高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白ASPA的mRNA和蛋白表達(dá)及布地奈德的干預(yù)作用

碩士學(xué)位論文 論文題目 高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA和蛋白表達(dá)及布地奈德的干預(yù)作用 研究生姓名 何 蓉 指導(dǎo)教師姓名 肖志輝 專 業(yè) 名 稱 兒科學(xué) 研 究 方 向 新生兒 論文提交日期 2013年 3月 高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA 和蛋白表達(dá)及布地奈德的干預(yù)作用 中文摘要 I 高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性 物質(zhì)相關(guān) 蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA和蛋白表達(dá)及 布地奈德的干預(yù)作用 中文摘要 目的： 1 建立新生大鼠高氧肺損傷的動(dòng)物模型； 2 觀察與比較高氧性損傷 時(shí) 新生大鼠肺組織的病理組織 學(xué)改變，以及 肺表面 活性 物質(zhì)相關(guān) 蛋白 -A（ pulmonary surfactant protein-A， SP-A） 的 mRNA 及其蛋白 的表達(dá)變化，從而探討 SP-A 在新生大鼠高氧肺損傷發(fā)生、發(fā)展中可能的作用； 3 探討吸入 性 糖皮質(zhì)激素布地奈德（ budesonide， BUD） 是 否通過(guò)調(diào)控 SP-A 的表達(dá) 從而發(fā)揮 對(duì) 高氧肺損傷 的 保護(hù)作用 ，為臨床防治高氧 肺 損傷提供 理論 依據(jù) 。 方法： 取 108 只出生 1 天內(nèi)的新生 Sprague Dawley（ SD）大鼠（雌雄不限）隨機(jī)分成三 組：即 組：空氣組 （對(duì)照組） ， 組：高氧生理鹽水 組（高氧組）， 組：高氧布地奈德組（干預(yù)組），每組 36 只。 組置于空氣中；將 、 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 持續(xù)暴露于 90 95 氧箱中 ， 直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 組 于 每日霧化吸入 NS 10ml， 組 每日 同一時(shí)間點(diǎn)吸入 溶解 BUD 的等量的 NS(含 BUD 2mg)。 設(shè)立實(shí)驗(yàn)后 3、 7 和 14 天 3 個(gè)時(shí)間觀測(cè)點(diǎn) ， 處死動(dòng)物， 行支氣管肺泡灌洗，測(cè)定灌洗液中蛋白含量 ；取肺組織，計(jì)算 肺濕 /干重比 ； HE 染色觀察組織病理學(xué)變化；Westen Blot 方法檢測(cè) SP-A 蛋白含量、 RT-PCR 方法檢測(cè) SP-A mRNA 表達(dá)水平 。 結(jié)果： 1 各組實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物一般情況 ： 組（空氣組）中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間精神狀態(tài)佳、活動(dòng)靈活，進(jìn)食正常。 組（高氧組）中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逐漸出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)皮毛無(wú)光澤、精神萎靡、活動(dòng)少 , 脫氧后煩躁不安 , 呼吸困難明顯 , 鼻尖發(fā)紺 , 恢復(fù)供氧可逐中文摘要 高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA 和蛋白表達(dá)及 布地奈德的干預(yù)作用 II 漸緩解； 組（干預(yù)組）中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況介于前兩者之間。 2 肺組織病理切片： 組（空氣組）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織病理切片見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)規(guī)整，無(wú)炎癥反應(yīng)，肺泡大小、形態(tài)均一； 組（高氧組） 高氧暴露 3d 后 可見(jiàn)肺血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞及炎 性 細(xì)胞 ，肺間隔斷裂，肺泡腔擴(kuò)大；高氧 7 天時(shí)，炎性滲出、肺水腫 、肺出血較前更加明顯，部分肺間隔增寬變形，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂；14 天時(shí)更為明顯，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間隔重度增厚， 出現(xiàn)明顯纖維化改變， 肺泡發(fā)育受阻，肺泡 數(shù)量 明顯 減少 、 大小不一，肺泡腔明顯增大 , 部分肺泡融合 ， 可見(jiàn)肺大泡或肺不張。 組（干預(yù)組）肺組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)改變較 II 組有明顯減輕。 3. 肺組織濕 /干重比值（ W/D）：實(shí)驗(yàn) 3 天、 7 天 時(shí) ， 組（高氧組）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織濕 /干重比值（ W/D）較 組（空氣組）增高（ P0.01），實(shí)驗(yàn) 14 天時(shí)， 組較 組升高更明顯（ P0.01），而 組（干預(yù)組）與 組相比， 3 天、 7 天 、 14 天的比值均有明顯下降（ P0.01）。 4. 支氣管肺泡灌洗液（ BLAF）中蛋白含量 （ TP） 測(cè)定：實(shí)驗(yàn) 3 天、 7 天和 14天時(shí) 組（高氧組） BLAF 中 TP 均高于 組（空氣組），差異 有顯著性意義（ P0.01）； 組 3 天時(shí) BLAF 中 TP 較 II 組降低（ P0.05）， 7 天、 14 天時(shí)明顯降低（ P0.01） 。 5. 肺組織中 SP-A 蛋白 表達(dá)水平的變化： Westen Blot 檢查測(cè)定結(jié)果表明 ：與 I組動(dòng)物比較， II 組（高氧組）實(shí)驗(yàn) 3 天時(shí) SP-A 蛋白 表達(dá) 明顯 增高（ P0.01）； 7 天、14 天 SP-A 蛋白 表達(dá)下降， 14 天時(shí)下降更明顯（ P0.01）。 組（干預(yù)組）實(shí)驗(yàn) 3天時(shí) SP-A 蛋白 表達(dá)介于 I 組與 II 組之間（ P0.05）， 7 天、 14 天 SP-A 蛋白 的表達(dá)均較高氧組組顯著升高 (P0.05)。 6. 肺組織中 SP-A mRNA 表達(dá)水平的變化： RT-PCR 檢查測(cè)定結(jié)果表明 ：與 I 組動(dòng)物比較， II 組實(shí)驗(yàn) 3 天時(shí) SP-A mRNA 表達(dá)水平明顯增高，差異有顯著性意義(P0.05)； 7 天時(shí)可見(jiàn)表達(dá)下降， 14 天時(shí)下降更明顯 (P0.01)。 III 組的 SP-A mRNA表達(dá)水平接近于 I 組 SP-A mRNA 的表達(dá)趨勢(shì)；實(shí)驗(yàn) 3 天時(shí) SP-A mRNA 表達(dá)水平介于 I 組與 II 組之間，與 II 組比較有顯著性意義 (P0.05)； 7 天、 14 天時(shí)表達(dá)水平較 II組顯著升高 (P0.05)。 結(jié)論： 1. 高氧對(duì)新生大鼠肺組織有 損傷作用，并隨吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。主要病理變化為肺組織局部 水腫 和出血、炎癥滲出、 結(jié)構(gòu)組織紊亂 、 肺泡發(fā)育障礙、肺泡數(shù)目高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA 和蛋白表達(dá)及布地奈德的干預(yù)作用 中文摘要 III 減少和 肺間質(zhì)纖維化 。 2. 高氧性肺損傷 時(shí) ， SP-A 的 mRNA 和蛋白 在肺組織中 的 表達(dá) 規(guī)律呈現(xiàn)先增高后降低 的趨勢(shì) ， 隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng) 與肺損傷程度相平行，提示高氧肺損傷 發(fā)生過(guò)程中機(jī)體具有一定的自我 保護(hù)機(jī)制，而 肺表 面活性 物質(zhì)相關(guān) 蛋白分泌減少或功能缺陷，是高氧肺損傷的重要因素。 3. 吸入糖皮質(zhì)激素 布地奈德可 能 通過(guò)抗氧化、減輕炎癥反應(yīng)， 進(jìn)而上調(diào) SP-A 的mRNA 和蛋白 的 表達(dá)與活化 ，從而減輕肺損傷， 對(duì) 高氧肺損傷 的發(fā)生具有一定 保護(hù)作用。 關(guān)鍵詞 ： 肺表面 活性 物質(zhì)相關(guān) 蛋白 -A，高氧肺損傷，新生鼠，布地奈 德 作 者： 何 蓉 指導(dǎo)老師： 肖志輝 英 文摘要 高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA 和蛋白表達(dá)及布地奈德的干預(yù)作用 IV Budesonide Impact on the Expression of Pulmonary Surfactant Protein-A (SP-A) in Hyperoxia - induced Lung Injury in Neonatal Rats Abstract Objectives: 1. To establish a model of hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats； 2. To observe the histopathological changes in neonatal rat lung of hyperoxia-induced injury as well as its affecting the expression of SP-A mRNA and protein by comparing with control group, and to study the role of SP-A in the development of hyperoxia-induced lung injury； 3. To observe whether the inhaled corticosterroids, budesonide, has a protective effect to hyperoxia-induced injury and affects the expression of SP-A, and in order to provide a theoretical evident for clinical treatments of hyperoxia-induced lung injury. Method: The 108 neonatal SD rats (less than 1 day after birth, no male or female) were randomly divided into 3 groups: Group , Air Group (Control Group)； Group , Hyperoxygen and Saline Group (Hyperoxia Group)； Group , Hyperoxygen and Budesonide Group (Interfering Group). Each group had 36 rats. Group was incubated in normal air. Group and were both exposed in special oxygen boxes, and the oxygen concentration was continuously to 90%-95%.In daily Group was inhaled 10ml of saline. And at the same time, Group was inhaled 10ml of dissolved BUD saline (with BUD 2mg). The rats were executed on the 3th, 7th and 14th day. Using bronchoalveolar lavaging to measure the protein level in lavaging fluid； Taking the lung tissue to weight, afterwise dry, and calculate the wet/dry proportion；Using HE to observe the histopathological changes；Using Westen Blot to measure the level of SP-A protein in lungs；Using RT-PCR to detect the expression level of SP-A mRNA. 高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA 和蛋白表達(dá)及布地奈德的干預(yù)作用 英 文摘要 V Result: 1. The general condition: Group (Air Group) was viable and fed well. Group (Hyperoxia Group) was dull, apathetic, less active, even dyspnea after hyperoygen abortion. The situation of Group (Interfering Group) was between the former two. 2. Lung histopathology: In Group (Air Group), the size, shape and distrubution of alveoli were normal. No inflamation can be found. In Group (Hyperoxia Group), after 3 days of hyperoxygen, the small blood vessels expanded congestion, alveolar cavity enlarged and appeared red blood and inflammatory cells, pulmonary septal area fractured. After 7 days of hyperoxygen, inflammation, pulmonary edema, pulmonary hemorrhage were more obvious, the pulmonary septal area got wider and the structure of lung tissue was arranged disorder. After 14 days of hyperoxygen, the changes were more obvious, the structure of lung tissue was more disorder, the pulmonary septal area got severe wider, significant fibrosis could be seen, the numbers of alveoli reduced evidently, alveolar cavity enlarged obviously. In Group (Interfering Group), comparing with Group , the structure and morphology in the lung tissue were milder. 3. The wet/dry porpotion (W/D) of lung tissue: on the 3th and 7th day of this study, the W/D in Group is higher than Group (P0.01). And on the 14th day, it is more significantly higher than Group (P0.01). However, comparing with Group , the W/D on the 3th, 7th and 14th day is obviously reduced in Group (P0.01). 4. The level of the protein in bronchoalveolar lavage fluid (BLAF): on the 3th, 7th and 14th day, the BLAF protein level in Group is higher than Group , the differences are statistically significant (P0.01). However, on the 3th day the protein in Group is decreased comparing with Group (P0.05),and on the 7th and 14th day the protein level is significantly lower (P0.01). 5. The variation of the expression level of SP-A protein in lung tissue: the Westen Blot shows that on the 3th day, the expression level of SP-A protein in Group is higher than Group (P0.01), and on the 7th and 14th day the expression level is significantly lower (P0.01). On the 3th day, the expression level of SP-A protein in Group is between Group and Group （ P0.05） , and on the 7th and 14th day the expression level is significantly increased comparing with Group (P0.05). 6. The variation of the expression level of SP-A mRNA in lung tissue: the RT-PCR shows that on the 3th day, the expression level of SP-A mRNA in Group is higher than 英 文摘要 高氧肺損傷新生大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 -A（ SP-A）的 mRNA 和蛋白表達(dá)及布地奈德的干預(yù)作用 VI Group (P0.05), on the 7th day the expression level is lower and on the 14th day the expression level is significantly lower (P0.01). On the 3th day, the expression level of SP-A mRNA in Group is between Group and Group