Elisa原理及應用.ppt

酶聯免疫吸附法,（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）,內容,一.Elisa的發(fā)展二.ELISA的定義三.ELISA的原理四.ELISA的基本方法五.ELISA的應用六.ELISA類別七.ELISA的特點八.ELISA實驗中使用的儀器,一.Elisa的發(fā)展,免疫標記技術,免疫熒光技術（IFA）,放射免疫測定法（RIA）,免疫酶測定法（EIA）,酶聯免疫吸附試驗（ELISA）,酶免疫組化法,二.ELISA的定義,是一類常用的免疫酶技術，將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，用酶標記抗原或抗體，使抗原抗體反應在固相表面進行，檢測液體中未知抗體或抗原的方法。,三.ELISA的原理,ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。,在ELISA方法中有三個必要的試劑：固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）酶標記的抗原或抗體，稱為“結合物”（conjugate）酶反應的底物（顯色劑）,四.ELISA的基本方法,基本實驗流程：,微孔板,包被抗體,加樣品(抗原),孵育洗滌,加酶聯二抗(辣根過氧化物酶),孵育洗滌,孵育,加終止液(硫酸溶液),加底物(鄰苯二胺)顯色,比色,四.ELISA的基本方法,包被抗體的酶標反應板,加受檢標本（抗原）形成固相抗體抗原復合物,洗滌除去未結合的其他物質,加酶標抗體生成抗體-待測抗原-酶標記抗體的復合物,徹底洗滌未結合的酶標抗體,加底物進行酶催化反應,根據顏色反應的程度進行抗原的定性或定量測定,五.ELISA的應用,ELISA法在生物醫(yī)學各領域的應用范圍概括為四個方面：免疫酶染色各種細胞內成份的定位研究抗酶抗體的合成顯現微量的免疫沉淀反應定量檢測體液中抗原或抗體成份,六.ELISA類別,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，主要類型有：雙抗體夾心法間接法競爭法捕獲法親和素-生物素-ELISA法,雙抗體夾心法,雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，先將已知抗體連接在固相載體上，待測抗原與抗體結合后再與酶標二抗結合，形成抗體-待測抗原-酶標二抗的復合物，復合物的形成量與待測抗體原成正比。,間接法,間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。,競爭法,當小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的抗體結合位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。,七.ELISA的特點：,靈敏度高：ELISA測定法的靈敏度來自作為報告基團的酶。由于酶的催化效率很高，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產生可供觀察的顯色反應，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。特異性高：ELISA的特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性準確性高、檢測時間短、價格低廉、判斷結