（微生物學專業(yè)論文）藍藻光合系統(tǒng)電子傳遞蛋白（fd）突變體的初步研究.pdf

摘要 藍藻的鐵氧還蛋白( f e r r e d o x i n ，f d ) 是一個以 2 f e - 2 s 為輔基的小分子可 溶性蛋白，分布于類囊體膜外。在光反應過程中，f d 作為光反應終端的電子傳 遞體，介導p s i 與c o ：固定、硝酸鹽、硫酸鹽和谷氨酸鹽等代謝途徑聞的電子傳 遞以及光合循環(huán)磷酸化中的電子回流。真核藻類和非固氮藍藻的類囊體膜和氫酶 耦聯(lián)光解水產(chǎn)氫機制研究表明，f d 是光系統(tǒng)與氫酶耦聯(lián)問的重要電子傳遞成分， 參與體內(nèi)光解水過程的h 。代謝。因此，在藍藻太陽能光解水制氫系統(tǒng)研究中， f d 是一個重要的功能蛋白靶點。 本研究以聚球藻p c c 7 9 4 2 作為受體，構(gòu)建了同源雙臂整合載體p u c h a t h f 和p u c f s 。利用內(nèi)源平臺雙交換原理，將質(zhì)粒p u c h a t h f 上攜帶的集胞藻p c c 6 8 0 3 p e t f 外源表達盒序列和抗性篩選標記潮霉素b 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因( h y g r o m y c i nb p h ot r a n s f e r a s e ，劫f ) 外源序列( 含c a m v 3 5 s 啟動子，h p t 編碼框，c a m v3 u t a p o l y a 終止子) 定點插入到受體藻細胞染色體h c o ，高親和轉(zhuǎn)運蛋白操縱子基因 c m p a b c d + 1 5 0 8 - - + 1 5 0 9 區(qū)( 衄弗基因的起始編碼框為+ 1 ) 位點上。并在此基礎上 以質(zhì)粒p u c f s 介導聚球藻p c c 7 9 4 2 如以的插入失活，獲得了具有潮霉素b 和鏈 霉素雙重抗性的突變藻株p f l 。以此初步建立了聚球藻p c c 7 9 4 2 抬以功能性基 因突變研究平臺。 利用聚球藻p c c 7 9 4 2 矗以功能性基因突變平臺系統(tǒng)，迸一步對集胞藻 p c c 6 8 0 3p e t f 進行突變，獲得了突變藻p f n 。和p f 一矗協(xié)廄并在p f n 。和p f 一肪止 生理特性研究基礎上分析了基因突變對基因功能造成的影響。結(jié)果表明，與野生 藻相比，p f n 蚺具有耐酸性條件下生長的特性，而p f 一脅柑在起始p h5 p h 兒 的b g 一1 l 培養(yǎng)基中生長明顯緩慢，藻體容易黃化死亡。野生藻、p f l 、p f n 。和 p f 一肋艇光照放氫活性比較實驗，暗示了f d 突變體電子傳遞功能上的改變將可 能導致藻體的光照放氫特性提高。 本研究所構(gòu)建的聚球藻p c c 7 9 4 2 突變株p f l 、p f n 船和p f 一肋癌將為進一 步研究高效介導光系統(tǒng)一氫酶耦聯(lián)產(chǎn)氫的電子傳遞系統(tǒng)奠定基礎。 關鍵詞：聚球藻p c c 7 9 4 2 ； 2 f e 一2 s 鐵氧還蛋白：基因突變 a b s t r a c t t h e 2 f e 一2 s f e r r e d o x i n ( f d ) i nc y a n o b a c t e r i ai sak i n do f a c i d i c s o l u b l ei r o ns u l p h u rp r o t e i nw h i c hd i s t r i b u t e do v e rt h es u r f a c e o ft h y l a k o i dm e m b r a n e a st h ee l e c t r o nc a r r i e rp r o t e i no fp h o t o s y s t e m ， f di n v o l v e dd i r e c t l yi nt h ee l e c t r o nt r a n s p o r to fm e t a b 0 1 i s mo fc 0 2 f i x a t i o n ，n i t r a t er e d u c t i o n ，s u l f a t er e d u c t i o n ，g l u t a m a t es y n t h e s i sa n d p h o t o p h o s p h o r y l a t i o n t h e r e s e a r c ho f p h o t o b i 0 1 0 9 i c a lh y d r o g e n p r o d u c t i o ni ng r e e na l g a ed i s c o v e r e dt h a t f di sr e s p o n s i b l ef o rt h e e l e c t r o nt r a n s p o r tb e t w e e np h o t o s y s t e ma n dh y d r o g e n a s es y s t e m l i m i tw o r k a l s os u g g e s tt h a tf di sak e yt a r g e tp r o t e i ni nt h eh y d r o g e nm e t a b o l i m i nc y a n o b a c t e r i a i nt h i ss t u d y ，t h eh o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dv e c t o rp u c h a t h f a n dp u c f s fw e r ec o n s t r u c t e du s i n gs y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2a sh o s tc e l l t h ec m p a b c dg e n e s ，w h i c he n c o d e da na b c t y p eh c o ft r a n s p o r t e ri n v o l v e d i nc y a n o b a c t e r i a lc 0 2c o n c e n t r a t i n gm e c h a n is m ( c c m ) ，w e r ec l o n e di n t o p l a s m i dp u c l 9t og e n e r a t ep l a s m i dp u c h a t b yi n s e r t i n gh y g r o m y c i nbp h o t r a n s f e r a s e ( 五p 幻c a s s e t t ea n das y n e c h o c y s i ss p p c c 6 8 0 3p e t fc a s s e t t e i n t ot h ec o d i n gr e g i o no fc m p a b c d + 1 5 0 8 一+ 1 5 0 9i n t op u c h a t t h e h o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dv e c t o rp u c h a t h fw a sc o n s t r u c t e d m u t a n t s t r a i np fw a ss c r e e n e da f t e rp u c _ h a t h fw a st r a n s f o r m e di n t os y n e c h o c o c c u s s p p c c7 9 4 2 t oc o n s t r u c tt h em u t a n tp f l ，ah o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dp u c f s w h i c hc o n t a i nas t r e p m y c i nr e s i s t a n c eg e n ei n s e r t i n gi nt h eh o m o l o g o u s f r a g m e n ts y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2f e d lw a sc o n s t r u c t e da n du s e dt o t r a n s f o r mm u t a n tp f t h em e t h o do fs i t e d i r e c t e dm u t a t i o no ns y n e c h o c y s i s s p p c c 6 8 0 3p e t fw a sa p p l y e d t oc o n s t r u c t et h em u t a n tp f n “a n dt h e h o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dv e c t o rp u c h a t h f h o x ew a sa p p l y e dt o c o n s t r u c t et h em u t a n tp f - - h o x e b yt h ec o m p a r a t i v er e s e a r c hb e t w e e nt h e s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 w i l da n dm u t a n t s t r a i n s ，d i s t i n g u i s h a b l e d i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e di nb o t hg r o w t ha n dh y d r o g e np r o d u c t i o n t h e g r o w t hr a t eo ft h em u t a n ts t r a i n sp f ia n dp f n 6 6w e r eg r e a t e rt h a nt h a to f w il ds t r a i ni np h 5b 6 11c u l t u r em e d i u ma n ds m a l l e ri np h 7 一p h11 b g 1 1 h o w e v e rt h em u t a n ts t r a i nj p 鼉一輯o x es h o wq u i t eu n a d a p t e di nb 6 1 1c u l t u r e m e d i u m t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h er e m o d e l i n gi ns y n e c h o c o c c u s s p p c c 7 9 4 2p e t fg e n eh a dc o n s i d e r a b l ee f f e c to nt h ep r o t e i na c t i v i t y ，a n d i ti sp o s s i b l et oi m p r o v et h eb i o p h o t o h y d r o g e np r o d u c t i o na c t i v i t yi n s y n e c h o c o c c u 量s p p c c 7 9 4 2b yp e t fg e n er e m o d e l a t i o n i nt h iss t u d y ，w eo b t a i n e ds y n e c h o c o c c u sp c c 7 9 4 2p o t f m u t a n ts t r a i n s i to f f e r e dt h ep l a t f o r mf o rf u r t h e rr e s e a r c ho np h o t o b i o l o g i c a lh y d r o g e n p r o d u c t i o no fc y a n o b a c t e r i a k e yw o r d s ：s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 ； 2 f e 一2 s f e r r e d o x i mg e n em u t a t i o n 廈門大學學位論文原創(chuàng)性聲明 茲呈交的學位論文，是本人在導師指導下獨立完成的研究成 果。本人在論文寫作中參考的其他個人或集體的研究成果，均在 文中以明確方式標明。本人依法享有和承擔由此論文產(chǎn)生的權(quán)利 和責任。 聲明人( 簽名) ：她、 。p6 年9 月 目 廈門大學學位論文著作權(quán)使用聲明 本人完全了解廈門大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定。廈 門大學有權(quán)保留并向國家主管部門或其指定機構(gòu)送交論文的紙 質(zhì)版和電子版，有權(quán)將學位論文用于非贏利目的的少量復制并允 許論文進入學校圖書館被查閱，有權(quán)將學位論文的內(nèi)容編入有關 數(shù)據(jù)庫進行檢索，有權(quán)將學位論文的標題和摘要匯編出版。保密 的學位論文在解密后適用本規(guī)定。 本學位論文屬于 1 、保密() ，在年解密后適用本授權(quán)書。 2 、不保密( ) ( 請在以上相應括號內(nèi)打“4 ”) 日期：娜年富月夕日 日期：砌石年陰) 日 廈門人學碩士學位論文 1 刖吾 1 1 概述 能源是經(jīng)濟發(fā)展的堅強后盾。2 0 世紀中后期，全球性的經(jīng)濟發(fā)展使得能供與能 耗間的缺口進一步加大，以石油、煤、天然氣為主的傳統(tǒng)能源的有限性及其利用 過程所引發(fā)的后續(xù)環(huán)境污染和室溫效應“”等問題更加突出了傳統(tǒng)能源結(jié)構(gòu)的局限 性。因此，人類在未來的發(fā)展道路上，必須尋求新的更為有效的可利用能源，以滿 足逐漸工業(yè)化的經(jīng)濟發(fā)展需求。 1 1 1 氮能 氫氣具有廣泛的用途。作為一種重要的化工原料，氫氣可用于合成氨工業(yè)、制 造鹽酸以及合成甲酵、人造石油等。目前，全世界生產(chǎn)的氫氣約有2 3 用于合成氨 工業(yè)。石油工業(yè)上的許多工藝過程，如加氫裂化，加氫精制、加氫脫硫、催化加氫 等，均需用氫氣作為還原劑。氫氧焰能產(chǎn)生3 0 0 0 的高溫，可用于熔融和切割金屬。 在食品和冶金工業(yè)上，氫氣也有廣泛的用途。 隨著科學技術(shù)的發(fā)展，氫氣的利用越加廣泛。自氫氣用作a 一2 火箭發(fā)動機的液 體推進劑開始，1 9 6 0 年液氫被首次用作航天動力燃料。之后氫成為火箭領域的常用 燃料。1 9 7 6 年5 月，美國研制出一種以氫氣作燃料的汽車，氫第一次作為氣體燃料， 被應用在汽車上。后來，日本也研制成功一種以液態(tài)氫為動力的汽車。7 0 年代末期， 前聯(lián)邦德國的奔馳汽車公司對氫氣汽車進行試驗。他們僅用了5k g 氫氣，就使汽 車行駛了1 1 0l 謐，并確定了以氫氣作為汽車燃料的種種優(yōu)勢，如：清潔，在低溫下 容易發(fā)動，對發(fā)動機的腐蝕作用小，以及氫能量利用率高，可簡化現(xiàn)有汽車的構(gòu)造 等等。自此，氫氣作為傳統(tǒng)化石燃料的重要替代能源，對其開發(fā)利用的研究在許多 發(fā)達國家逐步啟動。目前，科學界普遍認為，氫能量密度高、燃燒后的殘余能量少、 產(chǎn)物不具有污染性，并具有可儲存性，氫能作為一種綠色的可再生能源，將是2 1 世紀能源結(jié)構(gòu)體系中的重要支柱之一。 1 1 2 氯的制備 氫是自然界中儲量最豐富的元素之一。在水、天然氣、石油、生物質(zhì)及其他富 氫有機物中，都儲存大量的化合態(tài)氫，它們都是氫的重要來源。目前氫的制備豐要 廈門大學碩士學位論文 包括化石燃料制氫、電解水制氫和生物制氫等途徑。 ( 1 ) 煤氣化：煤在高溫高壓下與氣化劑轉(zhuǎn)化成氣體產(chǎn)物。氣體產(chǎn)物中含有占氣 體總體積的3 0 3 9 的氫氣組分。 ( 2 ) 天然氣烴類物質(zhì)的氧化：該法是在催化劑存在下與水蒸氣反應制得氫氣。 ( 3 ) 重油部分氧化：由重油與水蒸氣及氧氣反應制得含氫的氣體產(chǎn)物。氣體產(chǎn) 物中氫氣體積占4 6 。 ( 4 ) 水電解制氫：水電解制氫是氫與氧燃燒反應生成水的逆過程。提供電能使 水分解制得氫氣效率一般為7 5 8 0 。 傳統(tǒng)的化石燃料制氫、電解水制氫過程都存在高能耗低產(chǎn)率問題，使得氫的生 產(chǎn)成本較高，而且化石燃料制氫過程所排放的終產(chǎn)物易造成二次污染，從根本上看 不適于氫制備的產(chǎn)業(yè)化。而生物制氫被認為是氫產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)最有前景的途徑。 1 2 生物制氧 1 9 3 1 年，s t e p h e n s o n 等“1 首次報道了在細菌中含有氫酶( h y d r o g e n a s e ) ，這種酶 可催化氫的氧化和質(zhì)子的還原反應。之后，6 a f f r o n ”1 提出以水光解產(chǎn)氫為基礎的生 物制氫方法，并首先開展了相關研究；g e s t 等“1 證實了光合細菌( r h o d o s p i r i l l u m r u b r u m ) 能在光照厭氧條件下分解有機物產(chǎn)生氫氣的特性。2 0 世紀7 0 年代和9 0 年代 能源危機的出現(xiàn)”1 以及全球氣候與環(huán)境的惡化，引發(fā)了牛物制氫研究的熱潮，并取 得了豐碩的成果。 目前用于生物制氫研究的微生物豐要有兩個類群：1 、包括真核藻類、藍藻和光 合細菌在內(nèi)的光合微生物；2 、不需光的兼性厭氧和專性厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細菌。 1 2 1 光合細菌的光發(fā)酵產(chǎn)氯 1 2 1 1 光合細菌的光合產(chǎn)氫 光合細菌是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成體系的原核生物，含有光合色 素系統(tǒng)i ，能以太陽光作為能源，利用無機物或有機物作為底物進行不產(chǎn)氧的光合作 用。光照放氫是光合細菌以有機物、還原態(tài)無機硫化物為供氫體，太陽能為能源， 將有機物分解伴隨光合磷酸化偶聯(lián)于固氮酶的放氫作用( 圖1 ) ”。光是光合細菌光 發(fā)酵產(chǎn)氫途徑的必備條件，不同光源、光照強度和光照時間都會影響光能轉(zhuǎn)化效率， 廈l j 大學碩士學位論文 從而最終影響光產(chǎn)氫。1 。v a s i l y e v a 等“”用分子生物學方法通過p u f 腳基因突變改 變捕光色素蛋白復合體( l hi 和l h ) 含量，使得r b s p h a e r o i d o s p 3 變異株產(chǎn)氫 速率和光能轉(zhuǎn)化效率提高。同時，氫供體對光合細菌光放氫活性也有顯著的影響， b a b o s a 等?！闭J為這可能與氫供體的結(jié)構(gòu)以及菌株t t 身進化過程的酶系發(fā)育有關。 圖1 光合細菌光合產(chǎn)氫示意圖 f i g 1p r o c e s so fp h o t o h y d r o g e np r o d u c t i o nb yp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 1 2 1 2 光合細菌的暗發(fā)酵制氫 光合細菌不僅具有光放氫能力。在黑暗厭氧條件下，光合細菌也能以葡萄糖、有 機酸、酵類物質(zhì)產(chǎn)生h ：。這種黑暗條件下的產(chǎn)氫是由氫酶催化，產(chǎn)氫機錆4 與厭氧細 菌類似。 與固氮酶催化的光放氫相比，氫酶催化的產(chǎn)氫不需要光能，所以暗發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù) 在工藝上比光發(fā)酵產(chǎn)氫更為簡單。但由于黑暗條件下有機物分解不徹底，故產(chǎn)氫效率 較低( 如圖2 ) 。w a k a y a r a a “”和m a t s u n a g a “”證實，利用光臺細菌的光發(fā)酵和暗發(fā)酵 產(chǎn)氫的雙重特性，采用光暗交替的方法促進了r b s p h a e r o i d e sr v 菌株和非硫光合 細菌r h o d o v u l u ms p n k p b1 6 0 4 7 1 r 產(chǎn)氫效率的提高。 1 2 1 3 光合細菌和發(fā)酵產(chǎn)氫細菌的耦聯(lián)產(chǎn)氫 鑒于厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細菌和光合細菌在產(chǎn)氫過程中產(chǎn)物和底物利用的特性，有些 研究者提出以非光合細菌和光合細菌混合系統(tǒng)進行糕聯(lián)的制氫方式，以提高產(chǎn)氫的 速率和產(chǎn)率。非光合細菌可利用各種形式的大分子有機物來發(fā)酵產(chǎn)氫，并且不需要 光照，發(fā)酵生成的有機酸可被光合細菌作為電子供體利用來產(chǎn)氫“。這兩類細菌的 組合不但減少了光臺細菌的光能需求，同時也提高了氫氣的產(chǎn)量，因此這種耦聯(lián)產(chǎn)氫 是最理想的微生物產(chǎn)氫模式( 如圖3 ) ，但有關這兩類菌在系統(tǒng)中的平衡及合適的培養(yǎng) 一一一蘸蒸 一一一纛一 _i；|黧1；|囂繁纛一膝瞧攘纛黧鬻鬟一纛羹黍囊 廈門大學碩十學位論文 條件、制氫工藝等尚需進一步的研究。 由于光合細菌可利用太陽能降解轉(zhuǎn)化有機物或有機污染物牛產(chǎn)氫能，從而在光 合產(chǎn)氫過程中能將太陽能利用、氫氣產(chǎn)生、有機廢物利用等有機結(jié)合，且其產(chǎn)氫代 謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物可進一步開發(fā)為可降解塑料等高值化產(chǎn)品聚1 3 一羥基丁酸( p h b ) “， 避免造成二次污染的優(yōu)勢，因此在生物制氫技術(shù)上具有巨大的應用潛力。 1 2 2 厭氧和兼性厭氧細菌的暗發(fā)酵產(chǎn)氫 發(fā)酵細菌的產(chǎn)氫速率較高，其發(fā)酵條件要求較低，具有直接應用前景，是目前 產(chǎn)業(yè)化制氫的首選方式。但純菌種發(fā)酵、產(chǎn)氫活性低以及細胞固定化技術(shù)一直是工 業(yè)化生產(chǎn)的主要制約因素。我國在細菌發(fā)酵制氫方面的研究發(fā)展較快，特別是哈爾 f i g 2l i 曲t d a r kc y c l ef o rh y d r o g e np r o d u c t i o nb yp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 廈大學碩士學位論文 圖3 光合細菌和發(fā)酵產(chǎn)氫細菌的耦聯(lián)制氫 f i g 3h y d r o g e np r o d u c t i o nf r o ma n a e r o b i cb a c t e r i aa n dp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 濱工業(yè)大學采用的非固定化菌種制氫技術(shù)，突破了以往生物制氫技術(shù)必須采用純菌 種和固定技術(shù)的局限，首次實現(xiàn)中試規(guī)模連續(xù)流持續(xù)產(chǎn)氫，在產(chǎn)業(yè)化制氫研究道路 上邁出堅實的一步。 厭氧細菌由于體內(nèi)缺乏氧化磷酸化系統(tǒng)，體內(nèi)有機物分解沿底物水平磷酸化進 行，因此在氫酶催化的產(chǎn)氫過程中，氫酶是作為發(fā)酵產(chǎn)生的還原物的最終電子受體 而起作用的。在產(chǎn)氨過程中，氫酶主要通過丙酮酸脫羧途徑和輔酶i 的氧化與還原 平衡調(diào)節(jié)途徑產(chǎn)氫“6 ，釋放體內(nèi)過多的還原力，以保證細菌生理代謝過程的正常 進行。e m p 途徑中的丙酮酸脫羧產(chǎn)氫。該途徑中厭氧細菌氧化還原產(chǎn)生的過剩電 子( e - ) 通過電子載體鐵氧還蛋白的介導傳遞給氫酶。產(chǎn)氫過程發(fā)生于丙酮酸脫羧 作用中。輔酶i 的氧化與還原平衡調(diào)節(jié)產(chǎn)氫。厭氧細菌在產(chǎn)酸過程中存在n a d h + h + 的再生和消耗，保證n a d h + h + n a d + 平衡。如果n a d h + h + 消耗過程相對慢于 形成過程時，會產(chǎn)生n a d h + h + 的積累。此時發(fā)酵細菌可以通過釋放 k 的方式將過 量的n a d h + h + 氧化還原：n a d h + h + 斗h 。+ n a n + 。發(fā)酵細菌的己糖單磷酸鹽途徑能 使細胞從葡萄糖的降解中獲取更多的還原型n a d h ，同時產(chǎn)生更多的c o ：，c o ：會通過 生成延胡索酸或琥珀酸的反應消耗還原力n a d h ，從而表現(xiàn)出c o 。對產(chǎn)氫的抑制“。 廈門大學碩上學位論文 1 2 3 真核藻類和藍藻的光合制氫 許多藍藻和真核藻類體內(nèi)具有能進行光合作用的完整光合色素系統(tǒng)( p si ，p s i i ) ，同時又具有能還原質(zhì)子而產(chǎn)氫的氫酶，能進行產(chǎn)氫代謝。因而利用藻類或者 藍藻的光解水制氧倍受青睞( 如圖4 ) 。 圖4 利用藻類和藍藻的光解水制氫模式圖 f i g 4 s h e m eo f b i o p h o t o l y s i sh y d r o g e np r o d u c t i o nb ya l g a ea n dc y a n o b a c t e r i a 1 2 3 1 真核藻類的光生物制氫 1 9 4 2 年g a f f r o n 等“”首先發(fā)現(xiàn)綠藻s c e n e d e s 塒u so b l i q u u s 既能在固定c o ，時氧 化分子氫提供還原力又可以在光照的時候產(chǎn)生分予氫。這個光生物制氫史上的重要 發(fā)現(xiàn)，引起了許多科學工作者對綠藻光生物制氫研究的興趣。此后，美國、曰本、 德國等一些發(fā)達國家投入大量的資金用于開展有關于藻類產(chǎn)氫機制的研究以及產(chǎn)氫 效率的提高。 利用藻類光合制氫研究較多的是綠藻。這些藻類屬真核生物，含光合系統(tǒng)p si 和p si i ，不含固氮酶，產(chǎn)氫代謝由體內(nèi)的氫酶?！闭{(diào)節(jié)。放氫反應主要從兩條途徑進 行。一條途徑是葡萄糖等底物經(jīng)分解代謝產(chǎn)生還原劑作為電子供體，電子傳遞途徑是 電子供體一p si f d 一氫酶一h 。，同時伴隨有c 0 ：產(chǎn)生。另一條途徑是光解水產(chǎn)氫， 電子傳遞途徑是：h ：o p s i i p si f d 一氫酶一h ：，同時伴隨著0 ：的生成( 如圖5 ) 。 光水解產(chǎn)氫途徑是藻體直接利用太陽能，以水為底物的產(chǎn)氫。產(chǎn)氫過程所用的原料為 6 廈f j 大學頌j 學位論文 水，其來源十分豐富，是一種理想的制氫方法。但是，水分解產(chǎn)生的晚會抑制氫酶的 活性。“，因此利用藻類等進行直接光解水( d i r e c tb i o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 產(chǎn)氫尚 有較大的難度。 圖5 綠藻的光解水制氫電子傳遞途徑 f 垃5e l e c t r o nt r a n s f e rp a t h w a yo fb i o p h o t o l y s i sh y d r o g e np r o d u c t i o ni na l g a e 目前主要采用間接生物光解水( i n d i r e c tb i o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 產(chǎn)氫方式， 在時間上或是空間上將產(chǎn)h 。和產(chǎn)0 。過程分離開，以解決氫酶對氧敏感的問題。一 步法問接生物光解水( o n e s t a g ei n d i r e c tb i o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 產(chǎn)氫：采用脫 硫的培養(yǎng)基抑制p s 的作用，進而抑制了氧的產(chǎn)生，解除氧對產(chǎn)氫酶的抑制，從而 實現(xiàn)持續(xù)產(chǎn)氫。兩步法間接生物光解水( t w o s t a g ei n d i r e c tb j o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 產(chǎn)氫：將微生物體的培養(yǎng)過程和微生物的產(chǎn)氫隔離開來在第一階段進行普通的 光合作用，微生物體不斷增殖，并積累大量有機物質(zhì)第二階段是光驅(qū)動產(chǎn)氫，該過程 處在無氧條件下，首先在暗處誘導氫酶的合成，然后輔以適當?shù)墓庹眨蕴峁┊a(chǎn)氫所 需的能量?？傊⒃骞馑庵茪涞难芯拷鼇碛休^大進展，但與實用運用還有較大的距 離。特別是在微藻的光能利用率。2 2 “、0 2 對氫酶的抑制”“，光生物反應器構(gòu)建等問 題上還需要更進一步的深入研究“。 1 2 3 2 藍藻的光生物制氫 在光合生物制氫的研究中，藍藻也是應用較多的光合生物類群。如a n e b e e n a c y l i n d r i c a l 、a n e b a e t l aa z 0 1 e e 。2 、d n e b a e n as i a n e s i s t 2 、勛i r u l i n a 口l ar 7 廈門大學碩士學位論文 e n s i s 等。1 都先后被應用于光生物制氫研究。 藍藻是一類由單細胞或由多細胞組成的群體或絲狀體的原始的原核生物，是地 球早期大氣中氧氣的主要貢獻者之一。藍藻是一類特殊的原核微生物，具有原核生 物和植物的一些特征：細胞不含細胞核、葉綠體及線粒體等雙膜結(jié)構(gòu)的細胞器，染 色體d n a 裸露，細胞壁結(jié)構(gòu)為g 。；光臺色素主要是葉綠素a 、b 胡蘿 素和藻膽色素； 光合系統(tǒng)類似于高等植物，具光合系統(tǒng)i ( p si ) 和光合系統(tǒng)( p si i ) ，定位于類囊 體膜上，進行產(chǎn)氧的光合作用。 由于藍藻在細胞結(jié)構(gòu)、代謝、遺傳和進化等方面都表現(xiàn)出獨特的性質(zhì)以及在生 物圈中所扮演的重要角色，多年來被廣泛地用于研究光合作用、固氮作用、葉綠體 起源以及植物進化等重大生物學課題。同時，隨著分子生物學研究的深入開展，藍 藻成為基因工程重要的受體菌之一。1 9 9 6 年集胞藻p c c 6 8 0 3 基因組全序列的測定 。，以及之后的g o e o b a c t e rv i o a c e u sp c c 7 4 2 1 ，n o s t o cs p p c c7 1 2 0 ， t h e z t n o s y n e c h o c o c c u se l o n g a t u s b p l 、聚球藻砸- 1 8 1 0 2 和聚球藻p c c 7 9 4 2 基因組測 序工作的開展，為藍藻基因工程的進一步發(fā)展奠定了堅實的基礎。在光合生物制氫 的研究中，藍藻是既可以產(chǎn)氫o 。”1 ( 如圖6 所示) 又可以進行光合作用的原核微生 物。它的培養(yǎng)條件粗放，適合于大規(guī)模培養(yǎng)，低成本運轉(zhuǎn)，因而被認為是良好的生物 制氫微生物。 藍藻的產(chǎn)氫途徑主要通過兩種方式：耦聯(lián)于光反應的固氮酶催化的光放氫和厭 圖6 藍藻緬胞內(nèi)存的在氫代謝途徑簡圉 f i g 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f h y d r o g e nm e t a b o l i s mi nc y a n o b a e t e r i a 廈門大學碩士學位論文 氧條件下氫酶催化的暗放氫?！?。與藍藻氫代謝相關的酶有i 司氮酶( n i t r o g e n a s e ) 和 兩種功能不同的n i f e - 氫酶：吸氫氫酶( u p t a k eh y d r o g e n a s e ) 和雙向氯酶 ( b i d i r e c t i o n a lh y d r o g e n a s e ) 。 固氮酶是一個金屬酶復合體，由m o f e 蛋白( q ，b 。) 和f e 蛋白( y ，) 組成。 復合體中的這三個蛋白亞基分別由n i f d ( q 亞基) 和n i f k ( 0 亞基) ，月打( y 亞 基) 三個基因編碼( 如圖7 所示) 。 目前已知的固氮藍藻中都含有吸氫氫酶“1 。吸氫氫酶一般存在于絲狀藍藻異 形胞的類囊體膜上，在固氮藍藻中該酶能重新利用由固氮反應所產(chǎn)生的也，通過h ： 的氧化將電子傳遞給光合作用電子傳遞鏈或是呼吸作用電子傳遞鏈，從而回收能量 并除去固氮酶周圍的0 ，防止固氮酶遇氧失活，同時為圓氮酶或者體內(nèi)其它代謝提供 還原力。7 1 。在非固氨藍藻中，吸氫酶存在與否還有很大的爭議“1 。1 9 9 5 年c a r r a s c o 等”“首先報道了a n a b a e n ap c c7 1 2 0 中吸氫酶大小亞基基因的編碼和重組過程，隨 后又有多種固氮藍藻中的吸氫酶基因被克隆。在藍藻中其吸氫酶大亞基和小亞基基 因均具有很高的保守性。2 1 。研究藍藻吸氫酶具有重要的應用價值，因為吸氫酶的 失活“。4 ”可以直接提高藻體的放氫活性。 雙向氫酶，是一種可溶性或具有松散膜結(jié)合結(jié)構(gòu)的氫酶，具有對氧的敏感性， 對h 。的高親和性及對高溫的耐受性三大特征一3 。在藍藻的營養(yǎng)細胞和異形胞中， 雙向氫酶不僅可以催化產(chǎn)氫也可以吸氫( 主要是催化放h z ) 。結(jié)構(gòu)上，雙向氫酶由 氫酶和硫辛酰胺脫氫酶組成四聚體結(jié)構(gòu)，其中氫酶的生理功能是催化放氫或者吸氫， 由h o x y 和h o x h 基因編碼，硫辛酰胺脫氫酶的兩個亞基則分別由h o x f 和h o x u 基因編碼( 如圖7 ) 。藍藻的雙向氫酶有的定位于藍藻細胞的細胞質(zhì)中”1 ，有的與 類囊體膜相連，而有的雙向氫酶則不是簡單的溶解于細胞質(zhì)中，而是與細胞質(zhì)膜具 有一定的聯(lián)系。對于雙向氫酶的功能目前還沒有非常明確的看法，普遍認為雙向 氫酶在厭氧環(huán)境下參與調(diào)節(jié)代謝過程產(chǎn)生的過剩還原力。a p p e l 1 則提出雙向氫酶在 光合作用電了傳遞系統(tǒng)中具有電了流閥門的作用。 利用藍藻的光合制氫主要存在問題是氧對產(chǎn)氫的抑制、吸氫酶的吸氫反應以及 藍藻產(chǎn)氫效率較低。固氮酶催化的放氫反應是一個能量消耗過程“，在最適牛理 廈門大學碩士學位論文 條件下，通過固氮酶的電了流約有2 5 被用來還原質(zhì)了生成h ，”。由于胞內(nèi)吸氫 酶的存在，部分氫被重吸收和利用。相比之下，由雙向氫酶催化的產(chǎn)氫反應能量轉(zhuǎn) 換效率較高。目前藍藻將太陽能轉(zhuǎn)化為氫能的效率最高為0 3 3 ”。進一步提高藍 藻的產(chǎn)氫活性是藍藻光解水制氫的關鍵環(huán)節(jié)，包括：光反應器的工藝優(yōu)化、藍 藻產(chǎn)氫條件的進一步優(yōu)化“、具高效光能轉(zhuǎn)換效率“、高效光合電子傳遞效率 以及高產(chǎn)氫活性和耐氧氫酶的藻株構(gòu)建。 j 一一一一一、 p s ； 3 5b h 姊l 斗2 升+ 2 0 ：6 0 8 晰 u p 協(xié)k eh y d r c a g e n a s e b i d i r e c t i o n j a l h y d r o g e n 一竺 ”、強h o x ，。hl 震j m o x ：_ p h、。：# ， ：。，一， 薰瓣 鬻i “k ， 、一v ， h y d 州：o l a 砷“抽 圖7 參與氫代謝的固氮酶、吸氫酶和雙向氫酶 f i g 7e n z y m e sd i r e c t l yi n v o l v e di nh y d r o g e nm e t a b o l i s mi nc y a n o b a c t e r i a 1 3 藍藻的光合傳遞鏈 藍藻是一類能進行產(chǎn)氧光合作用的原核生物。遠在3 億年前的地質(zhì)年代，就發(fā) 現(xiàn)藍藻存在的痕跡“。因此，認為藍藻是地球上最早出現(xiàn)的具有產(chǎn)氧能力的有機體， 對之后的好氧生物的出現(xiàn)及其進化具有深遠的意義。 廈門火學碩士學位論文 1 3 1 藍藻的光合電子傳遞途徑 藍藻的光合作用過程類似于真核藻類和綠色植物。光系統(tǒng)元件及其光合電子傳 遞體定位于類囊體膜上。與真核藻類和綠色植物不同的是藍藻的天線色素系統(tǒng)中含 有藻膽蛋白體“”。藍藻光反應過程中的電子傳遞途徑如圖8 所示。在電子傳遞過程 中p s i i ( p 6 8 0 ) 和p si ( p 7 0 0 ) 驅(qū)動電子流動并產(chǎn)生電予能勢躍遷，電子沿著電子 傳遞體氧化還原勢逐步降低的方向流動。 在光合作用的光反應階段，p s h 光解水產(chǎn)生0 2 、質(zhì)子( h + ) 和電子( e 一) ，并通 過類囊膜上的光電子傳遞鏈傳遞e 一還原n a d p + ，產(chǎn)生的n a d p h 用于c 仉還原。 下p 卻附慵神 圖8 藍藻光合類囊膜上的光系統(tǒng)利光合電子傳遞體 f i g 8 p h o t o s y s t e m ( p s i i a n d p si ) a n d t h ec o m p o n e n t s o f e l e c t r o n t r a n s p o r ts y s t e mo nt h et h y l a k o i dm e m b r a n e so f c y a n o b a c t e f i a ，3 2 光系統(tǒng) 光系統(tǒng)i i ( p s i i ) 是一個跨膜的多亞基蛋白復合體。藍藻的p s i i 與外圍的天線 色素系統(tǒng)緊密相連。藍藻的外圍天線色素系統(tǒng)由別藻藍蛋白、藻藍蛋白和藻紅蛋白 構(gòu)成。p s i i 利用外圍的天線色素系統(tǒng)吸收流入光反應中心的光能驅(qū)動水的分解和 質(zhì)體醌的還原。 藍藻的p s i i 由大約2 0 個亞基組成”“，形成對稱的同型二聚體結(jié)構(gòu)，其上有一 個質(zhì)體醌( p l a s t o q u i n o n e ，p q ) 結(jié)合位點。p s i i 包含了至少九種的氧化還原反應成 廈門大學碩 學位論文 分：葉綠素，脫鎂葉綠素( p h e ) ，質(zhì)體醌，酪氨酸，m n ，f e ，細胞色素島。( c y t c 。) ， 類胡蘿p 素和組氨酸”。這些氧化還原輔因子分布在單獨的亞基上，或者與不同的 亞基結(jié)合，或者形成單獨的亞基( 如c y t c 。) 。構(gòu)成藍藻p s i i 的d 1 ( p s b a ) 和d 2 ( p s b d ) 亞基，與定位于其上的氧化還原輔因子形成反應中心，驅(qū)動水的光解和質(zhì) 體醌的還原。其中c p 4 3 ( p s b c ) 和c p 4 7 ( p s b b ) 亞基結(jié)合有葉綠素分子，是p s i i 內(nèi) 部的天線色素蛋白。構(gòu)成藍藻p s 的其它亞基還有細胞色素魄。* 亞基，細胞色素 島5 90 亞基( p s b ea n dp s b f ) ，p s b h ，p s b i ，p s b j ，p s b k ，p s b l ，p s b m ，p s b np s b w ，p s b 、 p s b o 、p s b u 亞基和細胞色素島j 。( p s b g ) 亞基等。由p s b o 、p s b u 、p s b v 亞基構(gòu)成的產(chǎn) 氧復合體( o e c ) ，含有一個( m n + ) 。簇。p s b o 存在于所有的產(chǎn)氧光合作用有機體中1 ， 結(jié)構(gòu)上具有很強的保守特征”。p s b u 和p s b v 是藍藻特有的亞基，而植物含有的是 p s b p 和p s b o t 6 7 “，但在一些特殊環(huán)境中，藍藻也存在類似于p s b p 和p s b q 的蛋白”“。 藍藻的p si i 結(jié)構(gòu)及其水光解后質(zhì)體醌還原過程如圖9 所示。水光解和氧產(chǎn)生由產(chǎn)氧 復合體( o e c ) 所催化。o e c 裂解2 分子水產(chǎn)生分子0 。、4 個h + 和4 e 一。產(chǎn)生的 0 。與分布在p s i i 周圍的類胡蘿h 素結(jié)合并迅速擴散，避免造成p s i i 氧損傷。4h + 直接進入類囊膜內(nèi)水相。4 e 一通過d l 上酪氨酸殘基t y r z 的介導傳遞給p 6 8 0 。p 6 8 0 吸收光能轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)p 6 8 0 ，驅(qū)動電子傳遞到結(jié)合在叭上的p h e 。電子通過p h e 斗 q a 辛q b 斗p q 途徑傳遞到分布在類囊膜間隙的p q 分子。o e c 催化中心結(jié)構(gòu)示意圖如 圖1 0 所示。 圖9 藍藻p s i i 結(jié)構(gòu)模式及其電予傳遞途徑 f i g 9s h c e m eo f t h ep si ic o m p l e xa n dt h ee l e c t r o n t r a n s f e r 廈門大學傾十學位論文 圖1 0 產(chǎn)氧復合體( 0 e c ) 結(jié)構(gòu)示意圖 f i g 10s t r u c t u r a lp a t t e r no fo e c 1 3 3 質(zhì)體醌和細胞色素6 f 復合體 在光合電子傳遞鏈上質(zhì)體醌( p q ) 是一一個可移動的小分子電子傳遞成分。p q 隨機 的與p si i 特定位點結(jié)合，在q b 結(jié)合位點上p si i 通過傳遞2 個電子和兩個質(zhì)子將p q 還原成p o h 。( p l a s t o q u i n 0 1 ) ，并從p s 上解離下來。之后p q h 。也以擴散的形式隨機 性的結(jié)合到細胞色素b f 復合體( c y t o c h r o m e6 ，c o m p l e x ，c y t b y ) 的p q h ：結(jié)合位 點上。 圖1 1 細胞色素b 蝮合體結(jié)構(gòu)模式圖 f i g 11s c h e m eo f t h ec y t o c h r o m e 可c o m p l e x c y t 6 ，將p q h 。氧化形成p q 進入下一輪反應1 ，兩個質(zhì)子最終釋放到膜內(nèi)。在 結(jié)構(gòu)和作用機制上c y t 6 ，與線粒體和細菌中的c y t 由。的具有很大相似性“。c y t 6 ，是一個膜結(jié)合態(tài)復合體( 如圖1 1 所示) ，包括四個主要的蛋白亞基c y t 魄、i v 廈門大學碩士學位論文 業(yè)基( s u b u n i ti v ) 、一個鐵硫蛋白( f e - sp r o t e i n ) 、c y t ，和一些數(shù)目不等的小 分子量亞基”，并結(jié)合三個血紅素分子、一個鐵硫中心、一個葉綠素分子和一個類胡 蘿h 素”6 。c y t b f 上有一個p q 也結(jié)合位點和個結(jié)合質(zhì)體藍素( p l a s t o c y a n i n ， p c ) 或細胞色素島( c y t o c h r o m e 島，c y t 的的位點，分別催化p q h ：的氧化復位和 p c 或c y t c e 的還原，同時將電子從p q t t 。傳遞到p c 或c y t c 。 光反應過程中，c y t b f 的一個很獨特的功能體現(xiàn)在介導光能在p si 和p si i 上 的分配調(diào)節(jié)。藍藻中藻膽蛋白( p b s ) 作為主要光能捕獲體，其吸收的光能流向p si 和 p s i i 反應中心。7 。藍藻具有p si 和p s i i 的能念調(diào)節(jié)機制，調(diào)節(jié)p b s 流向p si 和 p si i 的能量分配，保證p si 和p si i 中光能量體系的平衡”“。在植物和綠藻中，這 種能念調(diào)節(jié)是通過天線色素系統(tǒng)的葉綠素a b 蛋白復合體l h cl i 可逆磷酸化進行的 ”1 。催化l h c i i 磷酸化的蛋白激酶定位在類囊膜上，酶的激活需要質(zhì)體醌氧還池( p q p 0 0 1 ) ”】和c y tb f 的聯(lián)合介導”“1 。藍藻中p si 和p s 的能態(tài)調(diào)節(jié)機制尚未完全明 確，但是p qp o o l 和c y tb f 在能態(tài)調(diào)節(jié)過程中起到了重要作用”。 1 3 4 質(zhì)體藍素( p l a s t o c y a n i n ) 和細胞色素c 。( c y t o c h r o m eo 質(zhì)體藍素( p l a s t o c y a n i n ，p c ) 和細胞色素c 。( c y t o c h r o m e ，c y l o 介導c y t b y 和p 7 0 0 間的電子傳遞。c y t 島是一個攜帶