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,血栓與止血檢測,血栓與止血檢測,一、止血、凝血和纖溶機(jī)制,二、凝血及纖溶實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)展,三、血凝質(zhì)控四、目前開展血凝項(xiàng)目的臨床意義五、常見分析錯(cuò)誤的原因分析,血栓與止血檢測,一、止血、凝血和纖溶機(jī)制,(一)血管壁的作用,1.血管的收縮(神經(jīng)反射;內(nèi)皮素、血管緊張素;TXA2、5-HT)。2.血小板的激活(表達(dá)并釋放血管性血友病因子vWf,導(dǎo)致血小板在損傷部位黏附和聚集)。3.啟動(dòng)內(nèi)、外源凝血(因子的激活和組織因子TF的釋放)。4.局部血黏度增高。,血栓與止血檢測,(二)血小板的作用,1.形成血小板血栓(白色血栓),機(jī)械性修復(fù)受損血管。2.血管受損GPb經(jīng)vWf粘附3.釋放血小板第三因子(PF3)直接參與凝血反應(yīng)。4.活化血小板在前激肽釋放酶及高分子量激肽原存在的條件下,直接激活F及F。5.ADP(來自紅細(xì)胞)、凝血酶、膠原血小板GPb/a結(jié)合Fg,血栓與止血檢測,(三)凝血因子的作用,(目前至少有14種),包括12個(gè)經(jīng)典的凝血因子(因子I-XIII,除因子VI)以及激肽釋放酶原(PK)、高分子量激肽原(HMWK).除因子IV(Ca2+)外,其他均為蛋白質(zhì)除因子III(TF)外,其他均存在于血漿中整個(gè)凝血過程分三期:凝血活酶形成期凝血酶形成期纖維蛋白形成期,血栓與止血檢測,(三)凝血因子的作用,1.外源性凝血途徑,2.內(nèi)源性凝血途徑,3.凝血共用途徑,注意,12個(gè)凝血因子除F、F、和部分F外,主要產(chǎn)生于肝臟。F、F、F、F是維生素K依賴因子血友?。?、乙、丙)三種分別缺少F、F、F,均影響內(nèi)源性凝血途徑。,IntrinsicXII,XI,IX,VIII(APTT),Extrinsic-VII(PT),ProthrombinThrombin,FibrinogenFibrin,CommonPath(TT)FXFXa,XIIIa,XIII,Thrombin,Fibrin(strong),Fibrinogen,Fibrin(weak),IX,XI,XIa,IXa,Xa,Va,XIIa,Prothrombin,TF-VIIa,(Prothrombinase),PL,PL,(Tenase),VIIIa,PL,X,IntrinsicPathway,HKa,ExtrinsicPathway,TFPathway,ProteinC,ProteinS,AntithrombinIII,血栓與止血檢測,(四)抗凝血系統(tǒng)的作用,1.細(xì)胞抗凝作用:包括單核巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞,2.體液抗凝作用,抗凝血酶(AT-),肝素介導(dǎo)下,滅活凝血酶、Fa、Fa、Fa、Fa,滅活TF/a、Fa,TFPI,蛋白C和蛋白S,滅活Fa、Fa激活纖溶系統(tǒng),血栓與止血檢測,(五)纖維蛋白溶解(纖溶)系統(tǒng)的作用,組織型纖溶酶原激活物(t-PA),尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA),激活,纖溶酶原(PLG),纖溶酶(PL),抗纖纖溶酶(2-AP),纖溶酶原激活抑抑制物PAI、PAI2,降解,降解,纖維蛋白原,纖維蛋白,凝血因子,降解為X、Y、D、E等碎片,生成D-D、r-r二聚體。上述碎片多聚體統(tǒng)稱為FDP,抗血小板聚集及抗血液凝固作用,二、凝血及纖溶實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)展,血液凝固是一個(gè)復(fù)雜的生理生化代謝過程實(shí)質(zhì)是通過一系列酶促反應(yīng),使血漿中呈液態(tài)的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成固態(tài)的纖維蛋白絲,因而凝血是屬于生理生物化學(xué)范疇的課題涉及血液學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等諸多領(lǐng)域由于這些相關(guān)學(xué)科研究的日益深入,不斷地給凝血的理論和實(shí)踐注入新的內(nèi)容,因此,在測定方法學(xué)上也由過去精密度低的方法過渡到精密度高的方法。,凝血及纖溶檢測方法,凝血及纖溶檢測項(xiàng)目越來越多,目前應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)大體分為:篩篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)方法學(xué)上又可分為三大類:功能測定免疫學(xué)測定化學(xué)測定,功能測定,即傳統(tǒng)的最終以出現(xiàn)纖維蛋白作為判斷依據(jù)的方法如凝血酶原時(shí)間(PT)、活化的部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT),以及用各種缺乏因子血漿測定某一凝血因子含量的方法等,功能測定,PT測定是檢測凝血因子、的過篩試驗(yàn),要用統(tǒng)一標(biāo)有國際敏感指數(shù)(ISI)的凝血活酶試劑,在抗凝治療監(jiān)控和決定用藥劑量時(shí),一定要用國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)報(bào)告APTT是公認(rèn)較好的檢測“內(nèi)源性”凝血因子缺陷的過篩試驗(yàn),基本上可用于代替了過去的凝血時(shí)間測定,凝血時(shí)間的測定不管是玻片法還是試管法,都過于粗糙,敏感性太差。以前用于個(gè)別凝血因子缺乏的一些“糾正”試驗(yàn)以及所謂的“凝血活酶生成”試驗(yàn),都因操作繁瑣,敏感性不高,已經(jīng)淘汰,免疫學(xué)測定,是近年來發(fā)展最快的檢測方法,其原理是以純化的被檢物質(zhì)為抗原,制備相應(yīng)的抗體,然后用抗原抗體反應(yīng)原理對被檢物質(zhì)進(jìn)行定性或定量測定其方法采用ELISA、膠乳微粒凝集、火箭電泳等方法。對許多新發(fā)現(xiàn)的抗凝因子,纖溶和纖溶抑制因子,纖維蛋白原裂解,纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物,凝血酶原活化等過程中被切下的小肽,如我們目前開展的FDP、D-二聚體等的測定,基本上都用免疫學(xué)方法檢測,免疫學(xué)測定,從理論上講,免疫學(xué)測定不可能全部取代功能測定。因?yàn)槊庖邔W(xué)測定的僅是該因子的抗原性,只能表明體內(nèi)存在該因子,但卻不能說明其是否有生物活性,而功能測定則是測該因子在凝血或纖溶中的生理生化功能。,化學(xué)測定,理論根據(jù)是:許多凝血、抗凝及纖溶因子本身是水解酶,可以用人工合成含有該酶酶切位點(diǎn)并帶有色原(指示劑)的寡肽作為底物,用常規(guī)的生化比色法加以測定。國內(nèi)外已有一些合成的底物用于測定,諸如AT、凝血酶、F、Fa,以及纖溶酶等等。,三、凝血及纖溶實(shí)驗(yàn)質(zhì)控,質(zhì)量是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作的生命線,是當(dāng)今醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作中的關(guān)鍵問題凝血與纖溶檢驗(yàn)質(zhì)量,關(guān)鍵在于診斷試劑。以往,大量凝血檢測試劑由于各實(shí)驗(yàn)室自行制備,手工操作難以達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和全國、全球標(biāo)準(zhǔn)化,也難以達(dá)到室內(nèi)、室間質(zhì)控的要求為此WHO和血栓和止血委員會(huì)(ICTH)制定了一些標(biāo)準(zhǔn)或提供少數(shù)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品供各國校準(zhǔn)各種試劑和方法。國內(nèi)市場上能購到的商品試劑來源,國外主要有美國、法國;國內(nèi)有天津、上海、北京、福建等。,凝血及纖溶實(shí)驗(yàn)質(zhì)控,我們臨床檢驗(yàn)工作者都要從方法學(xué)與試劑的標(biāo)準(zhǔn)化等方面嚴(yán)把質(zhì)量關(guān),全面系統(tǒng)地掌握新的知識動(dòng)態(tài),進(jìn)一步提高質(zhì)量意識,使我國在凝血與纖溶測定總體水平上進(jìn)一步提高,與國際接軌。,凝血及纖溶實(shí)驗(yàn)質(zhì)控,良好的檢測結(jié)果靠三方面來獲得:精確度儀器:靠保養(yǎng)、靠校準(zhǔn)可靠的試劑:合格,優(yōu)質(zhì)規(guī)范的操作:嚴(yán)格按SOP文件,凝血及纖溶實(shí)驗(yàn)質(zhì)控,重復(fù)性-靠什么來保證?1、儀器的重復(fù)性:包括儀器內(nèi)部各個(gè)通道自身與各個(gè)通道之間的一致性2、試劑、消耗品的重復(fù)性只能在穩(wěn)定的儀器上獲得,凝血及纖溶實(shí)驗(yàn)質(zhì)控,準(zhǔn)確性:是儀器、試劑、消耗品、操作人員的綜合體現(xiàn)包括:儀器的計(jì)算公式、標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑的保存、制備、存放效期試劑污染來源的控制,質(zhì)控不規(guī)范洗針問題,高濃度清洗液洗針腐蝕樣品針導(dǎo)致重復(fù)性下降次氯酸鈉殘留導(dǎo)致干擾結(jié)果低濃度清洗液洗針不能有效滅活凝血酶,造成交叉污染結(jié)果不準(zhǔn)針容易堵塞、半堵塞造成樣本、試劑加樣不準(zhǔn),日常工作中應(yīng)注意的問題,(一)血標(biāo)本應(yīng)注意的問題1.采血后標(biāo)本在低溫保存時(shí)間范圍:有報(bào)道在32保存血漿6、12、24h因子活性可分別消失50%、60%、95%,即使保存在4也分別消失5%、55%、70%。V因子活性在32分別消失25%、40%、80%,而在4則僅損失0%、5%、10%。因此測定APTT的血漿在-80至少可保存1個(gè)月、4為6h、20為4h、而32僅為2h。測定PT的血漿,在4為24h、20為6h、32為2h。,日常工作中應(yīng)注意的問題,2.血液與抗凝劑比例:國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)、國際血栓與止血委員會(huì)(ICTH)推薦使用3.2g/dl(含2H2O)或0.109mol/L的枸櫞鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。血液與抗凝劑按9:1比例混合,實(shí)際上是指抗凝劑與正常紅細(xì)胞壓積血液之間的比例而言。因此應(yīng)根據(jù)患者紅細(xì)胞比積(Hct)狀況隨時(shí)調(diào)整抗凝劑用量。,(二)實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)注意的問題,許多試驗(yàn)誤差都來源于技術(shù)的錯(cuò)誤。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、試劑、溫度及pH值上很微小的變化都會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果明顯的變化離心因素。APTT、PT需乏血小板血漿,一般3000r/min離心10min后分離血漿。離心前注意標(biāo)本量,離心后注意血漿的量(Hct)以保證抗凝劑與標(biāo)本量最適比例試驗(yàn)前檢查血漿是否有溶血、黃疸、脂血和出現(xiàn)凝塊。紅細(xì)胞膜含有磷脂,溶血標(biāo)本具有與血小板第因子(磷脂)相似的凝血活性,這種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值。標(biāo)本中如果出現(xiàn)凝塊,無論凝塊多么小,均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。,四、開展出凝血檢測的內(nèi)容與臨床意義,意義:1出血性疾病進(jìn)行診斷與分型(血友病,血小板病)2血栓性疾病的診斷與分型(易栓癥,高凝狀態(tài))3DIC診斷與分期,療效觀察4藥物治療監(jiān)測(抗凝、抗血小板、溶栓治療)5術(shù)前常規(guī)檢查,(一)凝血功能檢測,血漿凝血酶原時(shí)間測定(PT)活化部分凝血活酶時(shí)間測定(APTT)血漿纖維蛋白原測定(Fbg)凝血時(shí)間(CT)單因子抗原含量,血漿凝血酶原時(shí)間(PT),血漿凝血酶原時(shí)間(PT)原理:該測定是在受檢血漿中加入鈣離子和組織因子后,觀察其凝固時(shí)間。本試驗(yàn)是反映外源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選試驗(yàn)。為外凝血途徑常用篩選試驗(yàn)。正常參考范圍為11-13秒,超過3秒以上為異常PT延長先天性因子、缺乏癥,DIC,Vitk缺乏癥,肝臟疾病,抗凝劑使用后PT縮短高凝狀態(tài),血栓性疾病。如DIC早期、心肌梗塞、腦血栓形成、多發(fā)性骨髓瘤。,INR值:國際標(biāo)準(zhǔn)化比率計(jì)算公式:INR=(測量PT/正常PT)ISI意義:它不但建立了測量值與正常人的對照,而且,排除了不同實(shí)驗(yàn)室、不同試劑之間的差異,使它的值更具有臨床統(tǒng)一的意義。在口服抗凝劑的監(jiān)測中更有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的臨床意義。,血栓與止血檢測,活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT),原理,參考值,該測定是在受檢血漿中加入APTT試劑(接觸因子激活劑和部分磷脂)和鈣離子后,觀察其凝固時(shí)間。本試驗(yàn)是反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選試驗(yàn)。,手工法:2840秒,較正常對照值延長10秒以上為異常。,APTT,臨床應(yīng)用:活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)是檢查內(nèi)源性凝血因子的一種過篩試驗(yàn),是用來證實(shí)先天性或獲得性凝血因子、的缺陷或是否存在它們相應(yīng)的抑制物,同時(shí),APTT也可用來激肽釋放酶原(PK)和高分子量激肽釋放酶原(HMWK)是否缺乏,由于APTT的高度敏感性和肝素的作用途徑主要是內(nèi)源性凝血途徑,所以APTT成為監(jiān)測普通肝素首選指標(biāo),前后之比1.5-2.5為佳。APTT縮短:DIC高凝期,血栓性疾病等。,E,XII,XI,Ca+,Ca+,Ca+,I,VII,II,X,V,IX,VIII,Ca+,纖維蛋白原(Fg)測定,正常凝血反應(yīng)的最終結(jié)果為纖維蛋白原反應(yīng)生成纖維蛋白,所以,纖維蛋白原的檢測也十分重要。參考值:2-4g/L增高見于糖尿病、急性心肌梗塞、急性感染、結(jié)締組織病、急性腎炎、燒傷、多發(fā)性骨髓瘤、休克、大手術(shù)、妊高癥、惡性腫瘤、血栓前狀態(tài)、放射治療.減低見于DIC、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝硬化、先天性纖維蛋白原缺乏癥,(二)抗凝血功能檢測,1.凝血酶時(shí)檢查Fg有無異常間測定(TT)檢查循環(huán)血中有無抗凝物共同途徑異常標(biāo)志2.抗凝血酶AT-活性增高出血AT-活性降低血栓形成3.血漿蛋白細(xì)胞抗原測定(PC)必須轉(zhuǎn)換成活化的蛋白細(xì)胞(APC)才發(fā)揮抗凝作用減低:見于先天或獲得性PC缺乏癥,后者鑒于DIC、肝病,血栓與止血檢測,血漿凝血酶時(shí)間,參考值,1618s,受檢TT值延長超過正常對照3s以上為延長,臨床意義,延長見于:低(無)纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥;血中FDP增高(如DIC);血中有肝素或類肝素物質(zhì)存在(如肝素治療中、SLE和肝臟疾病等。)縮短:高FIB血癥鈣離子存在時(shí)或標(biāo)本有微小凝結(jié)塊及PH呈酸性,抗凝血酶-3(AT-),AT-是一種單鏈糖蛋白,屬于2球蛋白,主要由肝臟合成。AT-是依賴肝素的絲氨酸蛋白酶抑制物,故肝素作用于AT-的賴氨酸殘基,可使AT-的抗凝血酶作用增強(qiáng)1000倍。AT-除對凝血酶有抑制作用外,對Xa、a、a、a、纖溶酶(血漿素),胰蛋白酶也有抑制作用,而且它對因子a的親和力大于凝血酶,所以對因子,抗凝血酶-3(AT-),AT-活性增高:見于某些出血性疾病,如血友病、再生障礙性貧血、心瓣膜?。ㄐ牧λソ吒文[大者)AT-活性增高。腎臟疾病尿毒癥腎移植后12年內(nèi)個(gè)別AT-活性不增高者可因肺栓塞而死亡。服肝素類抗凝藥物后,AT-的活性會(huì)增高,停藥后即可恢復(fù)正常AT-活性減低:見于彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、肝硬化、敗血癥、血栓形成性疾?。ㄐ募」H?,靜脈血栓形成等),先天性AT-缺陷,口服避孕藥.動(dòng)態(tài)觀察血中AT-含量的變化對監(jiān)護(hù)治療效果及了解預(yù)后情況均是有力的依據(jù),(三)纖維蛋白溶解功能檢測,1.纖溶酶原測定(PLG)增高表示纖溶活性見于血栓前狀態(tài)和血栓降低表示纖溶活性見于原發(fā)繼發(fā)纖溶和PLG缺乏2.纖溶酶纖溶酶抑制物復(fù)合體(PIC)能較快地反映纖溶活性(PIC半衰期6h),體內(nèi)纖溶情況的指標(biāo)3.血漿硫酸魚精蛋白副凝試驗(yàn)(3p試驗(yàn))了解血中FDP.FM.尤其是X片段存在4.D二聚體測定(D-dimer)鑒別原發(fā)性、繼發(fā)性纖溶癥重要指標(biāo)5.纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)纖溶亢進(jìn)的標(biāo)志,D-dimers檢測臨床應(yīng)用,深靜脈血栓(DVT)和肺栓塞(PE)活動(dòng)性深靜脈血栓形成肺栓塞時(shí),血漿D-D顯著升高;而陳舊性靜脈血栓,D-D往往不增高;動(dòng)脈血栓性疾病,如冠心病,動(dòng)脈硬化等,D-D增高不如靜脈血栓顯著。排除肺栓塞(PE)D-D總體敏感性90-95%,特異性(45%68%),值得納入診斷標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)D-D陰性,臨床上中低度可疑PE,并且V/Q造影不確定的患者,可不再進(jìn)一步檢查。,D-dimers檢測臨床應(yīng)用,彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)和凝血因子消耗繼發(fā)的纖溶(與膿血癥,腫瘤,燒傷,先兆子癇等相關(guān))纖溶治療,D-dimers檢測臨床應(yīng)用,D-二聚體不增高見于:原發(fā)性纖溶癥時(shí),D-二聚體不增高,是與繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)的鑒別要點(diǎn)。陳舊性血栓形成時(shí),D-二聚體不增高。短時(shí)間內(nèi)的D-二聚體改變,常見于藥物應(yīng)用后。,血栓與止血檢測,血漿纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物測定,參考值,小于5mg/L,臨床意義,增高見于:原發(fā)性纖溶癥、DIC、惡性腫瘤、急性早幼粒細(xì)胞白血病、肺梗塞、DVT、肝臟疾病等。判定纖溶發(fā)展的階段監(jiān)測外科手術(shù)是否使器官陷于纖溶酶原活化的高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài),D-dimers與FDP聯(lián)合應(yīng)用的意義,1)DIC的診斷:原發(fā)性纖溶亢進(jìn)時(shí),由于無血栓形成,F(xiàn)DP顯著升高,D-D一般不增高;繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)時(shí),血漿D-D顯著升高,二者聯(lián)合檢測有利于提高DIC實(shí)驗(yàn)室診斷的靈敏度和特異性,尤其對早期DIC的診斷更有意義2)溶栓治療的監(jiān)測:溶栓治療深靜脈血栓或急性腦梗后2天內(nèi)D-dimers增高23倍,但FDP升高1013倍,以后逐漸下降;到7天時(shí),D-D已低于溶栓前水平,但FDP仍比溶栓前高5倍。,(四)凝血和抗凝血功能篩選指標(biāo),1、凝血時(shí)間測定(CT)2、活化部分凝血活酶時(shí)間測定(APTT)3、血漿凝血酶原時(shí)間測定(PT)4、血漿纖維蛋白原測定(Fbg)5、復(fù)鈣交叉試驗(yàn)(CRT)輕癥時(shí)過篩試驗(yàn)可陰性,(五)纖溶活性檢查的篩選試驗(yàn),1、優(yōu)球蛋白溶解試驗(yàn)(ELT)2、血漿凝血酶時(shí)間(TT)3、血漿硫酸魚精蛋白副凝集試驗(yàn)(3P)4、血漿纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物測定(FDP)5、D-二聚體檢測,血栓與止血檢測,血小板檢測,(一)血小板計(jì)數(shù)(PC或plt),參考值,(100300)109/L,臨床意義,1。血小板減少:PC低于100109/L稱為血小板減少。常見于:,血小板生成障礙,血小板破壞或消耗過多,血小板分布異常,血栓與止血檢測,2。血小板增高:PLT高于400109/L稱為血小板增多。常見于:,原發(fā)
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