（農(nóng)藥學(xué)專業(yè)論文）地衣芽孢桿菌l3發(fā)酵工藝優(yōu)化及應(yīng)用研究.pdf

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 摘要 本課題對(duì)地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ) 上，采用p l a c k e t t b u r m a n 設(shè)計(jì)確定了碳源、豆餅粉和k e h p 0 4 顯著影響芽孢形成和 菌體數(shù)量。通過最陡爬坡路徑試驗(yàn)、綜合中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法得出最優(yōu)培 養(yǎng)基組成為：豆餅粉8 9 l 、k 2 h p 0 42 9 l ，碳源3 2 2 0 9 l ，m g s 0 40 5 ：g l ，酵母膏 2 5 l ，地衣芽孢桿菌l 3 的活菌體數(shù)目可以達(dá)到1 0 0 2 x 1 0 8c f u m l ，比初始培養(yǎng)基 發(fā)酵水平提高近一倍。 通過對(duì)搖床的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳接種量為4 ，裝液量為 2 5 m l 2 5 0 m l ，轉(zhuǎn)速2 0 0 r m i n ，消泡劑豆油( 1 0 0 0m g l 一3 0 0 0m g l ) 或泡敵( 1 0 0m g l 3 0 0m g l ) 。1 6 l 發(fā)酵罐的活菌體數(shù)目為9 2 7 x 1 0 8c f u m l ，比初始( 5 2 7 x 1 0 8c f u m l ) 提高了7 0 0 9 。 初步試驗(yàn)表明地衣芽孢桿菌l 3 的發(fā)酵液對(duì)多種作物有一定的增產(chǎn)作用。通過分 別研究l 3 發(fā)酵液、發(fā)酵上清液及菌體，田間對(duì)玉米、棉花增產(chǎn)作用和盆栽對(duì)水稻、 小白菜增產(chǎn)作用，得出地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵液對(duì)玉米、棉花等有顯著的增產(chǎn)作用， 并且主要是菌體起作用，對(duì)旱田作物的效果優(yōu)于水田作物。 關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌l 3 ：發(fā)酵培養(yǎng)基；響應(yīng)面法；田間試驗(yàn) 地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 a b s t r a c t o p t i m i z a t i o no fb a c i l l u sl i c h e n r m i sl 3f e r m e n t a t i o nm e d i u mi nt h i sr e s e a r c h b a s e do nt h e s i n g l e f a c t o rt e s t ，c a r b o ns o u e c e ，s o y b e a np o w d e ra n dk 2 h p 0 4w e r e d e t e r m i n ea sn e c e s s a r yf o rs p o r ef o r m a t i o no fb a c i l l u s 矗c h e n i f o r m i sl 3t h r o u g ht h e p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n t h em e d i u mc o n s i s tw i t hs o y b e a r lf l o u r8 9 | l ，k 2 h p 0 42 9 | l ， c a r b o n3 2 2 0 9 | l ，m g s 0 4q 5 9 | l ，y e a s te x t r a c t2 5 9 | lw e r ed e f i n e da st h eo p t i m u m m e d i u mf o rb a c i l l u s 辦c h e n i f o 刪括l 3g r o w t ha n ds p o r ef o r m a t i o n ，t h r o u g ht h ec e n t e r c o m b i n a t i o no fd e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s f e r m e n t a t i o nw i t ht h eo p t i m u m m e ：d i u ma c h i e v e dl i v eb a c t e r i a10 0 2 x10 8 c f u m l n e a r l yd o u b l et h a nt h a tw i t ht h ei n i t i a l c u l t u r em e d i u m t h r o u g ho p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n s ，t h eb e s ti n o c u l u mo fl i q u i dw a s4 ， 2 5 m l 2 5 0 m l ，s p e e do n2 0 0 r m i n ，u s et h ed e f o a m e ro i l ( f r o m10 0 0m g l t o3 0 0 0m g l ) o rt h eb u b b l ee n e m y ( f r o m l0 0m g | lt o3 0 0m g | l ) t oe l i m i n a t i o nt h eb u b b l e 。o nt h e 16 lf e r m e n t o r , t h en u m b e ro fv i a b l ec e l l s9 2 7 10 8c f u m l i n c r e a s e d7 0 0 9 t h a n t h ei n i t i a l ( 5 2 7x1 0 。c f u | m e ) o n e p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h eb a c i l l u sl i c h e n i f o ，7 竹括c o u l de x c i t et h e g r o w t ho fs o m ec r o p s t h i st o p i c sc a r r i e do u tt h er e s e a r c ho nt h ey i e l di n c r e a s eo n t o m ，c o t t o n ，r i c ea n dc a b b a g eb yt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h ，s u p e m a t a n ta n dp e l l e to fb a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sl 3r e s p e c t i v e l y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho fb a c i l l u s l i c h e n i f o 刪西l 3s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h ep r o d u c t i o no fc o m ，c o t t o ne t c f u r t h e r m o r e ， t h i si sm a i n l yc a u s e db yt h ep e l l e to ft h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho fb a c i l l u sl i c h e n 聊z 括l 3 t h ee f f e c to fu p l a n dc r o p sw e r eb e t t e rt h a np a d d yf i e l dc r o p s k e yw o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n r m i sl 3 ；f e r m e n t a t i o nm e d i u m ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d ； f i e l de x p e r i m e n t 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書 學(xué)位論文 0 ； 如需保密，解密時(shí)間年月日 是否保密 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究 成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已 經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位 或證書而使用過的材料，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。與我一同工作的同志對(duì)本研究 所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意。 研究生張去，凰砷帆神7 年，r 日 學(xué)位論文使用授權(quán)書 本人完全了解華中農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)生必須按照 學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印刷版和電 子版，并提供目錄檢索和閱覽服務(wù)，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 匯編學(xué)位論文。本人同意華中農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué) 位論文的全部或部分內(nèi)容，同時(shí)本人保留在其他媒體發(fā)表論文的權(quán)力。 注：保密學(xué)位論文( 即涉及技術(shù)秘密、商業(yè)秘密或申請(qǐng)專利等潛在需要提交保密的 論文) 在解密后適用于本授權(quán)書。 始趙剛尹鋤鮐桫 簽名日期：沙叼年r 月，r 日 簽名日期： z 移矽年廠月廠廠日 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 1 前言 1 1 芽孢桿菌的研究現(xiàn)狀 1 1 1 芽孢桿菌的特征 芽孢桿菌屬( b a c i l l u s ) 由形態(tài)上呈直或近直的桿狀，產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子，好 氧或者兼性厭氧，革蘭氏陽(yáng)性( 也發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性) ，化能異氧型的細(xì)菌組成。芽 孢桿菌在自然界分布廣泛，能夠產(chǎn)生對(duì)熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有很 強(qiáng)抗性的芽孢，可忍受各種不良環(huán)境，如可以在p h 為2 3 的地方生存，也可以在 溫度高達(dá)8 0 甚至以上的地方生長(zhǎng)，南極寒冷的冰雪中也能見到它們的蹤跡 ( s l e p e c k yr a ，1 9 7 5 ) 。其生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)種群之一。 芽孢桿菌屬中，除了炭疽芽孢桿菌( b a n t h r a e i s ) l 發(fā)動(dòng)物的炭疽熱，蠟樣芽孢桿菌 侶c e r e u s ) 容易造成人體腸胃炎外，其它種類的芽孢桿菌通常是不致病或者是機(jī)會(huì)致 病菌，其中枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為“公認(rèn)安全( g r a s ) ”的細(xì)菌( 南慶賢等， 2 0 0 4 ) ，可產(chǎn)生多種抗生素( 包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類、核酸 類物質(zhì)) 、小分子細(xì)菌素、抗菌蛋白、溶菌酶等，對(duì)多種動(dòng)、植物及人類病原菌起到 很好的抑制作用。 1 1 2 芽孢桿菌的分類 芽孢桿菌的分類依據(jù)幾經(jīng)演變，目前主要根據(jù)芽孢的有無，菌體的形狀，革蘭 氏染色，是否好氧生長(zhǎng)來劃分；其中芽孢的有無、形態(tài)、大小和著生位置是細(xì)菌分 類和鑒定中的重要指標(biāo)。目前，有關(guān)芽孢的生理性質(zhì)、生化組成以及生孢形態(tài)學(xué)和 遺傳學(xué)研究已經(jīng)成為一個(gè)非常重要的領(lǐng)域，其中枯草芽孢桿菌的孢子生成的研究已 經(jīng)成為原核生物分化的最好范例。目前有關(guān)生孢遺傳學(xué)的熱點(diǎn)是進(jìn)一步弄清芽孢形 成的連續(xù)事件過程中的信息傳導(dǎo)及遺傳控制之間的關(guān)系，導(dǎo)致對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束的環(huán)境- 信號(hào)、外界信號(hào)的刺激和內(nèi)部反應(yīng)( 包括細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)水平、細(xì)胞密度和細(xì)胞周期信 i 本課題由武漢天惠生物工程有限公司提供資助 地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 號(hào)) 。對(duì)芽孢形成的誘生是通過雙組分磷酸化途徑完成的。到目前為止，尚不清楚起 到作用的那些環(huán)境因子的本質(zhì)，這些信號(hào)在傳遞過程中所發(fā)生的具體化學(xué)反應(yīng)的細(xì) 節(jié)更有待進(jìn)一步研究。隨著分子生物學(xué)水平的發(fā)展，芽孢桿菌的分類也不再只局限 于形態(tài)和理化性質(zhì)的研究，而轉(zhuǎn)向分子水平的分類，例如許多新分離的芽孢桿菌菌 株就是設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其16 s r r n a ，確定其所屬的種。 1 1 3 芽孢桿菌的研究進(jìn)展 對(duì)于芽孢桿菌研究已經(jīng)有一百多年的歷史，其中的蘇云金芽孢桿菌( b a c i l l u s t h u r i n g i n e n s i s ，b t ) 研究最為廣泛，自1 9 0 1 年發(fā)現(xiàn)首個(gè)亞種以來一個(gè)多世紀(jì)研究從未 停止。目前對(duì)于芽孢桿菌的研究仍然方興未艾，其中很大一部分工作，特別是近些 年來主要集中在特定功能基因的尋找并克隆到需要的物種中或者是通過誘變、基因 工程等手段對(duì)屬于芽孢桿菌屬的生產(chǎn)菌進(jìn)行改造( 王紅革等，1 9 9 7 ；陳瑋等，1 9 9 7 ； 馮清平等，1 9 9 6 ) 。 然而，分子生物學(xué)手段在芽孢桿菌領(lǐng)域的應(yīng)用并不意味著可以忽視自然界天然 野生菌株資源的調(diào)查、分離和收集工作。如果沒有優(yōu)良的出發(fā)菌菌株多樣的原始基 因，分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方法、手段就成為無本之木、無源之水。調(diào)查特定區(qū)域 內(nèi)芽孢桿菌的資源，分離和描述具不同生理特性的菌株，分離、保藏新的菌種、變 種可以不斷補(bǔ)充現(xiàn)有的微生物資源庫(kù)。李榮森等在1 9 8 7 - 、一1 9 8 9 年對(duì)云南、貴州、四 川、陜西等西南4 省的2 6 個(gè)縣土樣中的蘇云金芽孢桿菌和球形芽孢桿菌資源進(jìn)行了 調(diào)查，并初步探討了不同土壤條件下的檢出率，戴順英等則于1 9 9 2 1 9 9 4 年開展1 2 個(gè)省土壤中蘇蕓金芽孢桿菌的資源研究，并且分析了土壤p h 、土壤植被對(duì)蘇蕓金芽 桿菌分布的影響( 李榮森等，1 9 9 0 ；黃洋，1 9 9 6 ；戴順英等，1 9 9 6 ) 。 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對(duì)在工、農(nóng)、醫(yī)等方面有重大應(yīng)用價(jià)值的芽孢桿菌資源的開 發(fā)利用更具有重要意義。通過對(duì)芽孢桿菌屬細(xì)菌的研究，一方面可以積累其分布規(guī) 律資料，為正確制定相應(yīng)的保護(hù)措施提供理論依據(jù)；另一方面也可了解芽孢桿菌與 生態(tài)環(huán)境間的相互關(guān)系，為芽孢桿菌資源的持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)( 郝文英等，1 9 8 3 ； 尹瑞齡等，1 9 9 5 ；李振高等，1 9 9 5 ) 。 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 1 2 地衣芽孢桿菌的應(yīng)用及研究進(jìn)展 地衣芽孢桿菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o t r o i s ) 是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在自然界分布 廣泛，可產(chǎn)生多種抗生物質(zhì)。目前，地衣芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、 飼料加工、環(huán)境污染治理等各個(gè)行業(yè)，是芽孢桿菌中較具應(yīng)用潛力的菌種之一。近 年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)于地衣芽孢桿菌各方面應(yīng)用的報(bào)道不斷增多，受關(guān)注程度日益加強(qiáng)。 1 2 1 農(nóng)業(yè)植物病害防治上的應(yīng)用 地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，對(duì)一些植物病原菌有較好的抑制作用。因 此，將其抗菌物質(zhì)開發(fā)為生物農(nóng)藥，成為研究的熱點(diǎn)。從2 0 世紀(jì)8 0 年代開始，將 地衣芽孢桿菌應(yīng)用于植物病害防治的研究已經(jīng)起步。目前，國(guó)內(nèi)登記的地衣芽孢桿 菌農(nóng)藥制劑為8 0 億個(gè)活芽孢m l 地衣芽孢桿菌水劑，由廣西金燕子農(nóng)藥有限公司 生產(chǎn)，用于防治黃瓜( 保護(hù)地) 霜霉病( 劉剛，2 0 0 7 ) 。 1 2 1 1 抗菌物質(zhì) 地衣芽孢桿菌所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要是一些蛋白類抗菌物質(zhì)，如幾丁質(zhì)酶、抗 菌蛋白、多肽類等。國(guó)外還有報(bào)道指出，地衣芽孢桿菌可產(chǎn)生苯乙酸一類的抗菌物 質(zhì)?？咕镔|(zhì)抑制植物病原菌的途徑有：作用于病原菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜；與膜相 關(guān)的受體蛋白相互作用；作用于能量代謝系統(tǒng)；提高植物的抗病力( 蒙顯英等，2 0 0 4 ) 。 地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)多為肽類，其中以桿菌肽( b a c i t r a c i n ) 為代表。桿 菌肽最早為( j o h n s o ne ta 1 ，19 4 5 ) 從b a c i l l u ss u b t i l i sv a t t r a c y ( m e l e n e y ，19 4 9 改名為 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sv a r t r a c y ) 菌株中分離得到的一種環(huán)狀肽類抗菌物質(zhì)，分子量為 1 4 i ，其水溶液在弱酸性( p h5 7 ) 較穩(wěn)定，在p h 9 0 以上易失活，對(duì)熱敏感，并且 桿菌肽的抑菌活性需要依賴二價(jià)的金屬離子，如z n 2 + ，c 0 2 + ，n i 2 + 和c u 2 + 等，其中以 鋅對(duì)其活性的增強(qiáng)作用最大。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9 種桿菌肽成分，其中以b a c i t r a c i na 活 性最高。 幾丁質(zhì)是植物病原真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的主要成分，因此利用產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物制 備生物殺菌劑和用于培育抗病轉(zhuǎn)基因植物廣受關(guān)注。顧真榮等人報(bào)道了產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的 地衣芽孢桿菌對(duì)油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌均有較好的抑制效果。 地衣芽孢桿菌”發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 通過試驗(yàn)表明，此菌株的抑菌效果與產(chǎn)幾丁質(zhì)酶有關(guān)。對(duì)其它影響抑菌的因子還有待 試驗(yàn)的進(jìn)一步證明( 顧真榮等，2 0 0 1 ) 。 溶菌酶( l y s o z y m e ) 作用于細(xì)菌細(xì)胞壁n 乙酰胞壁酸( n a m ) 與n 乙酰葡萄 糖胺( n a g ) 之間的b 1 ，4 糖甘鍵。k i m 等( 1 9 9 9 ) 利用鏈球菌齒斑糖加富的方 法從土壤中分離到的一株芽孢桿菌y s 1 0 0 5 ，通過甲醇沉淀、離子交換色譜、凝膠 過濾色譜和羥基磷灰石色譜等從該菌株中分離到的兩種溶菌酶l 2 7 和l 4 5 ，對(duì)齲齒 鏈球菌( s t r e p t o c o c c ic a r i o g e n i c ) 有強(qiáng)烈的溶菌作用，分子量分別為2 7 k d 和4 5 k d ， 其溶菌最適p h 為8 ，最適溫度為3 7 。這兩種溶菌酶能消解變異鏈球菌肽聚糖中 的肽鍵。 k i m 等從發(fā)酵的大豆中分離到一株拮抗地衣芽孢桿菌b 6 5 1 。通過分離純化得 到該菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)，經(jīng)e i m s 和n m r 的分析為苯乙酸( 分子式為c 8 h 8 0 2 ) 。 該物質(zhì)對(duì)酵母和多種細(xì)菌如s t a p h ) ，l o c o c c u sa u r e u s 、e s c h e r i c h i ac o l i 和c a n d i d as p p 有拮抗作用( k i me ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 2 防治植物病害 目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于地衣芽孢桿菌應(yīng)用于植物病害防治的報(bào)道比較多。綜合大量文 獻(xiàn)可以看出，地衣芽孢桿菌對(duì)植物的真菌性病害有較好的抑制效果( 見表1 ) 。黃高 ( 2 0 0 7 ，專利號(hào)c n l 9 3 0 9 9 1 ) 將地衣芽孢桿菌與一種或二種的生物殺菌劑或化學(xué)殺 菌劑( 井岡霉素、中生菌素、多抗霉素、寧南霉素、春雷霉素、木霉菌、霜霉威、 烯酰嗎啉、多菌靈、福美雙、噫霉靈、敵克松、嘧肽霉素、水合霉素、氨基寡糖素、 嘧菌酯、農(nóng)抗1 2 0 、多粘類芽孢桿菌、熒光假單胞桿菌、枯草芽孢桿菌、臘質(zhì)芽孢 桿菌等) 按一定比例混配成常規(guī)劑型的生物農(nóng)藥使用，對(duì)于防治喙孢屬、子囊菌屬、 核腔菌屬、根霉屬、鐮刀菌屬、疫霉屬和霜霉屬病菌具有很好效果。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 院的郭榮君等發(fā)現(xiàn)了一株用于防治大豆胞囊線蟲病和鐮刀菌引起的根腐病的地衣芽 孢桿菌( c g m c cn o 1 0 3 5 ) ，田間試驗(yàn)表明，其不僅可以防治大豆胞囊線蟲病和鐮 刀菌引起的根腐病，同時(shí)調(diào)節(jié)根際微生物生態(tài)區(qū)系，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有增產(chǎn)效果 ( 郭榮君等，2 0 0 5 ，專利號(hào)c n l 6 2 1 5 1 4 ) 。楊惠芳等以地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌，通 過微生物發(fā)酵的方法制得菌體發(fā)酵液( “華能2 0 1 ”) ，對(duì)水稻白葉枯病、黃瓜枯萎病、 4 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 黃瓜霜霉病、馬鈴薯瘟病和棉花枯萎病等有明顯防治效果，并對(duì)有害的蚜蟲、紅蜘 蛛和螨蟲有殺滅作用( 楊惠芳等，1 9 9 4 ，專利號(hào)c n l 0 9 0 1 3 0 ) 。 1 9 9 8 年方敦煌等開始篩選利用土壤拮抗細(xì)菌防治煙草黑脛病的研究，最后分離 出對(duì)黑脛病菌有較好抑制效果的地衣芽孢桿菌g p l 3 ，通過兩年的大田示范試驗(yàn)表 明，地衣芽孢桿菌g p l 3 的效果較好，防效穩(wěn)定保持在5 0 - - 一6 0 ( 方敦煌等，2 0 0 3 ) 。 但是關(guān)于g p l 3 菌株的抑菌機(jī)理，還未見進(jìn)一步的報(bào)道。 在所見的文獻(xiàn)中，對(duì)地衣芽孢桿菌w 1 0 菌株研究的較為深入：童蘊(yùn)慧等首次報(bào) 道w 1 0 菌株能誘導(dǎo)番茄植株對(duì)灰霉病的系統(tǒng)抗性。通過對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)一步研究 后，表明w 1 0 分泌的某些物質(zhì)或一些次生代謝物具有誘導(dǎo)抗性的活性( 童蘊(yùn)慧等， 2 0 0 4 ) 。但是，這類物質(zhì)還有待進(jìn)一步鑒定。唐麗娟等報(bào)道，地衣芽孢桿菌w 1 0 在 番茄葉面的定殖能力很強(qiáng)，與灰霉病菌發(fā)生營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)灰霉病菌有較好的 抑制作用( 唐麗娟等，2 0 0 5 ) 。而且，在研究中發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌w 1 0 所產(chǎn)生的 抗菌蛋白對(duì)灰葡萄孢也有較強(qiáng)的抑制作用。紀(jì)兆林等人報(bào)道了地衣芽孢桿菌w 1 0 對(duì) 蘋果輪紋病菌、柑桔炭疽病菌和青霉病菌具有明顯的抑制作用( 紀(jì)兆林等，2 0 0 3 ) 。 近幾年，隨著開發(fā)生物菌劑的熱潮的高漲，將地衣芽孢桿菌作為拮抗菌來防治 植物病害的相關(guān)報(bào)道也日益增多。在對(duì)棉花枯萎、黃萎病菌拮抗細(xì)菌的篩選中，齊 東梅等報(bào)道，有一株地衣芽孢桿菌，產(chǎn)生的抗菌蛋白對(duì)棉花枯萎、黃萎病原菌有較 明顯的抑制作用( 齊東梅等，2 0 0 5 ) 。 彭化賢等從水稻作物根際分離篩選得到一株地衣芽孢桿菌，其對(duì)稻瘟病病菌具 有較強(qiáng)的抑制能力，經(jīng)測(cè)定該菌的拮抗性，發(fā)現(xiàn)較穩(wěn)定；通過連續(xù)兩年的田間防病 效果測(cè)試，防效一直在5 0 以上( 彭化賢等，2 0 0 2 ) 。 a s i d 等人從不同區(qū)域采集的辣椒植株根際中分離得到5 0 0 株細(xì)菌。經(jīng)過生物 活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有1 0 個(gè)菌株對(duì)辣椒根腐病和辣椒葉斑病均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，其 中h s 9 3 、l s 2 3 4 、l s 6 7 4 、l s 5 2 3 等4 個(gè)菌株的抑制率可達(dá)到5 0 - - 一8 0 。經(jīng)鑒定4 個(gè)菌株均為地衣芽孢桿菌。通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用這4 個(gè)菌株的菌懸液浸泡辣椒種 子，可降低根腐病和葉斑病的發(fā)病率，提高辣椒幼苗的成活率( a s i de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 a s i da h m e d 等人通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：地衣芽孢桿菌可增強(qiáng)角素( s i g m a ) 抑制辣椒 根腐病的活性。由此表明，地衣芽孢桿菌對(duì)某些藥劑具有一定增效作用，但是具體 起增效作用的物質(zhì)及其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究( a s i da h m e de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 5 地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 表1 地衣芽孢桿菌抑制的植物病原菌 t a b l e l ：t h e c o n t r o l l i n gp l a n tp a t h o g e n sb yb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 另外，開發(fā)地衣芽孢桿菌應(yīng)用于新型領(lǐng)域的研究也不可忽視。如在皮革制品中， 多種真菌可生長(zhǎng)繁殖，主要有：白曲霉、擬青霉、黃綠青霉、黃曲霉、產(chǎn)黃青霉和 黑曲霉等，其中，部分真菌的生長(zhǎng)受到地衣芽孢桿菌的抑制。趙婷等報(bào)道，地衣芽 6 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 孢桿菌對(duì)白曲霉、黑曲霉、擬青霉均有較好的抑制作用( 趙婷等，2 0 0 5 ) 。目前應(yīng)用 地衣芽孢桿菌作為皮革防霉劑僅做了初步的研究，這一領(lǐng)域也為我們對(duì)地衣芽孢桿 菌的應(yīng)用研究提供了空間。 1 2 1 3 刺激作物生長(zhǎng) 北京大學(xué)1 9 9 4 年公布了一項(xiàng)關(guān)于一種高效花生增產(chǎn)劑及其制備方法，此增產(chǎn)劑 包括：芽孢桿菌、花生根瘤菌分別發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液、多種植物微量元素、植物細(xì) 胞分裂素和吸附劑，如腐植酸或其鹽等。此項(xiàng)發(fā)明的花生增產(chǎn)劑具有防治花生線蟲 病害、促進(jìn)苗期生長(zhǎng)、提高抗逆力和花生增產(chǎn)的綜合效果。 神州漢邦( 北京) 生物技術(shù)有限公司2 0 0 4 年公布了一項(xiàng)關(guān)于地衣芽孢桿菌產(chǎn)玉 米素、異戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的專利。該發(fā)明提供了用于產(chǎn) 生玉米素、異戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷的地衣芽孢桿菌c g m c cn o 。1 0 0 9 ；含有該 地衣芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；以及該植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)方法， 該發(fā)明還提供了上述植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑用于農(nóng)作物的用途。 劉偉從地衣芽孢桿菌中分離提取了細(xì)胞分裂素，發(fā)酵液的含素量為3 8 p g m l ， 并對(duì)含有細(xì)胞分裂素的發(fā)酵液在黃瓜上進(jìn)行田間應(yīng)用試驗(yàn)，結(jié)果表明，該發(fā)酵液對(duì) 黃瓜的產(chǎn)量和抗病性均有促進(jìn)作用，在黃瓜上的應(yīng)用具有一定的可行性( 劉偉， 2 0 0 5 ) 。 1 2 2 飼料加工上的應(yīng)用 根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的結(jié)果，允許飼用的芽孢桿菌菌種有枯草芽孢桿菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、納豆芽孢桿菌( b a c i l l u sn a t t o ) 、蠟樣芽孢桿菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、凝 結(jié)芽孢桿菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 、緩慢芽孢桿菌( b a c i l l u sl e n t u s ) 、地衣芽孢桿菌、短 小芽孢桿菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 等1 2 種。芽孢桿菌在制劑中以內(nèi)生孢子形式存在，孢 子進(jìn)入動(dòng)物腸道后，產(chǎn)生具有拮抗腸道致病菌的多種物質(zhì)：同時(shí)通過生物奪氧消耗 腸道內(nèi)的氧氣造成厭氧環(huán)境，腸道原籍優(yōu)勢(shì)菌大多屬厭氧菌，而有害菌和外來菌多 為需氧菌，從而達(dá)到維持腸道生態(tài)平衡的目的。 近年來，地衣芽孢桿菌在飼料工業(yè)上應(yīng)用的研究逐漸增多。牛天貴等發(fā)現(xiàn)，芽 孢桿菌的發(fā)酵上清液能降低蛋黃中的膽固醇含量，且膽固醇隨著發(fā)酵液添加量的增 7 地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 加而減少。b 祥斌等通過在肉雞日糧中添加沸石粉、低聚木糖和地衣芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)此配方能提高肉雞生產(chǎn)性能，且效果優(yōu)于沸石粉、低聚木糖單獨(dú)添加或二者聯(lián) 合添加( b 祥斌等，2 0 0 6 ) 。梅安生發(fā)明了含有地衣芽孢桿菌等益生菌的優(yōu)質(zhì)肉雞專 用綠色飼料添加劑，解決了雞體內(nèi)因某種細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性而降低了免疫力，雞肉中 抗生素殘留造成的食品安全、危害人體健康等問題( 梅安生，2 0 0 5 ，專利號(hào)c n l 6 1 5 7 2 6 ) 。地衣芽孢桿菌有望成為雞飼料的良好添加劑。 周振峰報(bào)道，在奶牛飼料中添加地衣芽孢桿菌制劑能增強(qiáng)奶牛抵抗熱應(yīng)激的能 力，并可起到防病、抗病的作用。其機(jī)理是由于口服芽孢桿菌后，其作用于腸道集 合淋巴結(jié)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，或通過調(diào)整動(dòng)物的微生物群( 尤其是增加雙歧桿菌菌群 數(shù)量) ，從而間接地發(fā)揮免疫賦活的作用，提高機(jī)體的局部或全部防御功能( 周振峰， 2 0 0 6 ) 。劉波等通過在異育銀鯽飼料中添加地衣芽孢桿菌進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，可促 進(jìn)魚體生長(zhǎng)( 劉波等，2 0 0 5 ) 。劉文斌等人通過地衣芽孢桿菌分別與低聚木糖、復(fù)合 酶制劑適量混合后加入異育銀鯽飼料中，不僅可以提供飼料的利用率，促進(jìn)腸道有 益微生物的生長(zhǎng)和抑制有害微生物，并且能提高肝胰臟蛋白酶m r n a 表達(dá)量和腸道 酶活性( 劉文斌等，2 0 0 7 ) 。譚北平等發(fā)明了一種對(duì)蝦用復(fù)合微生態(tài)制劑( 含地衣芽 孢桿菌，5 1 0 億c f u g ) ，飼料中添加量?jī)H為0 1 0 2 ，但明顯增強(qiáng)對(duì)蝦的機(jī)體免 疫力，提高成活率；并顯著提高對(duì)蝦消化吸收率，促進(jìn)生長(zhǎng)，降低飼料系數(shù)( 譚北 平等，2 0 0 5 ，專利號(hào)c n l 6 2 0 8 9 2 ) 。廣東昆蟲研究所韓日疇等發(fā)明的一種由地衣芽 孢桿菌干粉等菌體混合組成益生素飼料添加劑，添加到飼料中，能顯著提高菌體在 密閉包裝中的存活率，加強(qiáng)添加劑和飼料間的粘合作用，提高了益生素的利用率， 并提高動(dòng)物免疫能力，促進(jìn)動(dòng)物的新陳代謝，提高動(dòng)物機(jī)體的抗病能力，改善動(dòng)物 的消化機(jī)能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，并明顯改善動(dòng)物的肉質(zhì)( 韓日疇等，2 0 0 5 ，專利號(hào) c n l 6 3 1 2 0 5 ) 。 還有報(bào)道指出( 曹煜成等，2 0 0 5 ) ，地衣芽孢桿菌能分泌高活性的胞外酶系，可 將水體中的有機(jī)殘余物迅速降解為無機(jī)物，有效地促進(jìn)養(yǎng)殖水體的生態(tài)良性循環(huán)。 因此，將地衣芽孢桿菌作為魚飼料添加劑，不僅可以促進(jìn)魚體生長(zhǎng)，而且益于養(yǎng)殖 水體的保護(hù)。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 1 2 3 環(huán)境污染治理上的應(yīng)用 丁海濤等在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌篩選實(shí)驗(yàn)中，篩選出地衣芽孢桿菌 q w 5 所產(chǎn)生的特異性酶可與氰戊菊酯羧酸酯鍵斷裂的相應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生作用，加速其分 解。通過田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，q w 5 菌對(duì)于田間擬除蟲菊酯殘留，5 天內(nèi)的去除率可 達(dá)9 0 以上，效果好于實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)降解擬除蟲菊酯的效果。其原因可能是田間 試驗(yàn)條件下降解菌與土著微生物的協(xié)同作用，有助于降解菌更有效地降解農(nóng)藥殘留， 直到最后礦化( 丁海濤等，2 0 0 3 ) 。 周鳴研究采用地衣芽孢桿菌死菌體吸附水中的c r 6 + ，其研究結(jié)果與報(bào)道的同類 研究相比較。地衣芽孢桿菌死菌體對(duì)c r 6 + 具有更好的吸附效果，在優(yōu)化條件下，即 溫度為5 0 ，搖床轉(zhuǎn)速1 4 0r m i n ，溶液p h2 5 ，吸附時(shí)間2 h ，菌體濃度1 l ，c r 6 + 起始濃度3 0 0m g l ，菌體對(duì)c r 6 + 有最大吸附量6 0 5m g g ( 周鳴，2 0 0 6 ) 。胡洪波等 人報(bào)道了利用微生物吸附回收金、銀、鉑、鉛等貴金屬( 胡洪波等，2 0 0 2 ) 。儲(chǔ)衛(wèi)華 以地衣芽孢桿菌( 質(zhì)量百分比3 0 - - 4 0 ) 等菌體發(fā)明的微生態(tài)制劑，在水體中很 快能形成優(yōu)勢(shì)菌群，并能產(chǎn)生高活性生物酶，加速殘餌和動(dòng)物糞便的分解，同時(shí)能 產(chǎn)生抗生素樣物質(zhì)，抑致有害菌的生長(zhǎng)，減少疾病的發(fā)生，確保綠色水產(chǎn)品的生產(chǎn) ( 儲(chǔ)衛(wèi)華，2 0 0 8 ，專利號(hào)c n l 0 1 2 6 9 8 8 4 ) 。劉曉風(fēng)等利用地衣芽孢桿菌( c g m c c n o 1 8 1 3 ) 和其它幾種細(xì)菌混配而成的復(fù)合菌劑，顯著縮短了處理有機(jī)固體廢物時(shí)間， 提高原料利用率和處理效果及其生成物產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)有機(jī)固體廢物的治理有很好 的效果，且無任何環(huán)境污染( 劉曉風(fēng)等，2 0 0 7 ，專利號(hào)c n l 8 8 8 0 4 5 ) 。 1 2 4 做為生物表面活性劑的應(yīng)用 微生物在一定條件下培養(yǎng)時(shí)，其代謝過程中分泌的一些具有一定表面活性、集 親水基和疏水基結(jié)構(gòu)于一分子內(nèi)的兩親化合物，稱為生物表面活性劑。y a k i m o v 等 ( 1 9 9 5 ) 報(bào)道了一株地衣芽孢桿菌b a s 5 0 能產(chǎn)生一種脂肽類生物表面活性劑。張翠 竹等報(bào)道，地衣芽孢桿菌n k x 1 可產(chǎn)生一種脂肽類表面活性劑，其疏水基半分子 為脂肪酸類，親水基半分子是一個(gè)酸性的多肽，可耐受高溫和高濃度鹽( 尤其是高鈣 離子) ，p h 適應(yīng)范圍廣，是一種具有應(yīng)用潛力的生物表面活性劑。其脂肪酸部分的 組成國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，是一種新的脂肽類生物表面活性劑，在原油增采和輸送方面 9 地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 極具開發(fā)應(yīng)用前景( 張翠竹等，2 0 0 0 ) 。尤其是它特有的理化性質(zhì)可以適應(yīng)特殊而復(fù) 雜的油藏環(huán)境，這是化學(xué)表面活性劑所無法比擬的。 1 2 5 醫(yī)藥上的應(yīng)用 國(guó)內(nèi)目前登記的地衣芽孢桿菌醫(yī)藥商品名為“整腸生”，是以地衣芽孢桿菌無毒 菌株b l 2 活體菌株制成的膠囊，主要用于治療一些腸道疾病。其作用機(jī)制與傳統(tǒng)的 化學(xué)藥物、抗生素、中藥相比較完全不同。 整腸生主要是通過以菌治菌的方法，地衣芽孢桿菌口服以后以活菌形式進(jìn)入腸 道內(nèi)，在生長(zhǎng)代謝中能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，如短桿菌肽、枯草桿菌素、制霉菌 素和頭孢菌素c 等，可抑制腸道中的致病菌。因其是兼性厭氧菌，具有生物奪氧的 作用，可促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)而使腸道中微生態(tài)環(huán)境達(dá)到平衡，使腹瀉等癥狀緩解或消 失( 郭貴海和王崇文，2 0 0 2 ) 。地衣芽孢桿菌尚有促進(jìn)巨嗜細(xì)胞非特異性吞噬作用， 由于該菌不是腸道固有細(xì)菌，不會(huì)在腸道中長(zhǎng)期定植，一般在停藥后1 0 天即全部排 出體外，僅起治療作用而不會(huì)造成遠(yuǎn)期不良反應(yīng)。無錫市東亭醫(yī)院在2 0 0 0 年5 月 2 0 0 3 年8 月對(duì)整腸生膠囊進(jìn)行臨床試驗(yàn)，應(yīng)用整腸生治療頑固性腹瀉3 8 例，經(jīng)過 觀察病例在服用中未發(fā)現(xiàn)有任何不良反應(yīng)，證實(shí)了整腸生膠囊的安全可靠性( 袁錦 平，2 0 0 5 ) 。其后又在北京協(xié)和醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院和沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬 中心醫(yī)院進(jìn)行了地衣芽孢桿菌顆粒劑的試驗(yàn)，臨床試驗(yàn)證明地衣芽孢桿菌顆粒劑治 療急性感染性腹瀉、急性細(xì)菌性痢疾非常有效、而且安全( 翟少華，2 0 0 5 ) 。吳鐵林 利用地衣芽孢桿菌新菌株( 保藏號(hào)為c g m c cn o 0 2 9 8 ) 制備的微生態(tài)制劑，對(duì)急、 慢性腸炎和輕型痢疾以及細(xì)菌性陰道病( b v ) 有較好的療效( 吳鐵林，1 9 9 8 ， c n 】2 0 2 5 2 2 ) 。 1 3 地衣芽孢桿菌的發(fā)酵研究 抗生素作為飼料添加劑，在畜禽防疫方面雖起到積極的作用，但近1 0 多年來， 國(guó)外飼料業(yè)和飼養(yǎng)業(yè)中很多人反對(duì)用抗菌素做飼料添加。鑒于此，國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者 對(duì)研究開發(fā)微生態(tài)制劑用于畜禽養(yǎng)殖日趨關(guān)注，從而也促進(jìn)了這一產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展。 國(guó)內(nèi)用于制作微生態(tài)添加劑的主要是一些芽孢菌類和乳酸菌類，但長(zhǎng)期以來生產(chǎn)成 本一直居高不下。為此許多學(xué)者對(duì)地衣芽孢菌發(fā)酵過程進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)以求提高 1 0 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。 地衣芽孢桿菌的生產(chǎn)方法按發(fā)酵方式可分為固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種形式。目 前國(guó)內(nèi)外要采用液體發(fā)酵方式生產(chǎn)地衣芽孢桿菌。 1 3 1 地衣芽孢桿菌產(chǎn)品的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部于2 0 0 8 年3 月1 日正式實(shí)旌了飼料微生物添加劑 地衣芽孢桿菌( n y 廠r1 4 6 1 2 0 0 7 ) 國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)規(guī)定，產(chǎn)品中地衣芽孢 桿菌活菌體數(shù)應(yīng)1 1 0 9 c f u m l 或g 。 1 3 2 固體發(fā)酵 固體發(fā)酵是微生物生長(zhǎng)在潮濕不溶于水的基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，在固體發(fā)酵過程中不 含任何自由水，隨著自由水的增加，固體發(fā)酵范圍延伸至黏稠發(fā)酵( s l u r r y f e r m e n t a t i o n ) 以及固體顆粒懸浮發(fā)酵。 高濃度、高粘度的液體深層發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代發(fā)酵工程研究的前沿，而固體發(fā)酵 就是高濃度、高粘度發(fā)酵技術(shù)的極限。固體發(fā)酵可克服傳統(tǒng)液體發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵技 術(shù)要求高，設(shè)備投資大，商品制劑成本高，而且在后處理過程中芽胞損失缺點(diǎn)。美 國(guó)的m e c h al a s 首先取得了固體發(fā)酵專利權(quán)，但該專利所要求的設(shè)備和發(fā)酵條件較 高，因此很難在發(fā)展中國(guó)家推廣，而且發(fā)酵溫度難以控制，雜菌污染嚴(yán)重，由于堆 料過厚，部分固體培養(yǎng)基通氣不良。我國(guó)七十年代廣泛推行的固體發(fā)酵工藝，存在 發(fā)酵前期料溫升不起來；發(fā)酵周期長(zhǎng)，霉菌污染嚴(yán)重；培養(yǎng)基的濕度難以控制；降 溫措施用工多，勞動(dòng)強(qiáng)度大等問題，因此固體發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量差。固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基 呈固態(tài)，無可流動(dòng)的自由水，正因?yàn)槿绱耍荒芟癜l(fā)酵液那樣用流體管道輸送，也 不能像液體深層發(fā)酵反應(yīng)器那樣容易地由機(jī)械或氣流攪拌使發(fā)酵培養(yǎng)基混合，強(qiáng)化 傳質(zhì)和傳熱，所以至今難以做出嚴(yán)格意義上的大規(guī)模純種培養(yǎng)，而被擋在現(xiàn)代發(fā)酵 工業(yè)的大門之外( 歐陽(yáng)俊，1 9 9 9 ) 。 谷春濤等分離到一株飼用地衣芽孢桿菌t s 0 1 ，并研究了該菌的固態(tài)發(fā)酵情況， 菌體濃度可達(dá)9 1 5 x 1 0 9c f u g 鮮曲，芽孢濃度可達(dá)7 5 0 x 1 0 9c f u g 鮮曲，芽孢形成 率在8 0 以上。雖然在實(shí)驗(yàn)室條件下的固體發(fā)酵也取得了不錯(cuò)的效果，但是就工業(yè) 地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 生產(chǎn)來看仍然難以規(guī)?；M(jìn)行( 谷春濤等，2 0 0 4 ) 。 1 3 3 液體深層發(fā)酵 自從地衣芽胞桿菌被分離以來，該菌在遺傳工程技術(shù)、應(yīng)用技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)展較 快，但相比之下液體深層發(fā)酵技術(shù)方面的發(fā)展則相對(duì)緩慢。發(fā)酵技術(shù)的改造主要涉 及到菌種的選育和改造、培養(yǎng)基的優(yōu)化、發(fā)酵工藝的優(yōu)化和發(fā)酵控制等方面。目前， 國(guó)內(nèi)對(duì)地衣芽孢桿菌發(fā)酵技術(shù)研究主要集中在培養(yǎng)基的優(yōu)化和發(fā)酵工藝的控制方 面。 胡尚勤等以葡萄糖為碳源，多種氨基酸為氮源，最佳c n 為4 4 5 ：1 并在滿足該 菌對(duì)維生素h 和必須氨基酸的需要以及主要無機(jī)鹽的需要時(shí)，其菌數(shù)最高為 ( 3 5 5 6 7 ) 1 0 “c f u m l ，可使菌數(shù)是對(duì)照( 3 3 x 1 0 1 c f u m l ) i 均2 1 3 5 倍( 胡尚勤等， 2 0 0 0 ) 。吳晟曼等先采用單因素，后采用復(fù)合因素的方式，確定碳源和氮源，然后 采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)分析法對(duì)地衣芽孢桿菌n g 5 2 l l 的培養(yǎng)基主要成分進(jìn)行分析和優(yōu) 化，根據(jù)預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵水平的配比，調(diào)整培養(yǎng)基，使發(fā)酵液中菌體生長(zhǎng)量大大提高， 由原來0 3 5 x 1 0 8 c f u m l 提高到1 2 x 1 0 8 c f u m l ( 吳晟曼，2 0 0 5 ) 。谷春濤等以葡萄 糖、豆餅粉和玉米漿為培養(yǎng)基，對(duì)地衣芽孢桿菌t s o l 在1 0 0 l 發(fā)酵罐中進(jìn)行了培養(yǎng)， 通過調(diào)整通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速，接種量6 情況下，菌數(shù)為9 2 5 x 1 0 9 c f u m l ( 谷春濤 等，2 0 0 3 ) 。崔京春等通過對(duì)培養(yǎng)基配方的調(diào)整和發(fā)酵培養(yǎng)過程中對(duì)發(fā)酵工藝的調(diào) 整發(fā)酵過程中控鋅j l j p h 值，3 2 h 發(fā)酵以后，芽孢形成率達(dá)至 j 9 5 ，活菌體數(shù)3 x 1 0 9 c f u m u 崔京春等，2 0 0 4 ) 。 1 4 本課題的研究目的、意義 地衣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性微生物，廣泛分布于土壤和其它自然環(huán)境，具 有耐熱、酶系豐富，產(chǎn)酶量高，安全等諸多優(yōu)良特性，被認(rèn)為是較理想的工業(yè)生產(chǎn)菌 株。已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)高溫淀粉酶、植酸酶等，具有良好的應(yīng)用前景。地衣芽 孢桿菌有很強(qiáng)的生命活力、具備產(chǎn)生各種酶的能力，而且有耐高溫、耐酸堿、耐擠 壓等特性，進(jìn)入2 l 世紀(jì)以來，關(guān)于地衣芽孢桿菌在飼料工業(yè)上的應(yīng)用研究很多，在 醫(yī)藥、畜牧、水產(chǎn)業(yè)等中都有廣泛的應(yīng)用，地衣芽孢桿菌包含在農(nóng)業(yè)部允許的添加 1 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 劑菌種目錄中。但是從整體上來看，目前地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的活菌數(shù)和芽孢率 還較低；而且，不同的菌株的發(fā)酵結(jié)果差別很大。 地衣芽孢桿菌l 3 是從上千株地衣芽孢桿菌中篩選得到的具有強(qiáng)抗菌活性的菌 株，初步研究表明該菌株對(duì)玉米小斑病菌、小麥赤霉病菌、萵苣菌核病菌等1 7 種植 物病害有較強(qiáng)的抑制作用。菌體的發(fā)酵液可以促使種子的萌發(fā)，提高發(fā)芽率，還可 以促進(jìn)胚芽和胚根的生長(zhǎng)。另外，該菌株還具有強(qiáng)的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，顯示出 良好的應(yīng)用前景。 本課題擬對(duì)地衣芽孢菌l 3 發(fā)酵配方進(jìn)行逐步優(yōu)化，摸索出最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配 方和發(fā)酵條件；降低其生產(chǎn)成本，為產(chǎn)品廣泛在農(nóng)牧業(yè)推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 另外，國(guó)內(nèi)外就地衣芽孢桿菌對(duì)作物增產(chǎn)作用的研究的文獻(xiàn)報(bào)道還不是很多。 而且，到底是地衣芽孢桿菌菌體芽孢對(duì)作物生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用還是發(fā)酵過程中產(chǎn) 生的促進(jìn)生長(zhǎng)的物質(zhì)所起的作用，肖有爭(zhēng)論。本課題將通過田間增產(chǎn)試驗(yàn)在該方面 做進(jìn)一步探索。 1 3 地衣芽孢桿菌l 3 發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用研究 2 材料與方法 2 1 材料 2 1 1 供試材料 地衣芽孢桿菌l 3 ( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sl 3 ) ，武漢聯(lián)華實(shí)驗(yàn)室分離，武漢天惠生 物工程有限公司科研所保存。 病原真菌：玉米小斑病菌( b i p o l a r i sm a y d i s ) ，武漢天惠生物工程有限公司科研所 提供和保藏。 試驗(yàn)作物：玉米，品種為華甜玉3 號(hào)。 水稻，品種為華早糯1 0 0 3 。 棉花，品種為華抗雜3 9 。 小白菜，品種為華良5 號(hào)。 2 1 2 培養(yǎng)基 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯2 0 0 9 ，蔗糖2 0 9 ，瓊脂1 5 9 ，蒸餾水1 0 0 0 m l ， p h 自然 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 o g ，蛋白胨l o 0 9 ，n a c l5 0 9 ，瓊脂1 5 9 ，蒸餾 水1 0 0 0 m l ，p n7 2 7 4 種子培養(yǎng)基：葡萄糖2 0 9 ，豆餅粉2 0 9 ，k 2 h p 0 42 9 ，m g s 0 4o 5 9 ，蒸餾水10 0 0 m l ， p h7 0 l 號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉3 0 9 ，魚粉1 2 9 ，玉米淀粉1 5 9 ，酵母粉5 9 ，m g s 0 43 5 9 ， c a c 0 33 0 9 ，n a c l2 5 9 ，k c l lg ，k 2 h p 0 4 0 3 9 ，n a h c 0 3 o 15 9 ，蒸餾水10 0 0 m l ， p h7 5 。 2 號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 0 9 ，豆餅粉2 0 9 ，酵母膏2 5 9 ，k 2 h p 0 42 9 ，m g s 0 40 5 9 ， 蒸餾水1 0 0 0 m l ，p h7 0 。 1 4 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 9 屆碩士畢業(yè)論文 2 1 4 供試試劑 2 1 4 1d n s 溶液 甲液：溶解6 9 9 結(jié)晶酚于1 5 2 m l l 0 的n a o h 溶液中，并用水稀釋至6 9 m l ， 在此溶液中加6 9 9 亞硫酸鈉； 乙液：稱取2 5 5 9 酒石酸甲鈉溶到3 0 0 m l l o 的n a o h 溶液中，再加入8 8 0 m l l 的3 ，5 二硝基水楊酸溶液； 將甲、乙溶液混合，即得到黃色試劑，儲(chǔ)存于棕色瓶中，室溫下放置7 1 0 d 后 方可使用。 2 1 4 2 硝普鈉 稱取0 5 9 亞硝基鐵氰化鈉，用去離子水定容至1 0 0 m l ，保存于棕色瓶中，保存 時(shí)間不超過一個(gè)月。 2 1 4 3 堿液 2 0 9 的檸檬酸鈉加上l g 的n a o h ，用去離子水定容至1 0 0 m l 。 2 1 5 主要儀器 p h s 3 c 型精密酸度計(jì) h q l l5 0 b 恒溫冷