Cdh1小干擾RNA載體的構建及鑒定.doc

Cdh1小干擾RNA載體的構建及鑒定【摘要】目的：構建Cdh1小干擾RNA載體，并將其轉染至Hela細胞進行鑒定.方法：根據(jù)pENTRTM/H1/TO中間載體要求，設計Cdh1小干擾RNA載體的干擾序列及無干擾作用的對照序列，合成相應的DNA單鏈，退火后連接到pENTRTM/H1/TO線性載體，形成完整載體，進行測序鑒定.分別將測序鑒定成功的Cdh1小干擾RNA載體及對照載體采用脂質體法轉染Hela細胞，轉染后48h提取細胞總RNA及細胞總蛋白，采用實時定量PCR和WesternBlot檢測Cdh1的表達.結果：經測序鑒定成功構建Cdh1小干擾RNA載體和對照載體，分別命名為pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol.與未轉染及轉染pENTR/shcontrol的Hela細胞相比，轉染pENTR/shCdh1的Hela細胞Cdh1表達降低（P<；0.05）.結論：成功構建Cdh1小干擾RNA載體，并能下調Hela細胞Cdh1的表達.【關鍵詞】細胞周期細胞分裂RNA小干擾Hela細胞0引言Cdh1是細胞周期后期分裂促進復合物（anaphasepromotingcomplex，APC）的一個調節(jié)亞基，在細胞周期調控中發(fā)揮著重要作用.近年來研究發(fā)現(xiàn)，Cdh1APC在哺乳動物神經元中有大量表達，具有調節(jié)軸突生長和突觸形成的功能，其在中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用1.為了進一步探討Cdh1的功能，我們擬構建Cdh1小干擾RNA載體，并將其轉染至Hela細胞進行鑒定.1材料和方法1.1材料pENTRTM/H1/TO載體試劑盒、TOP10感受態(tài)細菌和脂質體Lipofectamine2000均購自Invitrogen公司（美國）；DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清購自Gibco公司（美國）；實時定量PCR試劑盒購自Takara公司（日本）；LightCycler實時熒光定量PCR儀為Roche公司（美國）.1.2方法1.2.1載體的構建根據(jù)pENTRTM/H1/TO載體要求和參考文獻2設計Cdh1小干擾RNA載體的干擾序列及無干擾作用的對照序列，合成相應的DNA單鏈，具體設計如下:干擾序列topstrand5CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGAGACTTCTCA3,bottomstrand5AAAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGACTTCTCATT3；對照序列topstrand5CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC3,bottomstrand5AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT3.將干擾序列和對照序列根據(jù)退火條件95退火4min，室溫自然冷卻510min得到退火產物，用T4DNA連接酶連接到pENTRTM/H1/TO線性載體上，16連接2h，連接產物轉化TOP10感受態(tài)細菌，平鋪入含卡那霉素（50mg/L）抗性平板中過夜培養(yǎng)，挑取單菌落擴增培養(yǎng).提取質粒后，由英駿生物技術有限公司進行DNA測序鑒定.質粒分別命名為pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol.1.2.2細胞轉染采用脂質體轉染法將pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol質粒分別轉染Hela細胞，轉染前1d將Hela細胞傳代至六孔板，密度為90左右，在2個Eppendorf管中均加入250LOPTIMEM培養(yǎng)基，然后分別加入10L脂質體和4g質?；靹?，室溫下孵育5min.輕柔混合兩管液體，37孵育20min，加入Hela細胞中，將細胞置于37,50mL/LCO2培養(yǎng)箱中轉染4h后換成含有100mL/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基.轉染后48h，提取細胞總mRNA，逆轉錄成cDNA.1.2.3實時定量PCR檢測Cdh1的表達以逆轉錄產物為模板進行實時定量PCR反應，以actin基因為內參照，94變性5s，60退火及延伸20s，共反應40個循環(huán)，分析融解曲線.Cdh1基因上游引物為5GCCAACTGGAGCGTGAACTT3，下游引物為5TTCAGCAGTGCGGAGTAGGC3.actin基因上游引物為5TGACAGGATGCAGAAGGAGA3，下游引物為5TAGAGCCACCAATCCACACA3.以Ct表示Cdh1的表達，Ct=Ct（Cdh1）-Ct（actin），Ct值越高，Cdh1的表達越低WesternBlot檢測Cdh1的表達分別提取轉pENTR/shcdh1,pENTR/shcontrol及未轉染的Hela細胞總蛋白，以actin為內參照，取等量的蛋白質經聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉至硝酸纖維素膜上,用50g/L脫脂奶粉封閉1h，加10mg/L抗Cdh1mAb或抗actinmAb，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，漂洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色23min，水洗后照相.統(tǒng)計學處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以xs表示，采用方差分析，P<；0.05為差異有統(tǒng)計學意義.2結果2.1載體的構建經測序公司鑒定后構建的質粒pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol，序列完全正確，無堿基突變.2.2實時定量PCR檢測Hela細胞Cdh1的表達融解曲線分析表明設計的引物均得到了特異性的產物，與未轉染及轉染pENTR/shcontrol的Hela細胞相比，轉染pENTR/shCdh1的Hela細胞Cdh1表達明顯降低（P<；0.05,表1）.表1實時定量PCR檢測Hela細胞中Cdh1的表達（略）2.3WesternBlot檢測Cdh1蛋白的表達與未轉染及轉染pENTR/shcontrol的Hela細胞相比，轉染pENTR/shCdh1的Hela細胞Cdh1蛋白表達水平明顯降低(圖1).3討論細胞周期分裂后期促進復合物及其調節(jié)亞基Cdh1不僅在增殖細胞中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)其在哺乳動物大腦皮質、海馬、小腦等部位的終分化神經元核內有大量的表達，且具有泛素化周期蛋白B的活性，泛素化其他的底物，發(fā)揮其潛在作用4.研究表明在不同類型的神經元，Cdh1APC的表達降低引起的結果可能也不一樣.在胚胎鼠皮質神經元，降低Cdh1APC的表達，周期蛋白B表達升高，使細胞異常地重新進入細胞周期，引起神經元的凋亡5；而在新生鼠小腦顆粒神經元，抑制Cdh1APC的表達及活性，發(fā)現(xiàn)神經元仍可存活，且軸突增長1.RNA干擾技術是指生物體內導入短的雙鏈RNA(dsRNA)后使體內同源基因特異性的沉默.siRNA的來源有多種，如化學合成、體外轉錄合成及利用質?；虿《据d體表達siRNA.2002年，Brummelkamp等6首次使用小鼠H1啟動子構建了小發(fā)卡RNA（smallhairpinRNA，shRNA）表達載體pSUPER，并證實轉染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動物細胞內目的基因的表達.在體內表達的shRNA與dsRNA很接近，它包含了兩個由一個小環(huán)序列分離的短反向重復序列，是由Pol啟動子控制的.此方法可以長期抑制目的基因表達，因此,本課題選擇載體構建的方法來實現(xiàn)基因下調.實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產物檢測定量產生的偏差，該技術已被廣泛應用于檢測細胞mRNA表達量的變化、比較不同組織的mRNA表達差異等.本研究我們通過脂質體法將構建成功的載體轉染至Hela細胞中，結果顯示轉染pENTR/shCdh1的Hela細胞Cdh1表達明顯降低，說明該載體具有基因下調作用.【參考文獻】1KonishiY,StegmullerJ,MatsudaT,etal.Cdh1APCcontrolsaxonalgrowthandpatterninginthemammalianbrainJ.Science,2004,303（5660）:1026-1030.2BashirT,DorrelloNV,AmadorV,etal.ControloftheSCF(Skp2Cks1)ubiquitinligasebytheAPC/C(Cdh1)ubiquitinligaseJ.Nature,2004,428（6979）:190-193.3LivakKJ,SchmittgenTD.AnalysisofrelativegeneexpressiondatausingrealtimequantitativePCRandthe2(DeltaDeltaC(T)methodJ.Methods,2001,25(4):402-408.4GieffersC,PetersBH,KramerER,etal.ExpressionoftheCDH1associatedformoftheanaphasepromotingcomplexinpostmitoticneuronsJ.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96（20）:11317-11322.5AlmeidaA,BolanosJ.P,MorenoS,etal.Cdh1/Hct1APCisessential