（細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)論文）重組日本七鰓鰻口腔腺分泌l250蛋白基因克隆及hrf活性鑒定.pdf

摘要本實驗對日本七鰓鰻( l a m p e 護(hù)aj a p o n i c a ) 腔腺e d n a 文庫1 3 2 3 條有效e s t 序列進(jìn)行分析，得到一條能夠翻譯t c t p 模體的開放閱讀框，據(jù)此設(shè)計引物，以日本七鰓鰻口腔腺總r n a 為模板進(jìn)行r t - p c r 擴(kuò)增，得長為5 1 9 b p 的目的基因，與p e t 2 3 b 載體連接后，在大腸桿菌b l 2 1 中成功表達(dá)，親和層析純化后得到濃度約為1 5 m g m l 的l - 2 5 0 蛋白純品。以獲得的l - 2 5 0 蛋白純品制各多克隆抗體，進(jìn)行免疫印跡實驗，分析抗體與目的蛋白結(jié)合的特異性，同時對表達(dá)的重組蛋白在日本七鰓鰻口腔腺中進(jìn)行定位?；钚詫嶒灡砻鱥 廣2 5 0 蛋白具有組胺釋放因子( h i s t a m i n e r e l e a s i n gf a c t o r , h r f ) 生物學(xué)功能。首先，通過基因工程的手段從日本七鰓鰻口腔腺中獲得了受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白( t r a n s l a t i o n a u yc o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i n ，t c t p ) 的目的基因，克隆至p e t 2 3 b 表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)化入克隆菌d h 5 a 后進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選，之后將帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白在e c o l ib 1 2 1 中進(jìn)行了可溶性表達(dá)，經(jīng)組氨酸親和層析柱純化后，獲取了分子量為2 2 4 k d 的t c t p 純品，將其命名為b - 2 5 0 。以純化的1 - 2 5 0 蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，制備兔抗七鰓鰻血清l - 2 5 0蛋白多克隆抗體，e l i s a 法檢測多克隆抗體效價可達(dá)1 ：6 4 0 0 。以日本七鰓鰻口腔腺分泌物和表達(dá)的重組蛋白純品行s d s p a g e ，采用免疫印跡法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)制各的兔抗七鰓鰻血清1 - 2 5 0 蛋白多克隆抗體能夠與口腔腺分泌物和重組蛋白均發(fā)生明顯的特異性結(jié)合，i - - 2 5 0 蛋白是一種分泌蛋白。采用大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系r b l 廣2 h 3 評價l - 2 5 0 蛋白的h f r 活性。將l - 2 5 0 以不同的濃度梯度( 0 3 ，4 8 ，l o w g m l ) 與r b d - 2 h 3 孵育，結(jié)果表明，l - 2 5 0能夠刺激r b l 2 h 3 釋放組胺，并且在痕量( o 3 , u g m l ) 下就能夠起作用。由此可以推測，組胺作為一種免疫介質(zhì)，七鰓鰻這種寄生性生物可以通過l - 2 5 0蛋白使宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，組胺還能夠引起血管擴(kuò)張效應(yīng)，增強(qiáng)局部血流；另一方面，組胺還能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面凝血酶調(diào)節(jié)素t m 的表達(dá)，凝血酶調(diào)節(jié)素與凝血酶結(jié)合，可降低凝血酶的凝血活性，同時活化蛋白c ，活化的蛋白c 能夠水解凝血因子v a 和a ，并且阻礙凝血因子x a 與血小板的結(jié)合，還能夠促進(jìn)纖維蛋白溶解，這三條通路最終都會抑制凝血反應(yīng)。這為解釋日本七鰓鰻的吸血生活習(xí)性提供了一定的理論依據(jù)，同時，提示l - 2 5 0 蛋白將在臨床抗凝治療方面具有潛在的應(yīng)用價值。關(guān)鍵詞：日本七鰓鰻；受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白；基因工程；組胺釋放因子a b s t r a c tt h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yi st oc l o n et h ec d n as e q u e n c ee n c o d i n gt r a n s l a t i o n a u yc o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i nw h i c hw ec a l l e dl - 2 5 0a c c o r d i n gt ot h ei n f o r m a t i o nf r o mc d n al i b r a r ya n dt h ep r i m a r ya n a l y s i so fe x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ，a n dt od ot h er e s e a r c ha b o u te x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h i sf u n c t i o ng e n ec o n t r i b u t i n gt ob u c c a lg l a n ds e c r e t i o nf r o ml a m p e t r aj a p o n i c a ，p r e p a r a t i o no fp o l y c l o n a ia n t i b o d y , i m m u n o b l o t t i n ga n a l y s i st ol o c a l i z et h er c o m b i n a n tp r o t e i ni nb o c c a lg l a n da n di d e n t i f i c a t i o ni t sa c t i v i t ya sh i s t a m i n e r e l e a s i n gf a c t o r f i r s t l y , t o t a lr n a w a se x t r a c t e df r o mb u c c a lg l a n do f l a m p e t r a j a p o n i c aa n du s e dr t - p c rt og e n e r a t eac d n a ，w es c r e e n e dt h et a r g e tg e n ea n dc l o n e di ti n t ot h ee x p r e s s i n gv e c t o rp e t 2 3 b ，t h e nt h ef u n c t i o ng e n ew a st r a n s f o r m e di n t oec o l is l l a l nb l 2 1f o re x p r e s s i o nu n d e rt h ei n d u c t i o no fi p t g t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sl - 2 5 0w e r ei d e n t i f i e db ys d s p a g ea n dp u r i f i e db yu s i n gt h eh i s b i n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y n cr e s u l t sr e v e a l e dt h a ti th a dm o l e c u l a rw e i g h to f2 2 4k 1 da n dc o n c e n t r a t i o no f1 s m g m l t h ep o l y c l o n a la n t i b o d yw a so b t a i n e db ya n t i g e ni m m u n i z i n ga n i m a l s ，t h ea n t i g e nw a sp r e p a r e df r o mt h ep u r i f i e dl - 2 5 0 , a n dt h ep l o y c o i n a la n t i b o d yw a se x a m i n e di nt h ea n i m a l s s e r u mb yu s i n ge n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y t h es p e c i a l i t yo ft h ea n t i b o d yw a si d e n t i f i e db yt h em e t h o d so fw e s t e r nb l o t t i n g w eo b s e r v e dt h a tt h ep o l y c l o n a ia n t i b o d yc a nr e c o g n i z ep r o t e i nw h i c hw a se x p r e s s e da n dw a si nb u c c a lg l a n ds e c r e t i o nb yi m m u n o b i o t t i n g w ec a nd r a wt h ec o n c l u s i o nt h a tt h es u c c e s s f u le x p r e s s i o no fl - 2 5 0a n dp r e p a r a t i o no fp o l y c l o n a la n t i b o d yw i l lp r o v i d em a t e r i a lf u rf u r t h e rs t u d y h r fb e l o n g st oac l a s so fp r o t e i n sc a l l e dt r a n s l a t i o n a l l yc o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i nh o m o l o g e s w ei d e n t i f yt h ea b i l i t yo fl - 2 5 0t oi n d u c er e l e a s eo fh i s t a m i n eb yu s i n gr a tb a s o p h i l i cl e n k e m i a ( r b l - 2 h 3 ) c e l l s r e s u l t sf r o mt h ep r e s e n ts t u d ys h o wt h a tl - 2 5 0m e d i a t e sh i s t a m i n er e l e a s ef r o mr b l - 2 h 3c e l l s w ea l lk n o wt h a th i s t a m i n em i g h ti n c r e a s ee n d o t h e l i a lw h i c hi sat i s s u ea n t i c o a g u l a n ta n dc e l l - s u r f a c ee x p r e s s i o no ft h r o m b o m o d u l i nm a ym o d u l a t es o m eo fa n t i c o a g u l a t i o nb ya c t i v a t i n gp r o t e i nc g i v e nl - 2 5 0i n d u c e sr e l e a s i n go fh i s t a m i n ea n dh i s t a m i n em a ym o d u l a t ea n t i c o a g u l a n tc a s c a d e ，w es p e c u l a t et h a tl - 2 5 0m a yh a v es o m ep o t e n t i a le f f e c t so na n t i c o a g u l a f i o nt h e r a p y 重組日本七鰓鰻口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及腿f 活性鑒定學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人承諾：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所取得的研究成果。論文中除特別加以標(biāo)注和致謝的地方外。不包含他人和其他機(jī)構(gòu)已經(jīng)撰寫或發(fā)表過的研究成果，其他同志的研究成果對本人的啟示和所提供的幫助，均己在論文中做了明確的聲明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：孫晶日期：2 訂歲一3 學(xué)位論文版權(quán)的使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解遼寧師范大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，及學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交復(fù)印件或磁盤，允許論文被查閱和借閱。本文授權(quán)遼寧師范大學(xué)，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密的學(xué)位論文在解密后使用本授權(quán)書。學(xué)位論文作者簽名：亂晶指導(dǎo)教師簽名：日期重組日本七鰓鰻口腔腺分泌1 2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定第1 章文獻(xiàn)綜述受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白( t r a n s l a t i o n a l l yc o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i n ，1 c 1 1 p ) 是一種高度保守、大量表達(dá)的真核蛋白家族。最初由b r a w e r m a n 在小鼠艾氏腹水腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，并且認(rèn)為它是與生長發(fā)育相關(guān)的蛋白【1 i 。一些研究翻譯控制基因的學(xué)者也稱其為q 2 3 甜、1 , 2 1 3 j 或p 2 3 4 1 。g r o s s 基于它能在翻譯水平上調(diào)節(jié)而稱它為t c t p l 5 1 ?？墒菑钠浜髞戆l(fā)現(xiàn)的活性來看，t r a n s l a t i o n a l l yc o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i n 這一英文名稱并不十分恰當(dāng)，盡管它在腫瘤中的表達(dá)水平較高，但它與腫瘤的關(guān)系也并不是很直接，并不是一種腫瘤特異性蛋白。但目前還沒有更好的名字，故先沿用之。大量的研究顯示，t c t p 不僅存在于腫瘤細(xì)胞中，也存在于菌類、酵母、昆蟲、植物和除腎細(xì)胞外的哺乳動物組織正常細(xì)胞中1 1 , 6 , 7 a 9 1 。而且發(fā)現(xiàn)在從植物到動物的各類細(xì)胞中，t c r p 都具有廣泛的、高度的同源性和保守性。在進(jìn)化中高度的序列保守性表明t c t i 在生物體中可能具有十分重要的生物學(xué)功能。1 c r p 在5 0 0 多個組織和細(xì)胞類型中表達(dá)l l o 】。同時，它也逐漸受到越來越多研究人員的關(guān)注。卿是一種多功能細(xì)胞因子l l l j ，參與細(xì)胞周期調(diào)控i 畢廿j ，使金屬內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定1 1 4 1 ，是熱穩(wěn)定蛋白【1 5 l ，具有鈣結(jié)合和使微管穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域1 1 6 切，刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺和產(chǎn)生白細(xì)胞介素1 7 ，1 8 , 1 9 l 。體內(nèi)注射t c t p 還可誘生嗜酸性粒細(xì)胞，提示t c l v 在絲蟲病人過敏性炎癥反應(yīng)中具有重要作用i 冽。它也可作為b 細(xì)胞生長因子【2 1 1 ，并且瘧原蟲t c t p 能與抗瘧藥物青蒿素相結(jié)創(chuàng)捌。此外，t c t p還能與n a ，k - a t p 酶a 亞基相互作用【矧，具有抗凋亡特性i 川，是腫瘤逆轉(zhuǎn)的靶標(biāo)瞄l 。有研究顯示，該蛋白在c 0 3 s o d l 轉(zhuǎn)基因鼠中具有較高的特異性羰基水平，提示t c y p 的氧化修飾在肌萎縮性( 脊髓) 側(cè)索硬化( a l s ) 類神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用【2 6 1 。最近，y a - c h i c hh s u 2 7 1 等對果蠅t c t p 的研究發(fā)表于n a t u r e 雜志上，使t c i p 再次受到廣泛的關(guān)注，結(jié)節(jié)性硬化癥t s c 是一種良性腫瘤綜合癥，它是由t s c l 或t s c 2 腫瘤抑制基因突變引起的。t s c 通路的活化是由r h e b 介導(dǎo)的，r h e b 是r a s 超家族g t p 酶。y a c h i e hh s u 等以果蠅作為模式生物研究t c t p 在體內(nèi)的功能，他們確定t c t p 是r h e b 的直接調(diào)控子，可作為結(jié)節(jié)性硬化癥潛在的治療靶點。盡管目前我們對t c t p 已經(jīng)有了一定的認(rèn)識，但是對它具體的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究闡明。重組日本七鰓鰻口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定1 1 1 1 1 p 的空間結(jié)構(gòu)特點t c r p 是一類分子量為1 8 2 0 k d 的親水蛋白，與其它任何蛋白家族均未顯示出明顯的序列相似性。該家族的蛋白基本上都具有2 個特征結(jié)構(gòu)區(qū)，即t c i p l ( 【i e a e 】- 【g a 】- g a s n - p a k - s - g t a - e 一 g d e v 一 p a g e o v 【d e q g av 】) 和t c t p - 2 ( f l i v - x ( 4 ) - f l v h 【f y 】- m i v c t g e - x ( 4 , 7 ) - 【d e n p 】- o a s l lx u v m g a v i x ( 3 ) f v w q ) ，這2 個區(qū)在物種間均具有高度的序列同源性。c r a v e n 等”1 通過對粟酒裂殖酵母s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b1 c 1 1 p 即p ”f y p 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除高度易變且無序的g l y 4 0 - g l y 6 1 區(qū)外，其它的空間結(jié)構(gòu)區(qū)均比較明確。p 2 3 # y v 結(jié)構(gòu)是由4 個b 折疊片，分別為a 、b 、c 、d 和3 個主要螺旋h 1 、h 2 、h 3 以復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)連接在一起。最重要的一個特點就是四鏈的a 折疊片對著三鏈的b 折疊片的一面和小h 1 螺旋，h 3 螺旋與a 折疊片的反面相對，使大量親水表面暴露在溶液中，i - 1 2 螺旋緊鄰形成a 螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)的h 3 螺旋、a b b 二三明治結(jié)構(gòu)中的i l c 8 - a s p l l 和l y s l f o - l c u l 6 3l o o p 環(huán)以及s e r l 3 5 1 4 2 不規(guī)則區(qū)，雙鏈c 折疊片從由其它蛋白形成的核心球狀結(jié)構(gòu)中突出，鏈的末端錨定到易變環(huán)g i y 4 0 - g ! y 6 1 區(qū)。a 折疊片的延伸部分與t y r l 3 1 和v a l l 3 4 相互交錯形成d 折疊片，緊鄰a 折疊片兩面的結(jié)構(gòu)元件形成兩個疏水核心進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)t c t p 與m s s 4 d s s 4 ( m a m m a l i a ns u p p r e s s o r o f s c c 4 ) 在結(jié)構(gòu)上驚人的相似【8 l ，t c - t p 與m s s 4 d s s 4 蛋自家族構(gòu)成結(jié)構(gòu)超家族。具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白很可能具有相同或相似的功能。m s s 4 具有鳥苷酸交換因子( g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g ef a c t o r ，g e f ) 功能，有助于r a b 蛋白上g d p和g ，r p 相互轉(zhuǎn)換。r a b 具有分子開關(guān)的作用，結(jié)合g d p 失活，結(jié)合g t p 激活，調(diào)節(jié)s n a m 三s 復(fù)合體的形成，從而促進(jìn)和調(diào)節(jié)運(yùn)輸小泡的停泊和融合。但m s s 4并不是r a b 活化的直接原因，而是作為伴侶蛋白樣的因子在其瞬間無鳥苷酸狀態(tài)時起穩(wěn)定r a b 的作用，因而又被稱作無鳥苷酸伴侶蛋白( g u a n i n en u c l e o t i d e -f r e ec h a p e r o n e s ，g f c ) 。t c t p 家族中有9 個殘基是完全保守的，主要集中在g l u l 2 ，l e u 7 4 和g l u l 3 4 殘基所在的區(qū)，而該區(qū)與m s s 4 中r a b 蛋白s e c 4 結(jié)合表面相對應(yīng)，這也暗示著t c y p 可能具有與之類似的功能l ”。1 2 t c t p 合成的調(diào)控隨著對t c t f 研究的不斷深入，越來越多的人對它產(chǎn)生了濃厚的興趣。受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白，顧名思義，其合成和表達(dá)是受翻譯控制的。然而，不容2重組日本七鰓鯁口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定忽視的是，它的表達(dá)同樣也受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。有研究顯示，鈣在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)t c t p 的表達(dá)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣量能誘導(dǎo)t c t p 基因轉(zhuǎn)錄，提高胞內(nèi)游離鈣濃度在轉(zhuǎn)錄后水平增強(qiáng)1 c r p 表達(dá)。關(guān)于t c t p 的翻譯調(diào)節(jié)機(jī)制，主要有兩種解釋，一種認(rèn)為：t c t pm r n a的翻譯與帽結(jié)合蛋白e i f 4 e 有關(guān)1 2 9 j 。e i f 4 e 被認(rèn)為是最重要的翻譯起始因子，是調(diào)控蛋白質(zhì)合成的中心，磷酸化使蛋白質(zhì)合成增加，去磷酸化使蛋白質(zhì)合成減少。e l f 4 e 的活性同樣也影響著t c t pm r n a 的翻譯，它的磷酸化和過表達(dá)，也有利于t c i p 的合成。隨后，b o m m e r l 劃等人通過實驗提出新的觀點，t c t pm r n a 可能存在著另外的翻譯調(diào)節(jié)機(jī)制：珊的m r n a 能激活雙鏈r n a 依賴的蛋白激酶( d s r n a - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，p k r ) 。t c t pm r n a 具有形成強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)的潛力，它能夠激活p k r ，同時，活化的p k r 又抑制t c t p m r n a 的表達(dá)，即：t c t pm r n a 既活化p k r ，又受這一激酶的翻譯抑制，1 c r p 是一個受翻譯過程所阻遏的蛋白。1 31 c 1 1 p 的生物學(xué)特性及功能盡管t c i p 普遍存在并且大量表達(dá)，但是對于它確切的生物學(xué)功能，人們了解的還不是很清楚。到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)的1 c r p 的特點及研究較多的關(guān)于t c t p 的生物化學(xué)特性主要有以下幾個方面：1 3 1 與鈣離子結(jié)合t c t p 具有多種生物學(xué)功能，鈣結(jié)合活性就是這一蛋白家族的主要特征之一。通過對大鼠t c f p 的研究確定了t c t p 的鈣結(jié)合位點，大鼠t c t p 由1 7 2個氨基酸組成，其中8 1 1 1 2 氨基酸殘基所在的區(qū)域能與鈣結(jié)合，該區(qū)是由與螺旋相鄰的無規(guī)則卷曲區(qū)構(gòu)成，雖與鈣結(jié)合，但卻沒有象e f - 手、c a l b 之類的鈣結(jié)合模體，與其它已知的鈣結(jié)合蛋白家族并不具有序列同源性，提示t c t p可能是鈣結(jié)合蛋白( c a l c i u mb i n d i n g p r o t e i n ，c b p ) 家族中一個新的成員【1 6 l ，它能協(xié)助c a 2 + 完成多種生理功能。比如說，胎兒的生長和發(fā)育取決于胎盤鈣的運(yùn)輸，2 0 0 5 年，a t c u r i i 孔i 等采用w e s t e r nb l o t 、r t - p c r 、免疫組織化學(xué)和s i r n a 技術(shù)首次證明：人類的胎盤中表達(dá)t c t p ，在妊娠初期3 個月的細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層中存在t c t p ，隨著時間的增長表達(dá)量也明顯增強(qiáng)，并在后3 個月中達(dá)到最高，它是人胎盤中一種新的鈣結(jié)合蛋白，在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中調(diào)節(jié)鈣的吸重組日本七鰓鯁口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及腳活性鑒定收，對胎盤中鈣的運(yùn)輸起直接作用。1 3 2 與微管蛋白結(jié)合1 c r p 參與了對細(xì)胞周期的調(diào)控。受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白p 2 3 具有微管結(jié)合蛋白特性，p 2 3 是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，以1 0 0 1 5 0 k d 復(fù)合物的形式存在。從h e l a 細(xì)胞中抽提的p 2 3 的部分能與抗微管結(jié)合蛋白抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)。通過免疫定位實驗發(fā)現(xiàn)，p 2 3 在細(xì)胞周期的g 1 期、s 期、g 2 期和m 早期均與微管有聯(lián)系。在細(xì)胞分裂中期，與有絲分裂紡錘體結(jié)合，在由分裂中期向后期過渡中，p 2 3 與紡錘體分離。突變分析表明，p 2 3 的微管結(jié)合區(qū)域與微管相關(guān)蛋白m a p i b 的一部分相似。p 2 3 過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長阻滯和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，而且提高p 2 3 的水平會導(dǎo)致微管重組，使微管數(shù)量增加、穩(wěn)定性增強(qiáng)1 1 7 1 。迸一步研究發(fā)現(xiàn)，t c t p 作為底物與p l k ( p o l o - l i k ek i n a s e s ) 相互作用，體內(nèi)體外實驗證明，p l k 磷酸化1 c 1 1 p 兩個s e r 殘基( s e r 4 6 和s e r 6 4 ) ，而且這種磷酸化作用會降低1 c r p 的微管穩(wěn)定活性，使微管運(yùn)動性增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂后期的進(jìn)程l 捌。1 3 3 作為翻譯負(fù)調(diào)控因子e e f i a 是蛋白質(zhì)翻譯延長因子，是一種在蛋白質(zhì)合成過程中起核心作用的蛋白質(zhì)，e e f l b 有3 種形式，分別為a ，b 和1 ，它是e e f i a 的鳥苷酸交換因子( g t m i n en u c l e o t i d ee x c h a n g ef a c t o r ，g e f ) ，能催化g d p 與g t p 的交換。有研究顯示，e e f i a 與e e f l b1 3 都能與t c t p 相互作用，1 c r p 優(yōu)先結(jié)合并穩(wěn)定e e f i a g d p ，削弱e e f l bb 催化的g d p 交換反應(yīng)，提示t c t p 具有鳥苷酸離抑制因子( g i l a n j cn u d e o t i d ed i s s o c i a t i o ni n l f i b i l o t , g ) 活性p ”，在蛋白質(zhì)的翻譯過程中，它是一個負(fù)調(diào)控因子。1 3 4 作為i g - e 依賴性組胺釋放因子t c t p 又叫做組胺釋放因子( h i s t a m i n e - r e l e a s ef a c t o r ，瑚腳，被認(rèn)為在慢性過敏性疾病中起重要作用。m a c d o n a l d1 7 1 等于1 9 9 5 年首次發(fā)現(xiàn)了t c t p 的細(xì)胞外生物學(xué)功能。他們通過對過敏病人體液中和遺傳過敏癥兒童淋巴細(xì)胞中存在的i g e 依賴性組胺釋放因子進(jìn)行氨基酸末端序列分析，發(fā)現(xiàn)h r f 與小鼠和人的受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白具有同源性，t c t p 能刺激人嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺。后來的研究發(fā)現(xiàn)，人血吸蟲1 3 4 l 和瘧原蟲1 3 5 j 等多種寄生蟲也可分泌t c t p 至宿主細(xì)胞中，刺激宿主細(xì)胞釋放組胺，從而影響宿主的免疫應(yīng)答，引起炎癥反應(yīng)。t c i p 被認(rèn)為是一種分泌蛋白，通過釋放組胺參與炎癥反應(yīng)，它究竟是通4重組日本七鰓鰻口腔腺分泌【2 5 0 蛋白基因克隆及腳球活性鑒定過什么樣的機(jī)制被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外并行使其功能的呢? a m z a l l a 一劃等通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)，t s a p 6 ，這一p 5 3 誘導(dǎo)的5 6 跨膜蛋白能與1 c r p 相互作用，t s a p 6 持續(xù)的過表達(dá)會導(dǎo)致內(nèi)生和外生表達(dá)的t c y p 分泌的增強(qiáng)，t s a p 6 可以促進(jìn)1 c 1 1 p 的分泌。t c t p 作為組胺釋放因子。除刺激組胺的釋放外，亦可促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞分泌i l 4 、i l - 1 3 ，刺激嗜酸細(xì)胞分泌i l - 8 等促炎性細(xì)胞因子1 1 8 ，1 9 1 ，其中i l - 8在支氣管哮喘等變應(yīng)性疾病中具有作用1 3 5 作為腫瘤逆轉(zhuǎn)的靶標(biāo)t c i p 是腫瘤逆轉(zhuǎn)的靶標(biāo)。t u y n d e r 3 7 1 等在腫瘤逆轉(zhuǎn)實驗中發(fā)現(xiàn)。t c t p 具有最明顯的差異表達(dá)，在u 9 3 7 細(xì)胞逆轉(zhuǎn)中下調(diào)，通過反義c d n a 或s i r n a 干涉抑制t c i t 表達(dá)，會導(dǎo)致腫瘤惡性表型的抑制和細(xì)胞重組。之后，t u y n d e r1 2 5 1等對t c t p 又做了進(jìn)一步研究，通過使用h 1 細(xì)小病毒作為選擇性介質(zhì)，從3種主要的實體癌：結(jié)腸、肺和黑素瘤細(xì)胞系中獲得逆轉(zhuǎn)細(xì)胞，這些細(xì)胞在體內(nèi)和體外都抑制惡性表型。用反義t c i p 轉(zhuǎn)染v s r r 轉(zhuǎn)化的n i h 3 t 3 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制t c l v 的表達(dá)能誘導(dǎo)惡性表型的轉(zhuǎn)變。t c r p 對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的雙重作用以及在逆轉(zhuǎn)的腫瘤細(xì)胞中的強(qiáng)烈下調(diào)，使其有望成為腫瘤生物學(xué)治療的一個理想的靶標(biāo)，具有潛在的應(yīng)用價值。此外，t c i t 還可作為青蒿素類抗瘧藥物的受體蛋白閻。e f f e r t h l 3 8 l 發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲t c t p 是青蒿素和它在瘧原蟲中的衍生物1 ，2 ，4 - t r i o x a n e s 的靶蛋白。1 3 6 作為抗凋亡蛋白t c t p 具有抗凋亡特性。m c l 1 屬于關(guān)鍵的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子b c l 2 蛋白家族成員，在動物的發(fā)育中起重要的作用。m c l 1 通過避免細(xì)胞發(fā)生凋亡而維持細(xì)胞的存活。i a u i 2 4 l 等通過研究發(fā)現(xiàn)，t c i t 可通過調(diào)節(jié)m c l - 1 蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)而增強(qiáng)它的抗凋亡活性。這一結(jié)果與z h a n g l 3 9 1 的報道相符。與之不同的是，z h a n g 的研究認(rèn)為，m c l 1 是作為t c r p 的伴侶分子( c h a p e r o n e ) 而起作用，而l j u 則認(rèn)為，t c t i 結(jié)合到m c l 1 上并調(diào)節(jié)m c l 1 的穩(wěn)定和抗凋亡活性。此外，l i u 還證明，t c t p 是通過泛素依賴的蛋白酶降解途徑( u b i q u i t i n d e p e n d e n tp r o t e a s o m ed e g r a d a t i o np a t h w a y ) 阻止m c l 1 降解，從而使其穩(wěn)定。最近，有研究發(fā)現(xiàn)，受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白的n 端區(qū)是其抗凋亡活性的必需區(qū)域1 4 0 l 。b c l x l 作為凋亡負(fù)調(diào)蛋白，對于維持細(xì)胞生存具有重要作用。y a n g m l等采用酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)，b c l x l 能與t c i t 相互作用，g s t - 沉淀、免疫共5重組日本七鰓鰻口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及師活性鑒定沉淀、亞細(xì)胞定位等分析也確定了這一現(xiàn)象的存在。并且進(jìn)一步證明，1 c r p的n 端區(qū)是使t c t p 具有抑制凋亡特性所必需的結(jié)構(gòu)，它和b c l x l 的b i d 結(jié)構(gòu)域相互作用。另外，1 c 1 1 p 在j u r k a tt 細(xì)胞中抑制由t a x o l 誘導(dǎo)的凋亡，y a n g由此推測，t c t p 可能通過防止b c i x l 磷酸化來抑制t 細(xì)胞凋亡。t c r 和c d 2 8共刺激介導(dǎo)的t 細(xì)胞活化中。t c y p 與b c l x l 量同時上調(diào)，暗示二者可能共同維持活化的t 細(xì)胞存活1 4 非哺乳動物唧的研究從1 9 8 8 年最先得到鼠t c f pc d n a 到1 9 8 9 年對人t c r p 的報道，雖然已經(jīng)有3 0 多種完整的t c t pc d n a 陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但在非哺乳脊椎動物中t c t f 的研究卻很匱乏。而t c r p 在后生動物中也是一種普遍存在并且大量表達(dá)的蛋白，為了更好的了解t c t p 在非哺乳動物中的功能，v e n u g o p a l l 4 l j 從一種硬骨魚l a b e or o h i t a ( r o h u ) 中分離出c d n a 編碼的完整的t c t p 。m h ut c t p 由1 0 4 3個核苷酸編碼，1 7 1 個氨基酸組成，并且在除腦組織以外的所有器官中均被表達(dá)。受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白由1 r i r r l 基因( 腫瘤蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子1 ) 編碼，現(xiàn)已獲得入、小鼠、大鼠和兔等四種哺乳動物1 r i y r l 基因的基因組結(jié)構(gòu)n 塒，1 r i t l基因定位于1 3 q 1 2 一q 1 4 之間1 4 到。由5 個內(nèi)含子和6 個外顯子組成，全長3 8 1 9個核苷酸。所有內(nèi)含子外顯子區(qū)域均遵循g t a t 原則【叫。由于3 u t r s 長度的差異，在兔和人等哺乳動物中1 r i r r l 基因轉(zhuǎn)錄成兩個m r n a i ”，但r o h ut c y p僅有一種m r n a ，硬骨魚是最古老的后生動物，并且魚是兔和人等哺乳動物的祖先，v c n u g o p a l 認(rèn)為出現(xiàn)兩個m r n a 可能是由于在脊椎動物進(jìn)化后期出現(xiàn)了基因組復(fù)制。另外，魚t c t pm r n a s 的二級結(jié)構(gòu)表明它可能是r n a 特異性蛋白激酶p k r 的作用底物。解析得r o h u1 c r p 的三維結(jié)構(gòu)，這在硬骨魚此類蛋白研究中尚屬首例。系統(tǒng)發(fā)育分析表明。動植物t c t p 序列保守的系統(tǒng)發(fā)育簇與真核類的相一致，提示在真核細(xì)胞進(jìn)化中，t c t p 的直向同源基因起源于1 0 x 1 0 9 年前【4 。1 5 日本七鰓鰻口腔腺分泌t c t p 的研究日本七鰓鰻( l a n t p e t r aj a p o n i c a ) 系圓口綱( c y c p o s t o m a t a ) 、七鰓鰻目( p e t r o m y z o n i f o r m e s ) 、七鰓鰻科( p e t r o m y z o n t i d a e ) 、七鰓鰻屬( l e t h e n t e r o n ) 。是一種現(xiàn)存的，沒有上下頜的低等脊椎動物1 4 4 , 4 5 1 ，在進(jìn)化上因連接著脊椎與無脊椎動物而具有極高的研究價值。變態(tài)后的成體在海水中營6重組日本七鰓鯪口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定半寄生生活，以其特有的口吸盤吸附在其他魚類軀體上，以舌面的角質(zhì)齒扎破魚體，通過舌部有節(jié)奏的銼動及口吸盤所產(chǎn)生的負(fù)壓力脈沖，七鰓鰻能夠?qū)⑺拗鞯难何娇谇恢?，靠吸食其血肉生存，并使宿主流血不止巧鋤。與其它吸血動物一樣。日本七鰓鰻具有與其吸血生活相適應(yīng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，即在它頭部鰓下肌中有一對特殊的腺體一口腔腺，日本七鰓鰻的這種特有的生活習(xí)性提示在其口腔腺中存在某種抗凝機(jī)制。血管內(nèi)壁主要存在兩種抗凝機(jī)制，分別為蛋自酶類凝血抑制機(jī)制和抗凝血酶1 1 ( a n t i t h r o m b i n i l l ，a t - ) 為首的蛋白酶抑制劑類抑制機(jī)制。其中組織因子途徑抑制物( t i s s u ef a c t o r p a t h w a y i n h i b i t o r ，t f p i ) 屬蛋白酶抑制物類抗凝物質(zhì)。在蛋白酶類凝血抑制機(jī)制中，蛋白c 起主要作用。蛋白c ( p c ) 為絲氨酸蛋白酶，是由肝臟分泌的一種生理性抗凝劑，它以酶原形式存在于血漿中，蛋白c 在自然狀態(tài)下是無活性的，凝血酶可特定地從蛋白c 高分子鏈的n 末端將其分解成為一個由1 2 個氨基酸組成的活性多肽，即成為激活的蛋白c( a c t i v a t e dp r o t e i nc ，a p c ) 。a p c 通過使已活化的因子、v 因子等凝血因子滅活，從而抑制凝血過程。然而，凝血酶對蛋白c 的激活是相當(dāng)慢的、凝血酶只有與存在于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的血栓調(diào)節(jié)蛋白，又叫做凝血酶調(diào)節(jié)素( 1 m ) 形成復(fù)合物后，才能有效地激活蛋白c ，使其活性增強(qiáng)1 2 萬倍。凝血酶調(diào)節(jié)素是內(nèi)皮細(xì)胞膜上的凝血酶受體之一，可與凝血酶可逆結(jié)合，結(jié)合后的凝血酶其促凝活性，如激活血小板的能力、促進(jìn)纖維蛋白形成的能力及激活f v 、f v i i 的能力等均明顯降低或喪失，卻大大加強(qiáng)了凝血酶激活蛋白c 的作用。因此，凝血酶調(diào)節(jié)素是使凝血酶由促凝轉(zhuǎn)向抗凝的重要的血管內(nèi)凝血抑制成份。受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白具有多種細(xì)胞內(nèi)和和細(xì)胞外生物學(xué)活性。1 9 9 5 年m a c d o n a l d 等首次發(fā)現(xiàn)了受翻譯調(diào)節(jié)的腫瘤蛋白家族的細(xì)胞外生物學(xué)功能，通過對過敏病人體液中和遺傳過敏癥兒童淋巴細(xì)胞中存在的i g - e 依賴性組胺釋放因子進(jìn)行氨基酸末端序列分析，發(fā)現(xiàn)組胺釋放因子與小鼠和人的翻譯控制腫瘤蛋白具有同源性，t c t p 能夠刺激人嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺，人血吸蟲和瘧原蟲等多種寄生蟲可分泌t c f p 至宿主血液中，刺激宿主細(xì)胞釋放組胺，從而影響宿主免疫應(yīng)答。此外，組胺還能夠引起血管擴(kuò)張效應(yīng)，增強(qiáng)局部血流；使血管內(nèi)皮細(xì)胞表面凝血酶調(diào)節(jié)素1 m 的表達(dá)增高，它一方面能與凝血酶結(jié)合，降低其活性：另一方面能夠活化蛋白c ，活化的蛋白c 能夠阻礙凝血因子x a 與血小板的結(jié)合，并刺激纖溶酶原激活物的釋放而促進(jìn)纖維蛋白溶解，還能在其7重組日本七鰓鯁口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定輔因子蛋白s ( 存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞或血小板膜上的一種蛋白質(zhì)) 的作用下滅活凝血因子v a 和a ，這三條通路最終都能夠引起抗凝血反應(yīng)的發(fā)生。海洋天然活性成分的研究是海洋藥物開發(fā)的基礎(chǔ)和源泉。不少海洋天然活性成分含量低，原料采集困難，限制了該化合物進(jìn)行臨床研究和產(chǎn)業(yè)化。尋找經(jīng)濟(jì)的、人工的、對環(huán)境無破壞的藥源己成為海洋藥物開發(fā)的緊迫課題。而采用生物工程方法進(jìn)行化合物的合成便是解決藥源問題的一個重要手段。本研究首次發(fā)現(xiàn)了存在于日本七鰓鰻口腔腺中的t c i p 模體蛋白新基因，并將其命名為l 2 5 0 ，而且本實驗日本七鰓鰻口腔腺中1 c r p 模體蛋白l 2 5 0 具有組胺釋放因子活性，能夠刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺，而組胺可引發(fā)一系列抗凝血級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，這為解釋日本七鰓鰻特有的吸血生活習(xí)性提供了一定的理論依據(jù)，同時提示l 2 5 0 蛋白將在臨床抗凝治療方面具有潛在的應(yīng)用價值8重組日本七鰓鯁口腔腺分泌【2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定第2 章日本七鰓鰻口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白的基因克隆、表達(dá)及純化基本技術(shù)路線：利用前期構(gòu)建的c d n a 文庫、e s t 庫中獲得的生物學(xué)信息自行設(shè)計引物進(jìn)行r t - p c r 擴(kuò)增，以獲得日本七鰓鰻口腔腺t c t p 蛋白的c d n a ,克隆至p e t 2 3 b 表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)化入克隆菌d l t 5 a 后進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選，之后將帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白在大腸桿菌ec o l ib l 2 1 中進(jìn)行了可溶性表達(dá)，經(jīng)組氨酸親和層析柱純化后，獲取了分子量為2 2 4 k d 的t c r p 蛋白純品，濃度約為1 5 m m l ，將其命名為l - 2 5 0 。2 1 日本七鰓鰻口腔腺分泌l - 2 5 0 蛋白的基因克隆2 1 1 材料和方法2 1 1 1 材料新鮮的口腔腺分泌物取自1 2 月中下旬黑龍江省松花江流域同江地區(qū)洄游日本七鰓鰻總r n a 提取用的t r i z o l 試劑購自g i b c ob r l ，p c rf r a g m e n t r e c o v e r yk i t ，質(zhì)粒提取試劑盒，r t - p c r 試劑盒，內(nèi)切酶n d ei 和h i n d 均購自寶生物工程( 大連) 有限公司，質(zhì)粒p e t 2 3 b 與克隆菌d h 5 a 由本實驗室保存，y e a s te x u a c t ，p e p t o n e y 分別購于o x i d ，b i ob 翹s i cl a c 公司主要儀器：p c r 儀( t a k a r a )手掌離心機(jī)l x 1 高速臺式冷凍離心機(jī)b i o f u g cs t r a t o s ( h e r a e u s )氣浴恒溫振蕩器江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠潔凈工作臺1 6 7 1 c n2 1 1 2 方法2 1 1 2 1 引物設(shè)計對日本七鰓鰻口腔腺c d n a 文庫1 3 2 3 條有效f s t 序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一條能夠翻譯t c r p 模體的開放閱讀框，據(jù)此設(shè)計引物如下：p i ：5 一x x c a t a t g a t c a t c t a c a a g g a c a t c c t c 一3 p 2 ：57 - x x a a g c t t g c a t t t c t c a a t t t c c a g g c c - 3 2 1 1 2 2 總r n a 的提取采用g i b c ob r l 的t r i z o l 試劑。具體如下：9重組日本七鰓鰻口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定取日本七鰓鰻口腔腺迅速置于液氮中研磨；稱取o 2g 腺體組織及分泌物，加l m l t r i z o l 試劑制備勻漿，4 c 孵育5m i n ； 加0 2m l 氯仿，蓋緊蓋后用力振搖1 5f , e c ：，然后置于冰上5m i n ；4 c ，1 2 0 0 0 9 ，離心1 5 m i n ：將上層水相移入另一離心管，加0 5 m l 異丙醇，并在冰上孵育1 0 m i b ；4 0 ，1 2 0 0 0 9 ，離心1 5m i n ；棄上清，在沉淀( 含r n a ) 中加1m l 7 5 乙醇洗滌，旋渦混勻；4 c ，1 0 0 0 0 9 ，離心5 m i n ，得到r n a 沉淀；空氣干燥后，用適量t e 或無r n a s e 水溶解備用。2 1 1 2 3 逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)( r t - p c r )r t - p c r 基本原理：提取組織或細(xì)胞中的總r n a ，以其中的m r n a 為模板。采用o l i g o ( d t ) 或隨機(jī)引物利用反轉(zhuǎn)錄酶r t a s e 反轉(zhuǎn)錄成c d n a ，再以c d n a 為模板進(jìn)行p c r 擴(kuò)增，獲得目的基因。本實驗利用前期構(gòu)建的c d n a 文庫、e s t 庫中獲得的生物學(xué)信息，自行設(shè)計引物，以日本七鰓鰻口腔腺總r n a 為模板進(jìn)行r t - p c r 擴(kuò)增，以獲得日本七鰓鰻口腔腺l - 2 5 0 蛋白的c d n a ；具體步驟如下：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系重組日本七鰓鰻口腔腺分泌l 2 5 0 蛋白基因克隆及h r f 活性鑒定按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：4 2 2 0 m m9 9 5m i n5 5 r a i np c r 反應(yīng)引物序列：p h5 - x x c a t a t g a t c a t c t a c a a g g a c a t c c t c - 3 p 2 ：5 x x a a g c l l g c a u t c t c a a t t t c c a g g c c - 3 p c r 反應(yīng)體系反應(yīng)組分用量1 0 xi 叭p c rb u f i e fd n r pm i x t u 聆模板c d n ap 1p 2缸l缸l1 0 0 n g地l1 正i lt a k a r at a q0 2 5 z ld l - 1 2 0 補(bǔ)齊至5 吼l反應(yīng)條件：9 4 預(yù)變性2 r a i n 后，9 4 變性4 5 s ，5 5 復(fù)性4 5 s ，7 2 延伸4 5 s ，3 0 個循環(huán)。之后7 2 延伸6 m i n 。2 1