（植物學(xué)專業(yè)論文）無融合生殖龍須草的細胞學(xué)和遺傳學(xué)研究.pdf

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書 學(xué)位論文 否 如需保密，解密時間年月日 是否保密 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成 果盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā) 表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書 而使用過的材料，指導(dǎo)教師對此進行了審定與我一同工作的同志對本研究所做的任 何貢獻均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意 研究生簽名：孑，j 傳夕屯 時間：立刪解占月) 驢日 學(xué)位論文使用授權(quán)書 本人完全了解“華中農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定”，即學(xué)生必須按 照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印刷版和電 子版，并提供目錄檢索和閱覽服務(wù)，可以采用影印縮印或掃描等復(fù)制手段保存，匯 編學(xué)位論文本人同意華中農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表傳播學(xué)位論 文的全部或部分內(nèi)容。 注：保密學(xué)位論文在解密后適用于本授權(quán)書 學(xué)位論文作者筌名：孑，1 百考旁b 導(dǎo)師簽名： 蝴弋滲影舍 竺名日期：如口6 年占月勁日 筌名日期： 加# 年6 月日 注：請將本表宜接裝訂任尹俺論文的扉頁手【l 目錄之日】 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究論文 摘要 龍須草( e u l a l i o p s i s6 覷口紀) 為禾本科新發(fā)現(xiàn)的一種無融合生殖植物。本研 究通過根尖細胞染色體制片技術(shù)，確定龍須草體細胞染色體數(shù)目。通過分析龍須 草核型和觀察花粉母細胞減數(shù)分裂過程中染色體行為與變異，判斷其倍性水平和 多倍體類型。以來自于中國5 個省、1 2 個居群的龍須草為材料，通過r a p d 分 子標記和形態(tài)學(xué)特征觀察，分析1 2 個龍須草居群間的遺傳差異，劃分出不同的 類型。通過遺傳差異較大的龍須草類型間雜交，利用r a i d 分子標記，檢測子 代與親本的差異，分析其無融合生殖程度，探明子代的生殖來源；并結(jié)合傳粉生 物學(xué)觀察，研究龍須草無融合生殖的遺傳學(xué)特性 主要研究結(jié)果如下： 1 ) 對湖北丹江，湖南衡陽，河南內(nèi)鄉(xiāng)、西峽，陜西山陽5 個居群的龍須草 的根尖細胞染色體進行檢測，每個居群觀察3 0 個以上根尖，每個根尖觀察1 0 2 0 分散良好的中期細胞，取其平均值作為根尖細胞染色體數(shù)目。五個居群共觀察 3 2 6 個根尖，其中3 0 8 個根尖細胞染色體為4 0 條，占9 4 4 7 ，因此龍須草體細 胞染色體數(shù)目為4 0 ，即2 1 1 = 4 0 。觀察中發(fā)現(xiàn)有1 8 個根尖細胞染色體數(shù)日多于或 少于4 0 ，有8 0 、6 0 、3 0 和2 0 等，還有一些根尖細胞具有非整倍染色體數(shù)，這 些占觀察根尖數(shù)的5 5 3o 4 0 。這一結(jié)果表明：龍須草根尖細胞染色體存在一定的自 然變異，種群中可能存在不同倍性的個體。所觀察的幾個龍須草居群的根尖細胞 染色體數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯差異 2 ) 龍須草核型分析結(jié)果顯示：龍須草染色體形態(tài)較小，平均絕對長度為 3 8 2 0 + 0 4 1 5pm ，四個居群的龍須草在染色體形態(tài)特征上沒有顯著差異龍須 草4 0 條染色體相對長度每兩條相似，2 0 對染色體，除了第6 對和第1 1 對為近 中部著絲粒染色體外，其余1 8 對都為中部著絲粒染色體，表現(xiàn)出較高的對稱性， 臂指數(shù)( n f ) 為8 0 。最長的染色體與最短的染色體長度比為2 6 3 5 6 ，大于2 ： l 的比值，且沒有臂比大于2 ：i 的染色體，根據(jù)s t e b b i n ( 1 9 7 1 ) 的核型分類標 準，龍須草的核型為l b 型。用染色體分析軟件計算出的核型參數(shù)，得出其核型 公式為2 n = 4 0 = 1 8 m + 2 s m 。 3 ) 龍須草花粉母細胞減數(shù)分裂為連續(xù)型胞質(zhì)分裂，終變期染色體構(gòu)型為 劉傳虎；無融合生殖龍須草的細胞學(xué)和遺傳學(xué)研究 2 0i i 。在其減數(shù)分裂過程中觀察到一些異?，F(xiàn)象，前期i 出現(xiàn)不配對染色體，頻 率為3 4 3 ；后期i 出現(xiàn)落后染色體，變幅為1 3 個，頻率為3 2 4 ：末期i i 四分體時期可觀察到明顯的微核現(xiàn)象，頻率為2 0 。 4 ) 利用r a p d 分子標記和形態(tài)特征觀察，分析研究了中國1 2 個龍須草居 群的遺傳差異，1 6 個寡聚核苷酸引物擴增共得到1 2 4 條帶，其中1 1 0 條為多態(tài) 性帶，占8 8 7 。s h a n n o n 多樣性指數(shù)( ，) 為0 3 5 9 0 ，物種水平n e i s 基因多 樣度( h ) 為0 2 2 4 1 。1 2 個龍須草居群的遺傳相似系數(shù)在0 4 8 0 9 9 之間。1 2 個居群的龍須草在植物體莖桿顏色、葉片顏色、生育期、莖高和花梗高度等形態(tài) 特征上存在一定差異。聚類結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，1 2 個龍須草居群可劃分 為4 類，河南、湖北、陜西山陽的9 個居群聚為1 類，陜西洋縣居群、廣東星子 山居群，廣西百色居群各代表1 類。 5 ) 通過遺傳差異較大的龍須草類型間雜交，獲得雜交種子萌發(fā)后，得到 4 6 株f l 代。利用r a p d 分子標記，檢測子代與親本的差異，發(fā)現(xiàn)其中3 株f l 代與其母本帶型不一致。龍須草傳粉過程觀察結(jié)果表明，其萌發(fā)的花粉管生長速 度緩慢，而且生長有限，基本上沒有能夠到達子房進入胚珠的。分析認為龍須草 無融合生殖程度較高，約9 3 5 。 本課題研究確定了龍須草為異源四倍體植物，具有4 0 條染色體。把來自5 個省的1 2 龍須草居群劃分成4 種類型：類型i 為河南、湖北、陜西山陽等9 個 居群；類型為廣東星子山居群；類型為陜西洋縣居群；類型為廣西百色居 一群。利用r a p d 分子標記檢測了龍須萆4 6 株雜交f 1 代，其中3 株來自有性生 殖方式，確定龍須草為兼性無融合生殖植物。 關(guān)鍵詞：龍須草；無融合生殖；細胞學(xué)；r a p d ；遺傳學(xué) 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究論文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h en u m b e ro fc h r o m o s o m e si ne b m a mw a si n v e s t i g a t e db yt h e r o o tl i ps q u a s hm e t h o d ，i t sp l o i d yw a sa n a l y z e db yt h ek a r y p t y p ea n dc l l r o m o s o m e s b e h a v i o ro ft h ep o l l e nm o t h e rc e l l sm e i o s i s g e n e t i cd i v e r s i t yi n1 2p o p u l a t i o n so f a p o m i c t i ce u l a l i o p s i sb m a m w a se v a l u a t e db ym o r p h o l o # c a lo b s e r v a t i o na n dr a p d a n a l y s e ，a sar e s u l t , 1 2p o p u l a t i o n so fk b m a 以w e r ed i v i d e di n t od i f f e r e n tt y p e s i n o r d e rt os t u d ye l a l i o p s i s6 歷口缸g e n e t i c sc h a r a c t e r i s t i c , c o m b i n i n gw i t hp o l l i n a t i o n b i o l o g y , w ea n a l y s e dt h eo r i g i no fc r o s s b r e e do f f s p r i n gb yr a p di nd i f f e r e n tt y p e s w i t hs i g n i f i c a t i v ed i v e r s i t ya n df u r h t e rd i s c u s s e di t sd e f e eo fa p o m i x i s 1 1m o r et h a n3 0r o o tt i p si ne a c ho fp o p u l a t i o n so fe b i n a t aw e r eo b s e r v e d , s e p a r a t e l y , a n d1 0 - 2 0c e i l sw i t hd i s p e r s i v em e m p h a s ec h m m o s o m ew e r es t a t i s t i c ， t h e r e b yo b t a i n i n gt h ea v e r a g en u m b e ro fc h r o m o s o m e si nr o o tt i p s i no n es t u d yo f 3 2 6r o o tt i p s ，3 0 8c o n t a i n e d4 0c h l o m o s o m e sa n d1 8h a dv a r y i n gn u m b e ro f c h r o m o s o m ei neb i n a t a ，f o re x a m p l e ，s o m ec o n t a i n8 0 ，6 0 , 3 0 , 2 0c h r o m o s o m e s ， r e s p e c t i v e l y , w h i l et h eo t h e r sa p p e a r e da n e u p l o i d t h e r e f o r e ，w ep r o p o s e dt h a tt h e s o m a t i cc e l l so feb m a mc o n t a i n e d4 0c h f o m o s o m e s ( 2 n = 4 0 ) f u r t h e r m o r e ，i tw a s n o t e dt h a t , f e ws i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gt h o s ep o p u l a t i o n sw a sf o u n di neb m a m ， a l t h o u g hs o m en a t u r a lm u t a t i o n se x i s ti nt h er o o t 卻c e l l so feb i n a t a ，i n d i c a t i n ga f e wi n d i v i d u a l sw i t hd i f f e r i n gp l o i d yi neb i n a t a 2 1t h er e s u l t so fk a r y o t y p ea n a l y s i sp r e s e n t e dt h em o r p h o l o g yi nc h r o m o s o m e s w a s r e l a t i v e l ys m a l la n dt h ea v e r a g ea b s o l u t el e n g t hi ne b m a mw a s3 8 2 0 _ + 0 4 1 靴m t h e6 t ha n dl l s tc h r o m o s o m e sb e l o n g e dt os u b m i d d i ec e n t r o m e r e ，w h e r e a s e ，t h e o t h e rc h r o m o s o m e sa t t r i b u t e dt om i d d l ec e n t r o m e r e ，p r e s e n t i n gr e l a t i v e l yh i 曲 s y m m e t r y , m o r ep r e c i s e l y , t h en o m b r cf o n d a m e n t a l ( n e ) i s8 0 p l u s ，w ef o u n dt h a t t h er a t i o ( t h el e n g t ho ft h e l o n g e s tc h r o m o s o m e t h el e n g t h o ft h es h o r t e s t c h r o m o s o m e ) w a s2 6 3 5 6 ，w h i c hw a sm o r et h a n2 1 ，a n da l lc h r o m o s o m c a n nr a t i o s w e r en o tm o r et h a ni 2 a c c o r d i n gt ot h es t a n d a r df o rc l a s s i f y i n gc h r o m o s o m e k a r y o t y p c ，e s t a b l i s h e db ys t e t b b i n ，t h ek a r y o t y p eo fe b m a mb e l o n g e dt ot y p ei b ， a n dt h ef o r m u l ao fk a r y o t y p ei neb i n a t aw a s2 n = 4 0 = 1 8 m + 2 s m ，d e p e n d i n gu p o nt h e d a t ad e r i v e df r o mk a r y o t y p ep a r a m e t e r s 3 劉傳虎：無融合生殖龍須草的細胞學(xué)和遺傳學(xué)研究 3 ) t h em e i o s i si neb i n a t au n d e r g o e ss u c c e s s i v ec y t o k i n i s i s ，a n d2 0b i v a l e n t s a p p e a r e da td i a k i n e s i s f u r t h e r m o r e ，i nt h i ss t u d y , s o m ea b n o r m a lp h e n o m e n aw e r e o b s e r v e d ：s o m eu n p a v e dc h r o m o s o m e sw i t ha3 4 3 f r e q u e n c ya p p e a r i n ga t m e t a p h a s ei o n eo rt h r e el a g g i n gc h r o m o s o m e sw i t ha3 2 4 f r e q u e n c yo b s e r v e da t a n a p h a s eia n dt h eo c c u r r e n c eo f m i c r o n u c l e iw a sd e t e c t e di no n eo ff i v ec e u sd u r i n g t h et e 仃a dp e r i o d 鍆g e n e t i cd i v e r s i t yi n1 2w i l dp o p u l a t i o n so fa p o m i c t i ceb i n a t aw a se v a l u a t e d b ym o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n dr a p da n a l y s e 1 2 4l o c iw e r ei n d e n t i f i e dw i t h1 6 o l i g o n u c l e o - t i d ep l i m e r s ，o u to fw h i c h1 1 0l o c iw e r ep o l y m o r p h i ca n da c c o u n tf o r 8 8 7 s h a n n o n si n d i c e so fd i v e r s i t y - - 0 3 5 9 0 n e i sg e n ed i v e r s i t yh = 0 2 2 4 1a t s p e c i e sl e v e l t h eg e n e t i cs i m i l a r i t yc o e f f i c i e n ti n1 2w i l dp o p u l a t i o n so fe b i n a t a v a r i e df r o m0 4 8t 0o 9 9 t h e1 2p o p u l a t i o n so fe b i n a t ac o u l db ed i v i d e di n t of o u r t y p e sa c c o r d i n g t ot h e i r c l u s t e r i n ga n a l y s i s a n dm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s n i n e p o p u l a t i o n sf r o mh e n a n , h u b e ia n ds h a n x id i s p l a y e dh i g hs i m i l a r i t ya n d b ec l u s t e r e d i n t oo n et y p e ，w h i l et h eo t h e r3p o p u l a t i o n sf r o my a n g x i a ns h a n x i ，b a i s eg u a n g x i a n dx i n g z ig u a n g d o n gr e s p e c t i v e l ys h o w e dg r e a td i f f e r e n c e sa n dc o u l db ed i v i d e d i n t oi s o l a t e dt y p e 5 1t h ec r o s sw e r eu n d e r d o n ei nd i f f e r e n tt y p e sw i t hs i g n i f i c e n td i v e r s i t y , a n d4 6 f 1w e r eo b t a i n e da f e r tt h ec r o s s s e e dg e r m i n a t e d t h ed i f f e r e n c e sb e w e e np a r e n t s a n d o f f s p r i n g sw e r ei n v e s t e d , a sar e s u l t 3 f 1w e r en o ti d e n t i c a lw i t ht h e i rp a r e n t si n s t r i p s t h er e s u l t so fp o u i t i o np r o c e s ss h o w e dt h eb u r g e o n e dp o u e n - t u b e sg r o w e d s l o w l y , a n dt h eg r o w t hi sl i m i t e dt oo v a r yo ro v u l ei neb i n a t a s ot h ed g r e eo f a p o m i xi sv e r yh i g l li ne b i n a t a ，a p p r o x i m a t e l y9 3 5 t h er e s u l ms h o w e dt h a teb i n a t ai sah e t e r o t e t r a p l o i d p l a n tw i t h 4 0 c h r o m o s o m e s t h e1 2p o p u l a t i o n so fe b i n a t ac o u l db ed i v i d e di n t of o u rt y p e s ：n i n e p o p u l a t i o n sf r o mh e n a n ，h u b e ia n ds h a n x i ( t y p ei ) ，x i n g z ig u a n g d o n g ( t y p ei i ) ， y a n g x i a ns h a n x i ( t y p e l i i ) ，b a l s eo u a n g x i ( t y p e l v ) t h eg e n e t i cr e s u l t ss h o w e dt h e e b i n a t ai sf a c u l t a t i v ca p o m i x i sp l a n t k e y w o r d s ：e u l a l i o p s i sb i n a t a ；a p o m i x i s ；c y t o l o g y ；r a f d ；g e n e t i c s 4 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究論文 第一章課題的提出與文獻綜述 1 課題的提出及研究的目的和意義 無融合生殖是一種特殊的生殖方式，它避免減數(shù)分裂和受精過程，由母體胚 胎組織通過無性途徑形成種子。無融合生殖對于提高作物種質(zhì)是一個有誘惑力的 性狀，由它可介導(dǎo)形成大量遺傳上一致的種群并且可以繼承上一代的雜種優(yōu)勢。 無融合生殖在育種上具有許多農(nóng)藝學(xué)的優(yōu)勢；迅速的產(chǎn)生和繁殖優(yōu)勢性狀的種 子；減少育種的資金與時間；避免了有性生殖相關(guān)的復(fù)雜性問題，比如授粉和雜 交的兼容性；也避免了在營養(yǎng)繁殖中非常典型的病毒傳遞，如馬鈴薯( h a n n a ， 1 9 9 5 ；k o l t u n o we ta 1 。1 9 9 5 ；j e f f e r s o ne ta 1 ，1 9 9 6 ；s a v i d a n ，2 0 0 0 ) 。而令 人遺憾的是迄今在栽培作物中尚未發(fā)現(xiàn)可直接利用的無融合生殖材料。因此在作 物育種和種子生產(chǎn)中，利用無融合生殖的策略有：1 ) 發(fā)掘和利用作物近緣無融 合生殖物種，通過有性雜交向作物轉(zhuǎn)育無融合生殖特性；2 ) 定位和分離自然的 專性或高度無融合生殖基因，利用基因工程將其轉(zhuǎn)移到作物中( k o l t u n o w ，1 9 9 5 ； k o l t t m o we ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 禾本科植物龍須草( e u l a l i o p s i sb i n a t a ) 是一種優(yōu)質(zhì)的造紙原料植物和優(yōu)良的 水土保持植物( g u p t a ，1 9 8 4 ；王清鋒，1 9 9 3 ：張友德等，1 9 9 3 b ) ，并且是高光 效( “植物) 植物( 張友德等，1 9 9 4 b ，1 9 9 4 a ；鄒冬生等，2 0 0 0 a ) 。更有意義 的是近年來發(fā)現(xiàn)其具有無融合生殖現(xiàn)象( 張友德等，1 9 9 6 5 。中國作為龍須草的 物種起源地和主要的自然分布區(qū)，有豐富的龍須草資源( 南京大學(xué)生物系，中國 科學(xué)院植物研究所，1 9 5 9 ；劉亮，1 9 9 4 ) 。由于龍須草的經(jīng)濟價值有限，對這種 野生植物的研究僅局限于形態(tài)結(jié)構(gòu)、栽培管理、生態(tài)作用、造紙性能等方面。近 年來楊小菊、姚家玲等人的研究，證明龍須草為無融合生殖植物( 楊小菊等，1 9 9 8 ： y a o 等，2 0 0 4 ) 。姚家玲等利用a f l p 分子標記技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察和葉片 纖維素等成分含量的測定，將來自湖北武當、鄖縣，河南淅川、西峽，廣西白色， 陜西洋縣等4 個省的龍須草居群劃分為4 種生態(tài)型：窄葉類型( 湖北) 、濃綠葉 類型( 廣西) 、紅桿類型( 陜西) 、寬葉類型( 河南) ( 姚家玲等，2 0 0 4 ) 。陳智慧 等在此基礎(chǔ)上，對窄葉型和紅桿型龍須草花粉活性及結(jié)實率與其無融合生殖的關(guān) 系研究中發(fā)現(xiàn)，龍須草花粉對其種子形成沒有實質(zhì)性貢獻，龍須草具有很高的無 5 劉傳虎：無融合生殖龍須草的細胞學(xué)和遺傳學(xué)研究 融合生殖程度，是優(yōu)良的無融合生殖基因供體( 陳智慧等，2 0 0 5 ) 。但對龍須草 種質(zhì)資源及遺傳多樣性、細胞學(xué)、遺傳規(guī)律等研究十分缺乏。鑒于被子植物中無 融合生殖植物的稀少和寶貴，以及無融合生殖研究的重要理論和實踐意義。本研 究通過根尖壓片確定其體細胞染色體數(shù)目，分析其核型和花粉母細胞減數(shù)分裂過 程中染色體的行為和變異，判斷龍須草的倍性水平和多倍體類型，檢測龍須草種 群內(nèi)是否存在不同倍性的個體，為進一步研究不同倍性個體間的生殖方式、遺傳 特點提供細胞學(xué)資料，同時也為其種質(zhì)資源的研究鑒定和系統(tǒng)進化提供細胞學(xué)依 據(jù)；從前期的分子標記結(jié)果來看，分布于我國的龍須草物種內(nèi)至少存在不同的類 型，表明龍須草的系統(tǒng)分類和種內(nèi)遺傳多樣性有必要深入研究。本實驗擴大了國 內(nèi)龍須草主要分布區(qū)的資源收集，共采集5 個省份的1 2 個自然分布區(qū)居群( 湖 北鄖西、鄖縣、楊溪鎮(zhèn)、丹江口、涼水河，河南內(nèi)鄉(xiāng)、淅川、西峽，陜西洋縣、 山陽，廣西百色、廣東星子山等) ，利用k a p d 分子標記和形態(tài)學(xué)觀察，分析居 群問的遺傳差異，并劃分出不同的類型，為遺傳學(xué)研究提供依據(jù)，同時為其系統(tǒng) 分類提供分子水平的參考；以不同類型的龍須草為材料，通過田間雜交試驗，檢 測子代與親本的遺傳差異，分析龍須草的無融合生殖程度，為迸一步研究龍須草 無融合生殖遺傳規(guī)律和分子機理，為定位、克隆無融合生殖基因奠定基礎(chǔ)。同時 對其它材料的無融合生殖研究也有一定的借鑒作用 2 龍須草的研究現(xiàn)狀 龍須草( e u l a l i o p s i sb i n a t a ) 俗稱蓑衣草，羊胡子草，羊草等，屬禾本科 ( g r a m i n e a e ) 黍亞科( s u m a mp a n i c o i d e a e ) 甘蔗族( t r i bs a c c h a r e n e ) 楔穎草 亞族( s u b 礦i b a p o c o p i d i n a e ) 擬金茅屬( e u l a l i o p s 婦h o n d a ) ，多年生高光效纖維 草本植物，分蘗能力很強( 耿以禮，1 9 6 5 ；劉亮，1 9 8 8 ) 。主要分布于印度、伊 朗、菲律賓、越南、緬甸等東南亞及中亞地區(qū)，中國也是龍須草的主要分布區(qū)之 一。龍須草主要生長于我國秦嶺以南地區(qū)，湖北西北部，湖南南部、西南部，廣 西西南部，西部，西北部，云南大部分地區(qū)，廣東連洲地區(qū)，貴州的黔南、黔東 南、黔西南及安順、銅仁地區(qū)，四川東部、東北部、南部，陜西漢中、安康地區(qū) 及河南南陽地區(qū)廣有分布( 劉亮，1 9 9 4 ) 。龍須草作為一種優(yōu)質(zhì)的造紙原料、良 好的編織材料和優(yōu)良的水土保持植物( 陳之倫，1 9 9 0 ；張友德等，1 9 9 3 a ) ，8 0 6 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究論文 年代后逐漸有人對其栽培管理、形態(tài)解剖，生理活性、開花習(xí)性、及分蘗規(guī)律等 進行了研究( 張友德等，1 9 9 3 b ；張友德等，1 9 9 4 a ；張友德等，1 9 9 4 b ) 。近年來， 張友德、楊小菊等對窄葉型龍須草進行了初步的胚胎學(xué)研究，認為其成熟胚囊是 4 細胞大黍型無孢子生殖胚囊( 張友德等，1 9 9 6 ；楊小菊，1 9 9 8 a ) 。此后，姚家 玲等對窄葉型龍須草和紅桿型龍須草大孢子的發(fā)生，胚囊的起源，發(fā)生和發(fā)育， 胚的起源，胚乳的產(chǎn)生等過程進行了系統(tǒng)研究，得到了龍須草無融合生殖的證據(jù)， 探明了龍須草胚和胚乳的發(fā)育可以不經(jīng)過受精而分別由卵細胞和極核自發(fā)分裂 形成；并對其龍須草的花粉發(fā)育過程進行了觀察，其雄性配子的發(fā)育過程類似于 其它有性生殖的禾本科植物，最后形成3 細胞型成熟花粉粒( 楊平仿，2 0 0 2 ；y a o j i a - l i n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 。姚家玲等利用a f l p 分子標記技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察 和葉片纖維素含量、成分等的測定，將龍須草劃分為4 種類型：窄葉類型、，濃綠 t 葉類型、紅桿類型和寬葉類型( 姚家玲等，2 0 0 4 ) 。陳智慧等對窄葉型和紅桿型 龍須草花粉活性及結(jié)實率與其無融合生殖的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，龍須草花粉對其種 子形成沒有實質(zhì)性貢獻，龍須草具有很高的無融合生殖程度，是優(yōu)良的無融合生 殖基因供體( 陳智慧等，2 0 0 5 ) 。有關(guān)龍須草的系統(tǒng)分類學(xué)研究資料較少，中國 高等植物圖鑒和中國植物志以及劉亮在其禾本科黍亞科的分類系統(tǒng)中，描述擬金 茅屬只有龍須草一個種類( 耿以禮；1 9 6 5 劉亮，1 9 8 8 ) 。但印度學(xué)者s u r ( s u r ， 2 0 0 1 ) 對擬金茅屬的修訂中指出這個屬內(nèi)有三個種，分別是：e u l a l i o p s 括b i n a t a ( r e t z ) c e h u b b ；ed u t h i e is u r ；es y k e s i ib o r 。他認為這三個種在印度都有 分布，在中國大陸、中國的臺灣地區(qū)和菲律賓群島的龍須草自然分布區(qū)只有e b i n a t a 這一個種類。此外，與植物無融合生殖密切相關(guān)的細胞學(xué)研究，如龍須草 的染色體數(shù)目、核型特點和倍性水平等細胞學(xué)資料尚處空白。 目前有關(guān)龍須草的研究結(jié)果表明，龍須草為無融合生殖植物，且某些居群無 融合生殖程度較高，接近專性，而關(guān)于龍須草種質(zhì)資源鑒定和種內(nèi)遺傳多樣性、 細胞學(xué)、遺傳規(guī)律等研究十分缺乏，限制了對龍須草無融合生殖機理的深入研究 和實際應(yīng)用。 7 劉傳虎；無融合生殖龍須草的細胞學(xué)和遺傳學(xué)研究 3 植物無融合生殖研究概況 3 1 植物無融合生殖的概念和類型 無融合生殖是相對于有性生殖的雌雄配子融合而言，廣義的無融合生殖 ( a p o m i x i s ) 是指不經(jīng)過雌雄配子的融合而繁衍后代的生殖方式，對被子植物來 說是指在胚珠內(nèi)不發(fā)生受精作用而產(chǎn)生種子的生殖方式。植物中的無融合生殖曾 經(jīng)是個很廣泛的概念，m a h e s h w a r i ( m a h c s h w a r i ，1 9 5 0 ) ) 將包括營養(yǎng)繁殖所有 的無性繁殖都歸在無融合生殖的范疇內(nèi)，后來b a t t a g l i a ( b a t t a g l i a ，1 9 6 3 ) 定義 無融合生殖只限定為發(fā)生胚珠內(nèi)的、不經(jīng)過受精作用而形成種子的生殖方式。胡 適宜( 胡適宜，1 9 8 1 ) 則將由珠心等體細胞經(jīng)過胚胎發(fā)育形成的不定胚也歸在無 融合生殖的范疇。雖然對無融合生殖的確切定義研究者們一直都存在爭論，但從 實際應(yīng)用價值及其對作物改良的意義出發(fā)，目前植物中無融合生殖一般專指二倍 體無融合生殖，是一種發(fā)生在胚珠內(nèi)的不經(jīng)過減數(shù)分裂和受精作用形成胚( 種子) 的生殖方式，根據(jù)生殖中是否有胚囊形成，分為配子體無融合生殖和孢子體無融 合生殖，而配子體無融合生殖包括無孢子生殖和二倍體孢子生殖，孢子體無融合 生殖是指不定胚生殖( n o g l c r ，1 9 8 4 a ；a s k e r ，1 9 9 2 ；k o l t u n o w ，1 9 9 3 ) 3 2 植物無融合生殖的細胞學(xué)研究及多倍體化 植物的無融合生殖跟植物的倍性水平有著特殊的關(guān)系。通常配子體無融合生 殖跟高倍性有關(guān)，在自然界很少有能進行配子體無融合生殖的二倍體植物，而進 行配予體無融合生殖的草本植物則都是多倍體的( a s k e r ，1 9 9 2 ) 。雀稗屬8 0 以上的種是多倍體，這些多倍體種群中約5 0 是四倍體種群，且基本上都具無 融合生殖現(xiàn)象( q u a r i n ，1 9 9 6 ) 。在雀稗屬普通種百喜草( b a h i a g r a s s , p a s p a l u m n o t a t l t m2 n = 4 x = 4 0 ) 具無孢子生殖方式，與此對應(yīng)的二倍體p a s p a l u mn o t a t u m v a r s a u r a e ( 2 n = 2 x = 2 0 ) 則是有性生殖種，而當它用秋水仙素加倍后，有三分之二的 后代具兼性無融合生殖特性，這也說明二倍體植物也具有無融合生殖基因，但它 的表達有倍性依賴性( c a m i l ol e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。禾本科是被子植物中包含無融合 生殖種類最多的科( a s k e r ，1 9 9 2 ；a n n a 。u e l i ，2 0 0 3 ：b r y s t i n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 黃群策等( 黃群策，1 9 9 9 ；馬國華，2 0 0 1 ) 總結(jié)出禾本科4 2 屬1 6 6 種植物為無 融合生殖植物，且都為多倍體，其中3 2 個屬1 0 2 個種類為無孢子生殖類型。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究論文 對無融合生殖植物多倍體化問題不同學(xué)者有不同的認識。一種認為無融合生 殖的理想表達只能與多倍體的染色體組存在相關(guān)聯(lián)( q u a r i n ，2 0 0 1 ；r o o d t ，s p i e s ， 2 0 0 3 ) ，因為很少二倍體配子體無融合生殖的植物被報道，且一些有性生殖植物 染色體加倍后出現(xiàn)無融合生殖體( c a m i l ol e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。但大量的誘導(dǎo)產(chǎn)生的 多倍體植物并未發(fā)現(xiàn)無融合生殖現(xiàn)象，相反的事例是a s k e r 所描述的無融合生殖 植物p o t e n t i l l a 口，苫研細染色體加倍后恢復(fù)了有性生殖( a s k e r ，1 9 9 2 ) 。由此一些 學(xué)者認為多倍體并不一定是無融合生殖表達的必要條件，多倍體也許只是促進無 融合生殖表達而不是保證無融合生殖性狀的存在( g a l l m m ，1 9 9 9 ) 。有關(guān)無融合 生殖與多倍體化的關(guān)系和機制仍需進一步的研究。 3 3 植物無融合生殖的遺傳學(xué)基礎(chǔ) 自從1 8 4 1 年，s m i t h 首次報道雌、雄異株的三稔菖屬植物a c h o r n e ai l i c i f o l i a 不經(jīng)傳粉產(chǎn)生種子的現(xiàn)象，至今對無融合生殖研究的1 6 0 多年的歷史中，已在 4 0 多個科的4 0 0 多種被子植物中發(fā)現(xiàn)無融合生殖現(xiàn)象。根據(jù)無融合生殖發(fā)生的 程度有專性( o b l i g a t e ) 和兼性( f a c u l t a t i v e ) 之分( c a r m a n ，1 9 9 7 ) 。專性無融合 生殖個體的后代都通過無融合生殖產(chǎn)生，不需經(jīng)過減數(shù)分裂和受精作用，其子代 可以保持遺傳的純合性和穩(wěn)定性。而兼性無融合生殖個體同時具有有性生殖和無 融合生殖能力，有性生殖胚囊和無融合生殖胚囊在同一胚珠中和不同胚珠中共同 發(fā)育，因此兼性無融合生殖個體的后代在遺傳上是不一致的，來自無融合生殖的 后代是純合的母本型，來自有性生殖的是雜合體，其后代會發(fā)生性狀和生殖方式 的分離( a n o n y m o u s ，2 0 0 1 ) 。 在大多數(shù)現(xiàn)在的研究系統(tǒng)中，均報道配子體無融合生殖的遺傳是由一個或少 數(shù)幾個位點進行傳遞的。在進行無孢子生殖的草本植物p e n n i s e t u m ( s h e r w o o d e ta 1 ，1 9 9 4 ) 、p a n i c u m ( s a v i d a n ，1 9 8 3 ) 和b r a c h i a r i a ( l ec ta 1 ，1 9 9 4 ) 中， 其無融合生殖是通過一個顯性基因進行性狀傳遞的簡單遺傳。雙子葉r a n u n c l u n a 科( n o 西e r ，1 9 8 4 b ) 和h i e r a c i u m 科( b i c k n e l le t a l ，2 0 0 0 ) 的一些無孢子生殖 植物無融合生殖性狀也被報道為簡單的顯性遺傳。在二倍體孢予生殖植物中，進 行二倍體孢子生殖的蒲公莢t a r a x a c u m ( v a nd i j ke ta 1 ，1 9 9 9 ) 和e r i g e r o n ( n o y e ， 2 0 0 0 ) 為獨立遺傳，v o i g t 和b u r s o n 報道了進行二倍體孢子生殖的e r a g r o s t i s c u r v l a 為簡單顯性遺傳( v o i ga n db u r s o n ，1 9 8 3 ) 。 9 劉傳虎：無融合生殖龍須草的細胞學(xué)和遺傳學(xué)研究 雖然無融合生殖性狀是由一個基因位點或少數(shù)幾個基因位點控制的觀點已 經(jīng)被大多數(shù)學(xué)者接受，但是在分析遺傳學(xué)數(shù)據(jù)時仍有許多疑問。在上面提到的一 些例子中，無融合生殖的遺傳學(xué)研究都是通過與親緣關(guān)系相近的有性生殖種雜交 并分析的，在這些研究中，無融合生殖的表達常常限制了親本花粉的利用。而且 回交也鮮有報道，并且母性效應(yīng)仍然普遍的沒有被檢測。n o 百e r ( 1 9 8 4 ) 認為無 融合生殖是一個復(fù)合的性狀，應(yīng)該通過后代遺傳產(chǎn)物來進行嚴格的檢測，并輔以 細胞學(xué)研究確認每一個子代的生殖模式，并且評估所有后代的倍性，這些增加了 無融合生殖遺傳分析的困難，也很耗時間( b j c k n e h ，2 0 0 1 ) ，在無融合生殖植物 山柳菊h i e r a c m m 中，并不能確定一些進行孤雌生殖的胚囊是否來源于不減數(shù)的 卵細胞。回顧以往h i e r a c i u m 的研究數(shù)據(jù)，結(jié)合最新的研究結(jié)果，b i c k n e u 認為 控制無融合生殖的位點數(shù)被低估了，它至少表現(xiàn)出三個不連鎖的顯性位點以保證 自發(fā)二倍體無孢子生殖性狀在h i e r a c 缸m 中完整傳遞，而不是只包含一個位點 ( b i c k n e n ，2 0 0 4 ) 。 在解釋一些發(fā)表的無融合生殖遺傳學(xué)數(shù)據(jù)的另一個困難是，這些數(shù)據(jù)往往把 無融合生殖解釋成為質(zhì)量性狀，這個性狀的特點是或者遺傳或者不遺傳。但是無 融合生殖在大多數(shù)的植物中是兼性表達的，并且通過有性生殖產(chǎn)生的種子在親本 個體中變化相當大。遺傳學(xué)研究的一個普遍現(xiàn)象是，f 1 代的無融合生殖的表達 程度比無融合親本低( k o l t u n o we ta 1 ，2 0 0 0 ) ，這個效應(yīng)有很深遠的意義。在對 h i e r a c i u m 的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)f 1 代表達無融合生殖性狀的僅為總種子 數(shù)的5 ，然而在親本中無融合生殖個體要占到9 8 ( b i c k n e uc ta 1 ，2 0 0 0 ) 。這 些現(xiàn)象引發(fā)了對無融合生殖的重新思考，即無融合生殖性狀可能不是簡單遺傳或 者像常常被報道的在自然系統(tǒng)中被簡單控制。 3 4 無融合生殖的細胞學(xué)研究 如前所述，已報道的配子體無融合生殖植物，絕大多數(shù)都是多倍體的，而它 們中有性生殖的個體或近緣有性種類一般是二倍體( a s k e r ，1 9 9 2 ) 。在無融合生 殖研究過程中，無融合生殖植物染色體數(shù)目和倍性的研究，成為篩選和鑒定具不 同生殖方式個體和種類的重要方法，并為無融合生殖遺傳學(xué)研究提供細胞學(xué)資 料。近年來，在無融合生殖研究中隨著新方法和新技術(shù)的發(fā)展，如m a t z k 采用流 式細胞計，檢測了3 2 種專性、兼性無融合生殖和有性生殖的單子葉、雙子葉植 1 0 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究論文 物的成熟種子，甄別其生殖方式，結(jié)果顯示成熟種子中的胚和胚乳細胞的相對c 值很好地反應(yīng)了其生殖方式( m a t z k ，2 0 0 0 ) 。目前流式細胞計在鑒定植物地相對 倍性中，已成為一種快速、簡便且較準確的方法。而傳統(tǒng)的根尖或莖尖壓片和涂 片方法，因其具有直觀和準確等優(yōu)點仍然被廣泛應(yīng)用。 核型分析、帶型分析和花粉母細胞減說分裂終變期染色體構(gòu)型分析成為鑒定 物種倍性水平和多倍體類型的有效手段。 對于細胞中的染色體進行分組，并對每條染色體的形態(tài)特征進行細致的觀測 和描述，即為核型分析( 劉大鈞，1 9 9 9 ) 。染色體核型分析對于細胞遺傳、細胞 分類以及遺傳工程的研究都是十分基本而必要的。目前已經(jīng)對一些經(jīng)濟植物或有 特殊研究和應(yīng)用價值的植物染色體進行了觀察和分析，并制作了一些植物的染色 體圖譜( 利容千，1 9 8 9 ；陳瑞陽等，2 0 0 3 ) 。染色體分帶是2 0 世紀7 0 年代初興 起的一項細胞學(xué)新技術(shù)，它借助特殊的處理程序，使染色體的一定部位顯示出深 淺不同的染色帶紋。這些帶紋具有物種及不同染色體的特異性，每條染色體上帶 的數(shù)目、部位、寬窄、與濃淡具有相對的穩(wěn)定性，從而在以往染色體形態(tài)特征之 外又增添了一類新的標志，可以更有效地鑒別染色體個體性和研究染色體地結(jié)構(gòu) 和功能，且在植物染色體組及物種倍性地判斷中也有著重要意義。 s t e b b l n s 將多倍體分為同源多倍體、異源多倍體、同源異源多倍體和區(qū)段異 源多倍體( s t e b b i n s ，1 9 4 7 ) 。在確定多倍體的類型時，需考慮多倍體供體親本的 染色體構(gòu)型、多倍體雜種后代的染色體配對及育性等因素，而染色體的配對構(gòu)型 和頻率則是主要的判斷依據(jù)。因同源多倍體染色體聯(lián)會不正常，在前期常出現(xiàn)多 價體和單價體體聯(lián)會不正常，如同源四倍體的同源染色體可以在同一時間配對形 成四價體( w ue ta 1 ，2 0 0 1 ) 。而在后期的花粉母細胞中會有染色體落后和微核 現(xiàn)象( 邢少辰等，2 0 0 1 ) ，莊東紅和石田雅士還在柿樹( d i o s p y r o s 腸舡l ) 減數(shù) 分裂中發(fā)現(xiàn)“擬多價體現(xiàn)象”，即幾個二價體重疊或緊挨在一起，這是多倍體減 數(shù)分裂中期i 的特殊現(xiàn)象( 莊東紅等，