不同處理對大鼠移植心臟存活時間的影響.doc

不同處理對大鼠移植心臟存活時間的影響【摘要】目的觀察供體脾細胞（SPC）與環(huán)磷酰胺（CP）聯(lián)合預處理對大鼠移植心臟存活時間的影響。方法應(yīng)用大鼠頸部心臟移植模型，實驗分為對照組（未干預組）、CsA組、SPCCP組。CsA組心臟移植后予環(huán)孢霉素A(CsA)10mg/kg，SPCCP組采用供體SPC和CP預處理移植受體，然后行大鼠頸部心臟移植術(shù)。觀察移植心臟存活情況及組織病理變化。結(jié)果對照組、CsA組、SPCCP組移植心臟存活時間分別為(7.22.4)、（15.84.3）、（30.410.7）天；組織病理檢查顯示，經(jīng)SPC+PC預處理的移植心臟排斥反應(yīng)明顯減弱。結(jié)論SPC和CP預處理可以誘導受體對移植物的免疫耐受，延長移植心臟的存活期，效果優(yōu)于CsA。【關(guān)鍵詞】心臟移植免疫耐受供體脾細胞環(huán)磷酰胺環(huán)孢霉素A大鼠Abstract:ObjectiveToevaluatetheeffectofpretreatmentwithdonorspleencells(SPC)andcyclophosphamide(CP)onthesurvivaltimeofcardiacallograft.MethodsTheexperimentwasperformedonSDratmodelsofheterotopiccervicalhearttransplantation.Theanimalsweredividedinto3groups.ThecontrolgroupconsistedofSDmodelswithouttreatment.InthecyclosporineA(CsA)drugcontrolgroup,therecipientsweretreatedaftertransplantationwithCsA10mg/kgipq2d.IntheSPC+CPpretreatmentgroup,theSDratswerepretreatedwithSPCivonD0andwithCP80mg/kgiponD2,andthetransplantationwascarriedoutonD10.Thelivingconditionandthesurvivaltimeoftheallograft,anditspathologywerenoticed.ResultsThesurvivaltimeinthecontrolgroup,CsAgroupandSPC+CPgroupwas(7.22.4),(15.84.3)and(30.410.7)respectively.HistopathologyshowedtheHVGrejectionreactionswereevidentlyattenuatedinthepretreatmenttestgroup.ConclusionPretreatmentwithSPCplusCPenablesthehosttoproduceimmunetolerancetothecardiacallograft,extendingthesurvivaltimeofthegraft,evenlongerthantheconventionalCsAtreatment.Keywords:cardiactransplantation；immunetolerance；pretreatment；donorspleencell；cyclophosphamide；cyclosporinA；rats器官移植在臨床醫(yī)學的應(yīng)用越來越廣泛，然而移植后排斥反應(yīng)卻嚴重阻礙著移植醫(yī)學的發(fā)展。本研究應(yīng)用大鼠異位心臟移植模型，采用門靜脈輸注供體脾細胞（donor-specificspleenocyts，SPC）及環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）注射誘導免疫耐受，對移植心臟的存活情況進行了觀察，現(xiàn)報道如下。1材料和方法1.1實驗動物和材料健康近交系Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，由山東大學實驗動物中心和徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供，雌雄不限，816周齡，體質(zhì)量200250g，隨意進食和飲水。質(zhì)量濃度1%的戊巴比妥鈉，體積分數(shù)為75%的乙醇，25103U/L肝素，質(zhì)量濃度2的罌粟堿，顯微外科手術(shù)器械（上海醫(yī)療儀器廠），醫(yī)用無損傷縫線，套管，絲線。1.2方法1.2.1脾細胞懸液的制備取Wistar大鼠，1%戊巴比妥鈉按4ml/kg(40mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后，無菌開腹取脾。將脾臟制備成單細胞混懸液1，顯微鏡下計數(shù)淋巴細胞數(shù)量。1.2.2實驗分組及處理分為對照組、CsA組和SPCCP組，每組受體和供體各12只，受體為SD大鼠，供體為Wistar大鼠。對照組（未干預組）：受體不做任何預處理。CsA組：受體不做任何預處理，心臟移植手術(shù)當日開始用環(huán)孢霉素A(CsA)10mg/kg，腹腔內(nèi)注射，每2天1次，共810次。SPCCP組：取受體SD大鼠，將制備好的供體脾細胞（SPC）5108個，自SD大鼠的門靜脈內(nèi)注入（d0），第2天(d2)SD大鼠的腹腔注射環(huán)磷酰胺（CP）80mg/kg；分別于第10天進行心臟移植手術(shù)。1.2.3心臟移植方法采用套管法行大鼠頸部心臟移植，具體方法見文獻2。1.3觀察指標1.3.1術(shù)后每日2次頸部視診或觸診，觀察移植心的博動情況。1.3.2病理觀察:分別于術(shù)后第7、11天及終末期等時間點各取4只供心，送病理學檢查，采用蘇木精-伊紅染色方法制作病理切片。觀察移植心臟大體情況，切片觀察炎性細胞、心肌壞死、肉芽組織增生情況，判斷病理改變程度。1.4統(tǒng)計學處理大鼠移植心臟存活時間用s表示，組間比較采用t檢驗，P0.05認為差異有顯著性。2結(jié)果2.1術(shù)后移植心臟觀察對照組（未干預組）術(shù)后移植心臟收縮有力、搏動幅度較大、心率快慢不等，心率均慢于受體心率（300500次/min）；隨時間延長，移植心臟逐漸增大，收縮力明顯減弱，搏動幅度降低，常在術(shù)后711天停跳。移植部位打開時見移植心臟周圍明顯水腫和滲出，但沒有膿液及明顯的感染征象。CsA組移植心臟的改變基本上也經(jīng)歷心臟搏動由強到弱再好轉(zhuǎn)、心臟增大再縮小的過程，總趨勢與SPC+CP組相似，但在移植心臟功能最差時仍可觸及搏動。SPCCP組移植心臟早期變化與對照組基本一致，出現(xiàn)收縮力逐漸減弱，搏動幅度逐漸減小，移植心臟明顯增大，在711天時最為嚴重；本組約有1/41/3移植心臟常觸不到搏動，僅可見頸部毛動，個別需要麻醉后觀察，而此時切開頸部手術(shù)區(qū)皮膚后，可見移植心臟有較弱的收縮。此種狀況常在術(shù)后15天左右好轉(zhuǎn)，隨著頸部手術(shù)瘢痕的軟化，移植心臟開始縮小，心率逐漸增快，搏動幅度和收縮力逐漸增加。有趣的是，在移植心臟功能最差時只要出現(xiàn)收縮力和搏動幅度增加等好轉(zhuǎn)征象，便能夠長期存活。在術(shù)后15天到1個月內(nèi)移植心臟明顯縮小，心率快慢不等，約有半數(shù)以上移植心臟出現(xiàn)心律不齊，持續(xù)時間長短不一，但均能自行好轉(zhuǎn)，有的可出現(xiàn)多次心律不齊，個別移植心臟心率比受體心率快。2.2移植心臟存活時間應(yīng)用CsA治療后，移植心臟的存活時間明顯延長，CsA組與對照組比較，差異顯著（P<；0.05），說明CsA可以顯著延長移植心臟的存活時間。SPC+CP組移植心臟的存活時間與CsA組比較，二者差異顯著（P<；0.05），說明SPC+CP聯(lián)合預處理對預防移植心臟排斥反應(yīng)的效果優(yōu)于CsA。3組大鼠移植心臟存活時間見表1。表13組大鼠移植心臟存活時間比較2.3各組終末期移植心臟大體變化對照組：移植心臟體積增大，明顯充血、水腫。CsA組：移植心臟體積輕度增大，呈實性變，質(zhì)韌，充血、水腫不明顯。SPC+CP組：移植心臟增大不明顯，質(zhì)軟、紅潤。2.4各組移植心臟組織病理學檢查術(shù)后7天、11天組織病理檢查見圖1。對照組：移植心臟的心肌壞死和細胞浸潤明顯增多；浸潤的炎性細胞主要為淋巴細胞、巨噬細胞和少量的中性粒細胞。CsA組：心肌壞死和細胞浸潤明顯減輕，浸潤的炎性細胞主要為淋巴細胞和巨噬細胞。與對照組比較，浸潤細胞中巨噬細胞明顯增加，而淋巴細胞明顯減少。3討論有報道稱通過門靜脈注射脾細胞，在不使用免疫抑制劑的情況下可以誘導完全異基因小鼠間的皮膚移植耐受3。通過門靜脈途徑給予同種異體抗原，可誘導供體特異性耐受，并且經(jīng)門靜脈輸注最為有效；其次為外周靜脈、腹腔；皮下最差。我們采用供體的脾細胞處理受體（d0），在第2天給予門靜脈注射CP5080mg/kg。在這種模型中，供體抗原和干細胞聯(lián)合治療對產(chǎn)生耐受是必需的，在注射供體抗原后，對供體抗原發(fā)生反應(yīng)的T細胞被激活并進行增殖，而增殖的細胞可被隨后給予腹腔注射的CP選擇性破壞4，抗原激活的T細胞首先從外周消失，隨后在外周和胸腺內(nèi)便出現(xiàn)了暫時的嵌合體狀態(tài)5-6，使得在外周7和胸腺內(nèi)8對供體反應(yīng)的免疫細胞發(fā)生克隆丟失。由此可見，來源于供體的骨髓成分在胸腺髓質(zhì)中生存導致了與移植物起反應(yīng)的胸腺細胞不斷缺失。在這種模型中，移植耐受的維持是胸腺水平與移植物發(fā)生反應(yīng)T細胞持續(xù)缺失的結(jié)果。克隆丟失與移植耐受的作用是克隆無反應(yīng)性伴有某種程度的細胞程序性死亡的結(jié)果。本實驗對SPC+CP誘導的免疫耐受進行了研究，即用SPC通過門靜脈注射，2天后給予80mg/kg的CP。因為在輸注異體抗原后，受體內(nèi)的T細胞在13天內(nèi)增殖活躍，此時用藥容易殺死增殖的T細胞，造成克隆排除9，因此，我們選擇SPC注射后2天作為CP用藥的最佳時間。10天后進行心臟移植，結(jié)果移植物的存活時間明顯延長。病理檢查結(jié)果中，經(jīng)SPC+CP處理后，移植心臟炎癥反應(yīng)、心肌壞死及肉芽組織增生情況較CsA組、對照組輕，說明該法誘導免疫耐受效果良好。采用SPC+CP預處理后，我們觀察到大部分移植心臟在手術(shù)后均逐漸增大，搏動幅度逐漸降低，頻率也有減慢，而在711天之后，增大的移植心臟開始縮小，隨著傷口周圍瘢痕的軟化，移植心臟搏動幅度漸增大，頻率也加快，自此以后移植心臟可以長期存活。本組術(shù)后存活至12個月的移植心臟通?？s小至手術(shù)時大小。而在對照組中，移植心臟早期的變化與SPC+CP組基本相同，但增大更明顯，搏動幅度降低，頻率漸減慢，常在711天完全停跳(沒有好轉(zhuǎn)征象)，移植心臟周圍常有明顯水腫滲出，心肌也有腫脹、充血，顯微鏡下可見到心肌細胞壞死，少數(shù)水腫明顯者切口愈合欠佳，縫線處的皮膚裂開。在急、慢性排斥反應(yīng)模型中，移植心臟的早期變化有許多相似之處，僅根據(jù)頸部心臟觀察情況很難對二者進行區(qū)分。但急性排斥反應(yīng)時移植心臟增大、炎癥水腫常更明顯，且至停跳時無好轉(zhuǎn)征象，而SPC+CP組雖然搏動幅度和頻率逐漸減低，但后來漸好轉(zhuǎn)，可以長期存活。本組實驗結(jié)果表明，SPC+CP預處理誘導免疫耐受效果良好，能夠明顯延長大鼠同種異體心臟移植的存活時間，效果優(yōu)于CsA?！緟⒖嘉墨I】1郭宏偉，吳清玉，謝蜀生，等.多次輸注供體脾細胞誘導心臟移植免疫耐受的實驗研究J.中華外科雜志，2004，42(11):664-667.2張偉，張中明，錢偉民，等.大鼠頸部心臟異位移植模型的建立J.徐州醫(yī)學院學報，2008，28（6）：360-363.3MoritaH，SugiuraK，InabaM，etal.AstrategyfororganallograftswithoutusingimmunosuppressantsorirradiationJ.ProcNatlAcadSciUSA,1998，95(12):6947-6952.4MaedaT，EtoM，NishimuraY，etal.Directevidenceforclonaldestructionofallo-reactiveTcellsinthemicetreatedwithcyclophosphamideafterallo-primingJ.Immunology,1993，78(1):113-121.5MayumiH，HimenoK，ShinT，etal.Drug-inducedtolerancetoallograftsinmice.ToleranceinductioninH-2-haplotype-identicalstraincombinationsinmiceJ.Transplantation,1985，40(2):188-194.6MayumiH，GoodRA.Inductionoftoleranceacrossmajorbarriersusingatwo-stepmethodwithgeneticanalysisoftoleranceinductionJ.Immunobiology,1989，179(1):86-108.7MaedaT，EtoM，NishimuraY，etal.Roleofperipheralhemopoieticchimerisminachievingdonor-specifictoleranceinadultmiceJ.JImmunol,1993，150(3):753-762.8EtoM，