當(dāng)歸多糖的分離、純化及分析鑒定.doc

當(dāng)歸多糖的分離、純化及分析鑒定作者：商澎楊鐵虹賈敏梅其炳趙文明曹之憲趙德化【關(guān)鍵詞】當(dāng)歸/分離和提純關(guān)鍵詞:當(dāng)歸/分離和提純；當(dāng)歸/分析；多糖摘要:目的從新鮮中國當(dāng)歸Angelicasinensis（Oliv）Diels中分離純化出多個多糖組分，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行分析鑒定.方法采用水煮乙醇沉淀法從新鮮當(dāng)歸中提取當(dāng)歸總多糖AP-0；AP-0用80g・；kg-1十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）沉淀得到當(dāng)歸多糖亞組分AP-1；CTAB處理后的上清用10g・；kg-1H3BO3，2mol・；L-1NaOH處理得到當(dāng)歸多糖亞組分AP-2；所剩上清，用乙酸處理后，再用乙醇沉淀，得到當(dāng)歸多糖亞組分AP-3.總糖含量測定采用改良苯酚-硫酸法；蛋白質(zhì)含量測定采用ServaBlue-G染料結(jié)合法；糖醛酸含量測定采用間羥基連苯法.采用新華中速濾紙紙色譜和硅膠G薄層色譜分析多糖各組分的單糖組成.高效凝膠過濾色譜和高效離子交換色譜分析多糖各組分的Mr分布和電荷性質(zhì).紅外光譜法分析多糖各組分的糖苷鍵構(gòu)成.結(jié)果AP-0總糖970g・；kg-1，其中糖醛酸210g・；kg-1，蛋白質(zhì)30g・；kg-1；AP-1總糖970g・；kg-1，其中糖醛酸172g・；kg-1，蛋白質(zhì)30g・；kg-1；AP-2總糖830g・；kg-1，其中糖醛酸257g・；kg-1，蛋白質(zhì)170g・；kg-1；AP-3總糖970g・；kg-1，其中糖醛酸86g・；kg-1，蛋白質(zhì)30g・；kg-1.AP-0，AP-1，AP-2和AP-3主要由葡萄糖，阿拉伯糖和少量糖醛酸組成.AP-0，AP-1，AP-2和AP-3分別由5種不同分子量多糖部分組成；在電荷特性上又可分別分為4個不同部分.紅外光譜提示4種多糖的糖鏈構(gòu)型為-D-葡萄吡喃型.結(jié)論當(dāng)歸多糖的分離純化方法有效、實用；得到的AP-0，AP-1，AP-2和AP-3為具有不同理化性質(zhì)的多糖組分.Keywords:angelicasinensis/isolation&；purification；angelicasinensis/analysis；polysaccharidesAbstract:AIMToisolateandtopurifysomepolysaccha-ridesfractionsfromAngelicasinensis（Oliv.）Dielsandtoan-alyzeandtodeterminethecharactersofeachfraction.METHODSHotwaterextractingandethanolprecipitatingmethodwasemployedtoisolatetotalpolysaccharide（namedAP-0）fromfreshrootsofAngelicasinensis.BytreatingAP-0with80g・；kg-1CetyltrimethylammoniumBromid（CTAB），theAP-1wasobtainedfromtheprecipitate.AP-2wasobtainedfromtheprecipitatebytreatingthesupernateleftfromprecedingstepwith1g・；kg-1H3BO3，2mol・；LNaOH.Aftertreatingtheleftsupernatewithacetaticacidandprecipitingwithethanol，AP-3wasobtained.Theamountsoftotalcarbohydrates，proteinsanduronicacidsweredeterminedwithimprovedphenol-sulfuricacid，ServaBlueGdyebindingandm-hydroxyldiphenylmethods，respec-tively.Themonosaccharidescontainedineachpolysaccha-rideswereanalysedbyusingpaperchromatographyandthin-layerchromatography.Highperformancegelfiltrationchro-matographyandhighperformanceanion-exchangechro-matographywereemployedtodeterminetherelativemolecu-larmassesandchargecharactersofeachpolysaccharides.In-fraredspectrophotometerwasusedtoanalyzethestructuresofglucosidebondsofeachsample.RESULTSFourAngeli-capolysaccharideswereobtained.Thetotalcarbohydrates，uronicacidsandproteinsofeachAngelicapolysaccharideswere:970g・；kg-1，210g・；kg-1and30g・；kg-1ofAP-0；970g・；kg-1，172g・；kg-1and30g・；kg-1ofAP-1；830g・；kg-1，257g・；kg-1and170g・；kg-1ofAP-2；970g・；kg-1，86g・；kg-1and30g・；kg-1ofAP-3.ThemonosaccharidesconstituentsoftheFourAngelicapolysaccharideswereglu-cose，arabinoseanduronicacids.4Angelicapolysaccharideswerecomposedof5fractionswithdifferentMrand4frac-tionswithdifferentchargecharacters，respectively.Infraredspectrumsuggestedthattheglucosidebondsbe-D-glucopyranose.CONCLUSIONMethodsofpurificationandanalysiswereeffectiveandpracticalforthepreparationofAngelicapolysaccharides.4Angelicapolysaccharidesweredifferentintheirphysico-chemicalcharacters.0引言多糖作為一類重要的生物大分子，具有廣泛的生物學(xué)作用1，2，但由于多糖分離純化和結(jié)構(gòu)分析等多方面的限制，大多數(shù)多糖仍作為有效部位或條件提取物進(jìn)行應(yīng)用.藥理學(xué)研究，要求所用藥物應(yīng)具有均一、可控的理化性質(zhì)，以保證實驗結(jié)果的一致性和可比性.我們參考梅其炳等3-6和Yamada等7-9當(dāng)歸多糖的提取與分離方法，建立了從中國當(dāng)歸中分離提取出總多糖，并進(jìn)一步分離純化得到不同多糖組分的方法；并對所得到的多糖組分的理化性質(zhì)進(jìn)行分析.1材料和方法1.1材料新鮮中國當(dāng)歸Angelicasinensis（Oliv）Diels，于霜降后3d，采自甘肅省岷縣城郊鄉(xiāng)疊藏河谷地.950g・；kg-1乙醇（AR），透析袋（截留Mr8000，購自華美生物工程公司），十六烷基三甲基溴化銨（AR，西安化學(xué)試劑采供站），硼酸、氫氧化鈉、乙酸、濃硫酸、四硼酸鈉、正丁醇、乙酸乙酯、吡啶、乙酸苯胺、鄰苯二甲酸（均為AR，西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）.苯酚（AR重蒸餾，華美生物工程公司）.間羥基連苯（AR，美國Sigma公司）.ServaBlue-G（德國ServaFeinbochemic）.牛血清白蛋白（華美生物工程公司）.溴化鉀（GR，西安化學(xué)試劑廠）.新華中速濾紙（杭州新華試紙廠）.碳酸鋇（CP，天津化學(xué)試劑廠）.D-葡萄糖（AR，西安化學(xué)試劑廠）.L-阿拉伯糖（AR，Sigma），D-木糖（中國醫(yī)藥公司德國進(jìn)口分裝），D-甘露糖（上海試劑二廠），D-半乳糖（北京市化學(xué)試劑研究所），D-鼠李糖（北京化學(xué)試劑公司），D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸（SigmaChemical），硅膠G、羧甲基纖維素（天津化學(xué)試劑廠），F(xiàn)lukaDextranStandard:12000，50000，80000，670000（重均相對分子質(zhì)量Mr分別為:11600，48600，80900，667800，瑞士Fluka），PharmaciaDextranStandard:T-10，T-40，T-70，T-500和T-2000（Mr分別為:10000，40000，70000，500000和2000000，瑞典PharmaciaAB）.EZ-DRY冷凍干燥機(jī)（美國FTSSystem公司），WB2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Hejdoiph公司），GL-20冷凍高速離心機(jī)（湘儀-TOMY聯(lián)合制造），TLC-G臺式冷凍離心機(jī)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗儀器廠），調(diào)溫電熱套（河北省黃驊市電器廠），Beckman168高效液相色譜系統(tǒng)（美國Beckman公司），Beck-manDU-600紫外可見光分光光度計（美國Beckman公司），制冰機(jī)（日本Sanyo公司），高效凝膠過濾色譜柱BiosepSEC-3000（300mm7.8mm）（美國Phenomenex公司），高效陰離子交換色譜柱TSKDEAE-5PW（7.5mm75mm）（美國Beckman公司），TGL.16G臺式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），PE紅外分光光度計（美國P-E公司），DG3022A酶聯(lián)免疫檢測儀（華東電子管廠）1.2方法1.2.1當(dāng)歸總多糖AP-0的分離提取新鮮當(dāng)歸清洗后絞碎，用950g・；kg-1乙醇回流3次，每次4h.合并3次乙醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇，可得到紅色的當(dāng)歸精油.醇提殘渣烘干后，用蒸餾水回流3次，每次4h.3次提取液合并后，減壓蒸餾濃縮.濃縮液預(yù)冷后，加入3倍體積的預(yù)冷950g・；kg-1乙醇，攪拌.靜置后，用高速冷凍離心機(jī)收集沉淀得到粗提多糖.粗提多糖用蒸餾水溶解，4條件下對蒸餾水透析3d.離心去除沉淀，最終上清液經(jīng)冷凍干燥得到白色凍干粉末，即AP-0.1.2.2AP-1，AP-2和AP-3分離純化每500mL凍干前的AP-0液體中加入80g・；kg-1十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）500mL，產(chǎn)生沉淀，靜置12h，5000r・；min-1離心10min收集沉淀.沉淀部分用350mL100g・；kg-1NaCl溶解，加入4倍體積預(yù)冷的950g・；kg-1乙醇，產(chǎn)生乳白色沉淀，收集沉淀，蒸餾水溶解后，經(jīng)透析、凍干得到白色粉末狀A(yù)P-1.CTAB處理后的上清為無色清液，加入10g・；kg-1H3BO3pH6.0，攪拌再用2mol・；L-1NaOH調(diào)pH為11.0，產(chǎn)生乳黃色果凍狀沉淀，離心收集沉淀，用20g・；kg-1乙酸調(diào)pH為7.0后，用100g・；kg-1NaCl溶解，溶解液中加入4倍體積的預(yù)冷950g・；kg-1乙醇，產(chǎn)生乳白色沉淀，離心收集沉淀，蒸餾水溶解后，經(jīng)透析、凍干得到白色粉末狀A(yù)P-2.AP-2提取后的上清液用乙酸調(diào)pH為4.4，加入4倍體積的預(yù)冷950g・；kg-1乙醇，4靜置過夜，離心收集沉淀，蒸餾水溶解后，經(jīng)透析、凍干得到白色粉末狀A(yù)P-3.1.2.3分析鑒定總糖含量測定10，11采用改良的苯酚-硫酸法12.糖醛酸含量測定13，14采用間羥基連苯法15.蛋白質(zhì)含量測定采用Servablue-G染料結(jié)合法16.重均相對分子質(zhì)量及電荷特性分析詳見參考文獻(xiàn)17-20.單糖組成分析:多糖樣品的水解分別取AP-0，AP-1，AP-2和AP-3:15.8，18.0，20.0和21.7mg，分別加入濃硫酸2.0mL，溶解后移入水解管中，熔融封管，100烘箱中水解6h.水解后，加入固體碳酸鋇中和，4000r・；min-1離心，取上清液做紙色譜和薄層色譜分析.標(biāo)準(zhǔn)單糖液配制:稱取Rha，Xyl，Ara，F(xiàn)ru，Gal，Man，Glu，GluA，GalA各25mg，分別溶于0.5mL重蒸餾水中，待紙色譜和薄層色譜分析.單糖和多糖水解物的紙色譜法和薄層色譜法:紙色譜分析采用新華中速濾紙（10cm30cm），展開劑為:正丁醇:乙酸乙酯:吡啶:乙酸=25101013；顯色劑:苯胺-鄰苯二甲酸正丁醇溶液.薄層色譜法:采用硅膠G自制18cm18cm薄層色譜板，展開劑、顯色劑同紙色譜.紅外光譜分析:分別取AP-0，AP-1，AP-2和AP-3凍干樣品2mg，加入200mg經(jīng)干燥的KBr晶體，在紅外燈照射下，在瑪瑙研缽中研磨后，用壓片機(jī)壓片，紅外分光光度計4004000cm-1中紅外區(qū)掃描，測定透光率曲線.紫外光譜分析:分別取AP-0，AP-1，AP-2和AP-3凍干樣品，蒸餾水配制濃度約為20mg・；L-1的溶液，用紫外-可見光分光光度計190400nm掃描，測定紫外區(qū)的吸收光譜.2結(jié)果2.1當(dāng)歸多糖組分表觀性狀液體狀的AP-0為淺米色，AP-1為乳白色，AP-2為淺米色，AP-3為啤酒色.凍干后的AP-0，AP-1，AP-2和AP-3均為白色鱗片狀結(jié)晶，極易潮解.2.2每批產(chǎn)量、得率和成分每批處理2700g新鮮當(dāng)歸，可得AP-0，AP-1，AP-2和AP-3的產(chǎn)量為81.9，9.8，25.9和30.1g；相對于新鮮當(dāng)歸的提取得率為3.0%，0.36%，0.96%和1.11%.AP-0AP-3中總糖含量為970，970，830和970g・；kg-1；糖醛酸含量為210，172，257和86g・；kg-1；蛋白質(zhì)含量為30，30，170和30g・；kg-1.2.3Mr分布和電荷特性當(dāng)歸多糖AP-0，AP-1，AP-2和AP-3分別由5個不同的多糖組分組成，其重均Mr（103）AP-0為>；67000，43372，16755，8210和1554；AP-1為>；67000，>；67000，26957，5102和1917；AP-2為>；6700043373，26957，1971和1225；AP-3為>；67000，34194，16755，6472和3171.當(dāng)歸多糖AP-0，AP-1，AP-2和AP-3經(jīng)高效陰離子交換色譜分析，分別可分為4個不同離子化程度的組分，具有不同的色譜保留時間tR，結(jié)果見AP-0為3.0，9.0，12.0和15.5min；AP-1為4.0，13.0，20.0和23.0min；AP-2為4.0，13.0，16.0和19.0min；AP-3為3.0，7.0，15.0和20.0min.2.4單糖組成分析AP-0，AP-