy時迅速降低到未輻射細胞的25%（圖2）.圖2重離子輻射對細胞克隆形成能力的影響2.3重離子輻射對家蠶卵孵化和發(fā)育的影響輻射后家蠶的出蟻率都隨著照射劑量的增大而降低，至30Gy輻射劑量時，出蟻率降到2.22%（圖3）.當(dāng)輻射劑量為010Gy時，家蠶卵在兩種不同重力條件下的孵化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義.但當(dāng)輻射劑量增加到15,20，30Gy時，失重環(huán)境與正常條件相比，明顯促進了家蠶卵的孵化（P<；0.05）.另外，比較兩種不同重力條件對家蠶孵化的影響發(fā)現(xiàn)，相同輻射劑量的時候，在磁體中發(fā)育的家蠶比磁體外發(fā)育的出蟻時間提前了3d.bP<；0.01vs模擬失重組.圖3重離子輻射對家蠶卵孵化率的影響家蠶發(fā)育實驗的結(jié)果顯示，在失重和常重力兩種條件下，重離子輻射對家蠶生長有影響，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）.兩種重力水平下均表現(xiàn)出隨輻射劑量的增加，家蠶生長的減慢.低劑量的重離子輻射對家蠶幼蟲的生長影響不明顯，但隨輻射劑量增加到10Gy，輻射組家蠶與對照組相比生長減慢，且隨著照射劑量的增加，影響程度加大（圖5，失重條件下數(shù)據(jù)未顯示）.蠶繭稱量的結(jié)果顯示，不同的輻射和重力水平對繭重的影響不明顯.但重離子輻射能造成家蠶結(jié)繭時間的延遲，當(dāng)劑量增加到20Gy時，家蠶結(jié)繭時間平均延遲約34d.圖4不同重力條件對家蠶幼蟲生長的影響3討論載人深空探測是各航天大國今后進一步進行空間資源開發(fā)的方向.在深空環(huán)境，輻射是在失重下的輻射，失重又伴隨著輻射，研究兩者的復(fù)合生物學(xué)效應(yīng)，對航天員健康保障具有重要的指導(dǎo)意義.圖5常重力條件下重離子輻射對家蠶生長的影響本實驗采用加速器產(chǎn)生的重離子模擬深空輻射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種細胞對輻射的反應(yīng)不同，HEL1細胞和ESF1細胞的存活率和克隆形成能力都隨輻射劑量的增大而降低，而骨肉瘤細胞MG63在輻射后4h的存活率變化不大，表現(xiàn)出了比正常細胞更強的抗輻射能力，但在輻射劑量增大到1.5Gy后，其克隆形成能力迅速降低.因此，重離子輻射能影響細胞的生存和增殖能力，但這種影響與輻射劑量和細胞種類都有關(guān)系.家蠶因為個體小、生長周期短、易于飼養(yǎng)，因此成為空間實驗好的動物模型.本實驗采用重離子輻射和失重環(huán)境處理家蠶卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重離子輻射抑制了家蠶卵的孵化過程，并表現(xiàn)出較好的劑量效應(yīng)關(guān)系.同時觀察發(fā)現(xiàn)，部分沒有孵化的蠶卵已經(jīng)轉(zhuǎn)青，提示輻射并不能完全抑制蠶卵發(fā)育的起始，而是將發(fā)育的進程終止在特定時期.家蠶卵在失重條件下孵化時間提前了3d，提示失重和輻射的復(fù)合條件會影響家蠶的早期胚胎發(fā)育過程.該結(jié)果與Shi等5的空間研究結(jié)果有較好的相似性，他們發(fā)現(xiàn)空間飛行搭載能使家蠶滯育卵的孵化時間縮短3d.另外，我們的結(jié)果還顯示高劑量的重離子輻射處理家蠶卵會影響家蠶幼蟲后續(xù)的生長，主要表現(xiàn)為延遲生長效應(yīng)，該結(jié)果與一些已有的空間研究結(jié)果相一致.Kotani等6發(fā)現(xiàn)失重主要影響早期胚胎發(fā)育，而宇宙射線則主要影響了生長，且失重和宇宙輻射有協(xié)同作用.Reitz等7在“MissionD1”和“COSMOS1987”研究了昆蟲胚胎的發(fā)育情況，結(jié)果顯示失重降低了孵化率，輻射造成了結(jié)構(gòu)異常，而復(fù)合效應(yīng)造成了極高頻率的結(jié)構(gòu)異常.本實驗中也觀察到失重和重離子輻射對家蠶卵早期胚胎發(fā)育的影響不是簡單的相加或相減，而是相互作用的一種復(fù)合效應(yīng).綜上所述,重離子輻射降低了細胞的存活和增殖能力，同時影響了家蠶從受精卵到幼蟲的發(fā)育，降低了出蟻率.失重環(huán)境可以縮短家蠶卵的孵化時間.致謝感謝蘭州大學(xué)高清祥老師、中科院近物所黨秉榮老師和韓晶同學(xué)在實驗中給予的幫助！【參考文獻】1FinoLD,BelliF,BidoliV,etal.ALTEAdatahandlingJ.AdvSpaceRes,2006,37:1710-1715.2NariciL,BidoliV,CasolinoM,etal.ALTEA:Anomalouslongtermeffectsinastronauts.AprobeontheinfluenceofcosmicradiationandmicrogravityonthecentralnervoussystemduringlongflightsJ.AdvSpaceRes,2003,31(1):141-146.3ZhangL,XieM,LiYZ,etal.AdjustiveeffectsofTaikongXielidecoctiononimmunologicalfunctioninsuspended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