（農(nóng)藥學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）交沙霉素的分離純化工藝研究.pdf

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 摘要 交沙霉素o o s a m y c i n ) 是屬于十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生藥物，它是一種廣譜抗菌 素，其抗菌譜與紅霉素相似，但是副作用較小且不易使病菌產(chǎn)生抗藥性。本課題的 主要內(nèi)容是研究交沙霉素的分離提取和純化工藝。主要取得了一下成果： 首先，建立了關(guān)于交沙霉素的分析檢測(cè)方法，包括生物測(cè)定法和高效液相色譜 法。其中高效液相色譜法具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于測(cè)定發(fā)酵液及各個(gè)分離環(huán) 節(jié)中的含量。通過(guò)改變流動(dòng)相的比例，緩沖液的濃度和酸堿度，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的色譜 條件是：色譜柱用碳十八烷基硅膠鍵合柱；流動(dòng)相是甲醇和磷酸緩沖液，其比例是 8 0 ：2 0 ；檢測(cè)波長(zhǎng)是2 3 2 n m ；流速是l r n l m i m 進(jìn)樣量是1 0 u l ；柱溫是室溫。在上 述條件下交沙霉素的保留時(shí)間為6 4 1 2 m i n ，與其他雜質(zhì)峰的分離度大于1 5 。 在大孔樹(shù)脂吸附分離法的研究中，從幾種常用的大孔樹(shù)脂中篩選出了x a d - 1 6 樹(shù) 脂為吸附劑，優(yōu)化后的吸附條件為：吸附流速為0 5 m l m i n ；p h 為1 0 ；加入1 的氯 化鈉的鹽濃度。解吸的時(shí)用乙醇為解吸劑，優(yōu)化后的洗脫條件：7 0 和1 0 0 兩種濃 度的乙醇為洗脫劑，采用梯度洗脫的方式，先用7 0 的乙醇洗脫，大量的雜質(zhì)及色 素被洗脫；然后用1 0 0 的乙醇將有效成分洗脫下來(lái)。 在溶媒萃取法提取的試驗(yàn)中，由于交沙霉素在發(fā)酵液中大部分存在于菌絲體中， 所以試驗(yàn)中將發(fā)酵液調(diào)p h 值到9 ，然后離心分離，將菌絲體與輕質(zhì)碳酸鈣粉末以質(zhì) 量比為l ：1 的比例混合均勻，在真空干燥箱中5 0 c 條件下干燥6 小時(shí)。將干燥的菌 絲體均勻粉碎大小顆粒為2 0 目。干燥茵絲體顆粒用9 5 浸提乙醇，通過(guò)設(shè)計(jì)正交試 驗(yàn)得到用9 5 乙醇浸提干燥菌絲體顆粒的最優(yōu)條件是：每1 0 克干燥菌絲體用2 0 毫 升9 5 乙醇；浸提時(shí)間為3 6 小時(shí)；浸提溫度為室溫；浸提次數(shù)為3 次。 在交沙霉素的精制階段，用2 0 0 - 3 0 0 目的層析硅膠裝柱，用氯仿：甲醇= 2 ：3 比例配制的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮( 真空度為 0 0 9 5 m p a ，溫度為5 0 ) 。濃縮液揮干后得到黃色粉末狀的交沙霉素，然后用p h 3 5 的酸化水溶解該粉末。將交沙霉素的酸化水溶液調(diào)p h 到9 后，靜止2 0 - 3 0 分鐘，便 有淡黃色的交沙霉素晶體析出。 通過(guò)對(duì)交沙霉素晶體的室內(nèi)生物活性測(cè)定，所得晶體的活性略小于購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)品。 的活性。 關(guān)鍵詞，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素；交沙霉素；檢測(cè)方法；溶媒萃取；大孔樹(shù)脂吸附 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 a b s t a c t j o s a m y c i n w h l c hi sa k i n do fa n t i b i o t i co fm a c r o l i d e s i ti saw i d e - s p e c t r u ma n t i b i o t i c ， l i k ea se r y t h r o m y c i n w i t ht h e1 i t t l es i d ee f f e c ta n dd r u g f a s t n e s s i nt h i sd i s s e r t a t i o n , p r o c e s so fi s o l a t i n ga n dp u r i f y i n gs p i n o s a d 丘o mf e r m e n t a t i o nb r o t hb ym a c r o - p o r o u s a d s o r b e n tr e s i na n ds o l v e n te x t r a c t i o nw e r ed e t e r m i n e d f i r s t ，t h em e t h o do fd e t e c t i o na n da n a l y s i st oj o s a m y c i nw a se s t a b l i s h e d , i n c l u d i n g t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h ya n da n a l y s i sh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c w a sf a s ta n da c c u r a t e ，w h i c hw a sv e r ys u i t a b l ef o rq u a n t k a t i v ea n a l y s i so fj o s a m y c i n i n f e r m e n t a t i o nb r o t ha n dd l l l r i i l ge x t r a c t i n gp r o c e s s ，t h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r e a s f o l l o w i n g ：c h r o m a t o g r a p h yc o l u m n ：r p - c l s ；m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o l ：p h o s p h o r i ca c i d b u f f e r = 8 0 ：2 0 ；d e t e c tw a v el e n g t h ：2 3 2 n m ；f l o wr a t e ：1 o m l m i n ；i n j e c t i o nv o l u m e ：i o u l ； c o l u m nt e m p e r a t u r e ：r o o mt e m p e r a t u r e p r o c e s sc o n d i t i o n so fi s o l a t i n ga n dp u r i f y i n gs p i n o s a df r o mf e r m e n t a t i o nb r o t hb y m a c r o - p o r o u sa b s o r b e n tr e s i nw e r ed e t e r m i n e d x a d 一16n o n p o l a rr e s i nw a ss c r e e n e da s t h eb e s ta d s o r b e n t ，a n da d s o r b e n tc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ：t h ef l o wr a t eo fa d s o r p t i o n w a s0 5 m l m i n , t h ep hw a sm a i n t a i n e da t lo ，1 o n a c iw a sf e a s i b l e t h ed e s o r p t i o n c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ：3 0 e t h a n o lw a su s e df o rr e m o v i n gs o m ei m p u r i t ya n d p i g m e n t 10 0 e t h a n o lw a s u s e df o re l u t i n gj o s a m y c i n p r o c e s sc o n d i t i o n so fi s o l a t i n ga n dp u r i f y i n gj o s a m y c i nb ys o l v e n te x t r a c t i o nw e r e a l s od e t e r m i n e d ：a d j u s tt h eb r o t ht op h 9 0 ，t h e no f f c e n t e rt h eb r o t hr e m o v et h es u p e m a t a n t ， a n da d de q u a lw e i g h tc a l c i u mc a r b o n a t e ，v a c u u md e s i c c a t i o nt h em y c e l i a lf o r6h o u ra t 5 0 c u s ee t h a n o ll e a c h i n gt h em y c e l i a l b ym e a n so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw eg e tt h e o p t o r n i z e dc o n d i t i o na sf o l l o w ：2 0 m le t h a n o lf o re v e r y10 9m y c e l i a l ；l e a c h i n gt i m e - i s3 6 h o u r s ；l e a c h i n gt e m p e r t u r ei sr o o mt e m p e r t u r e ；n u m b e ro fl e a c h i n gt i m e s i st h r e e i nt h es e c t i o no fr e f i n i n g ，s e l e c tt h es i l i c ag e ll i k ea2 0 0t o3 0 0m e s h , p r o p o r t i o no f c h l o r o f o r m ：m e t h a n o l = 2 ：3 ，a st h ee l u e n t c o n c e n t r a t et h ee l u e n t 缸t h ed e p r e s s u r i z a t i o n s t a t e ( t h ev a c u u md e g r e ei so 0 9 5 m p a ，t h et e m p e r t u r ei s5 0 c ) e v a p o r a t e dt h es o l u t i o n a n d g e tt h ey e l l o wp o w d e ro f j o s a m y c i n , t os o l u t ei tw i t ha c i d i f i e dw a t e ro f p h 3 5 t h e nt o 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 c h a n g et h ep ho fs o l u t i o na tp h 9 0 ，p a r ki n2 0 3 0m i n i u t e ，t h ep r i m r o s ey e l l o wo f j o s a m y c i ni ss e p a r a t e do u t i nt h ep r o c e s so fd e t e r m i n a t i o no ft h ec r y s t a l sa c t i v i t y ，w ef r e dt h a tt h ec r y s t a lo f j o s a m y c i nh a st h es a m eb a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t y 笛t h es t a n d a r dc r y s t a lw h i c hw ea r e p u r c h a s e d k e y w o r d ：a n t i b i o t i co fm a c r o l i d e s ；j o s a m y c i n ；a n a n l y t i c a l m e t h o d ；m a c r o p o r o u s a b s o r b e n tr e s i n ；s o l v e n te x t r a c t i o n 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書(shū) 學(xué)證論文 如需保密，解密時(shí)間 年月曰 是駑傈棗 獨(dú)截性聲蹊 本人聲翡所瑩交爵論文燕我個(gè)人褻導(dǎo)癖指導(dǎo)下避行的研究工作及取得的研究成 暴。盡我斯知，除了文串特別如| ；i 標(biāo)注和藪謝的遺方卦，論文中不包含其他人邑經(jīng)發(fā) 表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含恐獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)專(zhuān)每的學(xué)位或證書(shū) 而使用過(guò)的材料，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任 藹賈獻(xiàn)筠邑喪論文孛散了甓確終謊蹣，并表示了謝意二 研究生簽名： 繹融 時(shí)聞：沙。君年 月2 彥 日 學(xué)位論文使用授權(quán)書(shū) 本人完壘了解華中農(nóng)韭大學(xué)關(guān)予保存，使月學(xué)位論文螅規(guī)定，鼯學(xué)生必綴按照學(xué) ?；汕筇峤粚W(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印刷版和電子版， 并提供譽(yù)錄檢索和鬻覽服務(wù)，可以采用彩帶、縮印或掃描等復(fù)稍手段保存、匯編學(xué)位 論文。本人圈意華孛裹監(jiān)夾學(xué)可以屬不鬻方式在不麓媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全 部或部分內(nèi)容，并授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所和北京萬(wàn)方數(shù)據(jù)股份有限公司將本人 學(xué)位論文收錄到鬣中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行信息服務(wù)( 包括但不限于匯編、 復(fù)制、發(fā)行、信惠囅絡(luò)傳播蕁) ，舞時(shí)本人保鬻在其健媒體發(fā)表論文的權(quán)力。 注：保密學(xué)位論文零涉及技術(shù)袋密，寓韭黎密或串建專(zhuān)剩等潛在囂要提交保密的論 文) 在解密后適用予本授權(quán)書(shū) 學(xué)位論文作者簽名：，穿蓬擎莪導(dǎo)燼簽名：孛李募聲 簽名譬絮：渤參每多箕諺萋簽名瑟鞘：弦夠年j - 層夕簿 l 注：請(qǐng)將本表直接裝訂在學(xué)位論文的扉頁(yè)和目錄之間 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 - 二l l - - - 1 月u舌 1 1 交沙霉素的基本性質(zhì)概述 交沙霉素( j o s a m y e i n ) 屬于十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生藥物，是柱晶白霉素中的a 3 組 分。于1 9 6 4 年由日本山之內(nèi)制藥株式會(huì)社研制而成。它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性球菌、 支原體、衣原體、鉤端螺旋體屬、立克次氏體等均有較強(qiáng)的抗菌效果，主要用于中 輕度感染或重度感染的恢復(fù)期，還可以作為獸藥。 交沙霉素由納兒榜鏈霉菌交沙霉素變種( sn a r b o n e n s i sv a tj o s a m y c e t i c u s ) 產(chǎn) 生。它通過(guò)發(fā)酵可以產(chǎn)生兩種有效組分，一個(gè)是交沙霉素s 組分，另一個(gè)是交沙霉素 a 組分。在臨床上常用的是a e f t 分，即我們所說(shuō)的交沙霉素。交沙霉素分子 式：c 4 2 h 6 8 0 1 5 n ；分子量8 0 6 士8h i l l 蒸汽壓法) ；8 6 5 ( 滴定法) 。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如副2 2 】： c h 3 = 交沙霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式 t h es t r u c t u r eo f j o s a m y c i n 產(chǎn)生菌的形態(tài)特征： 納兒榜鏈霉菌交沙霉素變種 n a r b o n e n s ijv a t , j o s a m y c et ic u s ) 孢子絲直。孢橢 圓，表面光滑。 1 1 1 交沙霉素理化性質(zhì) 交沙霉素是無(wú)色針狀結(jié)晶( 苯) ，弱堿性，p k a 7 1 。熔點(diǎn)為1 3 0 - 1 3 3 0 c 。易溶于甲 醇、乙醇、丙酮、氯仿、醋酸乙酯、醋酸丁酯、二氧六環(huán)及酸化水，可溶于丁醇、 乙醚、四氯化碳、苯及甲苯，難溶于水、石油醚、正己烷。其鹽酸鹽、硫酸鹽溶于 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 8 屆碩士學(xué)位論文 水。交沙霉素用硫酸作紅霉素試驗(yàn)為紅色，加熱會(huì)變成暗紫色；用鹽酸作碳霉素試驗(yàn) 為紅色；問(wèn)苯三酚鹽酸鹽試驗(yàn)為橙黃色。薄層層析板d r a g e n d o r f f 反應(yīng)為橙色。三氯化 鐵、堿性硝酸鍛、茚三酮、雙縮脈、f e h l i n g ，l i o l i s c h , m i l l o n 反應(yīng)陰性。 1 1 2 交沙霉素的抗菌活性和特點(diǎn) 交沙霉素是廣譜抗菌素，其抗菌譜與紅霉素相似。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及部分革 蘭氏陰性細(xì)菌包括金黃葡萄球菌，溶血性鏈球菌、淋球菌、雙球菌腦膜炎、百日咳 桿菌、支原體、衣原體等有很高的活性。其最低抑菌濃度為o 0 3 0 7 8 u g m l 。對(duì)螺旋 體，立克次氏體及大型病毒也較有效。以下是交沙霉素對(duì)部分瘸原蕊的最低抑制濃 度燃。 表1 。交沙霉素對(duì)部分病原菌盼最低抑制濃度 t a b l e1 t h el o w e s tc o n t r o lc o n c e n t r a t i o no f j o s a m y e i nt os o m ep a t h o g e n y 病原菌名稱(chēng) 最低抑制濃度( 毫克毫升) 藤黃夕疊球菌p c i l 0 0 1 金黃葡萄球菌2 0 9 p 枯草桿菌6 6 3 3 大腸桿菌o 12 肺炎克氏桿菌p c i 6 0 2 傷寒沙f l 氏蘸 1 9 0 l w 肺炎雙球菌i 型 0 0 0 5 o 。3 9 o 1 9 5 0 1 2 。5 5 0 o 7 8 1 1 3 交沙霉素的作用機(jī)理 交沙霉素的主要是抑制病原體蛋自質(zhì)的合成過(guò)程?，F(xiàn)有資料表明，所有的大環(huán) 內(nèi)酯類(lèi)抗生素均可不同程度地抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素能與細(xì)菌 核糖體5 0 s 亞單位的2 3 s 核糖體r n a ( 2 3 s r n a ) 上的特殊靶位及核糖體上的l 1 6 蛋白 質(zhì)結(jié)合。而1 6 元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素能抑制肽酞基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而抑制肽鏈的延 長(zhǎng)。最近通過(guò)一系列研究提出了比較可信的假說(shuō)，即所有大環(huán)肉酯類(lèi)化合物能與核 糖體5 0 s 亞單位的l 2 2 及l(fā) 2 7 蛋自質(zhì)結(jié)合，在肽鏈延長(zhǎng)階段能促使肽酸基_ t 心敞從核糖 體解離，從兩挪制蛋自質(zhì)合成口n 。 1 1 4 交沙霉素的生物合成和化學(xué)改造 其生物合成內(nèi)酯環(huán)是由5 個(gè)乙酸單位、1 個(gè)丙酸單位、1 個(gè)丁酸單位、1 個(gè)羥基乙 酸單位透過(guò)與脂肪酸合成相似的聚酮體( p o l y k e u d e ) 途徑縮合而成。其基本過(guò)程是由 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 低級(jí)脂肪酸( 乙酸、丙酸、丁酸) 經(jīng)活化后，以丙二酰，丙?；蚣谆５男问?， 由酰基攜帶蛋白( a c p ) 介導(dǎo)經(jīng)聚酮縮合酶將碳鏈不斷延長(zhǎng)，最后由硫酯酶催化進(jìn)行碳 鏈的環(huán)化形成聚酮體內(nèi)酯。在碳鏈的延長(zhǎng)過(guò)程中可伴隨有還原、脫水等反應(yīng)，導(dǎo)致 聚酮內(nèi)環(huán)中酮基或烯基的形成。聚酮內(nèi)酯環(huán)形成后再進(jìn)行配糖體的糖苷化、內(nèi)酯環(huán) 不同碳位上的甲基化、經(jīng)基化及糖分子c 位上的?；揎棧罱K合成了交沙霉素。 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素有一個(gè)主要的缺點(diǎn)，在體內(nèi)易被酶解，打開(kāi)內(nèi)酯環(huán)或脫去酞 基而失活。交沙霉素也有同樣的缺點(diǎn)，但可以通過(guò)對(duì)它的結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)改造來(lái)克服 這些缺點(diǎn)。目前對(duì)交沙霉素改造的半合成新品種中有效的還不多，在國(guó)內(nèi)僅有丙酸 交沙霉素投入生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。其結(jié)構(gòu)式如下： c h 3 c h 2 丙酸交沙霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式 t h es t r u c t u r eo f j o s a m y e i np r o p i o n a t e 1 2 抗生素的一般分離純化方法 抗生素提取的方法一般有下面四種：( 1 ) 溶媒萃取法；( 2 ) 吸附法；( 3 ) 離子 交換法；( 4 ) 沉淀法。在提取過(guò)程中，可根據(jù)抗生素分離的難易，上述四種提取方 法，可以單獨(dú)使用，也可以配合使用。 1 2 1 溶媒萃取法 溶媒萃取法的原理是利用抗生素和雜質(zhì)在溶媒中的溶解度不同，將抗生素選擇 性地從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑而達(dá)到濃縮去雜的目的。溶媒萃取法的效率和抗 生素( 溶質(zhì)) 在兩種溶劑中的分配系數(shù)有密切關(guān)系。由于用來(lái)提取發(fā)酵濾液的溶劑通 常都是比水輕的有機(jī)溶媒，因此抗生素在溶媒和發(fā)酵濾液這兩種不同液相中的分配 3 華巾農(nóng)盈文學(xué)2 8 瑤碩士學(xué)位論文 系數(shù)越大，則所用的溶媒量越少，濃縮的倍數(shù)也就越高。 1 2 2 吸附法 吸附法是利用一種適當(dāng)?shù)奈絼?，把發(fā)酵濾液中的抗生素吸附，然蘑再以有機(jī) 溶劑把抗生素從吸附劑上洗脫下來(lái)，再經(jīng)濃縮后即可得到抗生素的初制品；另方 面，也可以利用吸附劑先吸附發(fā)酵濾液中的雜質(zhì)和色素物質(zhì)等，而使抗生素有效成 分仍留在濾液中，然后改變?yōu)V液的p h 值，再把抗生素轉(zhuǎn)入新的吸附劑上而達(dá)到濃 縮的目的。 1 2 3 離子交換法 離子交換法主要是利用某些抗生素分子能電離成陽(yáng)離子或陰離子，從麗可以和 陽(yáng)離子和陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行交換，而從發(fā)酵濾液中被吸附到樹(shù)脂上，以后又可以 用和樹(shù)脂有更大親和力的洗脫液把抗生素從樹(shù)脂上替換洗脫下來(lái)。這種方法利用離 子交換樹(shù)脂對(duì)予所交換離子的選擇性，可以使抗生素和其它雜質(zhì)分離開(kāi)來(lái)；又因?yàn)樗?耀的洗脫液離予濃度較高，用量可以較少，從而使洗脫溶液的體積可縮小到幾十分 之一，所以又可以達(dá)到濃縮的遐的。 大孔網(wǎng)狀( t m a c r o r e t i c s l a r ) 聚合物吸附劑( 簡(jiǎn)稱(chēng)大孑l 網(wǎng)狀吸附劑) 是六十年代末離 子交換技術(shù)領(lǐng)域最重要發(fā)展之一。采用大孔網(wǎng)狀吸附劑分離、純化抗生素是抗生素 工業(yè)中值得注意的方向。它主要是利用分子間的范德華力和氫鍵的作用，根據(jù)類(lèi)似 物容易吸附類(lèi)似物的原則，一般非極性吸附劑適用于從極性溶液( 如水) 中吸附非極 性有機(jī)物質(zhì)，相反，高極性吸附劑如a m b e r l i t ex a d 1 2 ，特別適用于從非極性溶液 中吸附極性溶震。面中等極性吸附荊，不但能夠從寫(xiě)霉水奔質(zhì)中吸附極性物質(zhì)，而且 由于它們具有一定的憎水性，所以也縫從極性溶液中吸附非極性物質(zhì)。這種非離子 型的多孔骨架，其性質(zhì)和天然吸附劑活性炭相似，在某種程度上要比活性炭?jī)?yōu)越得 多。 大孔網(wǎng)狀吸附劑的優(yōu)點(diǎn)如下：1 對(duì)有機(jī)物的選擇性良好，無(wú)機(jī)鹽的存在非但不 干擾吸附過(guò)程反而有利于附，可從稀溶液里分離出所需物質(zhì)，大大縮短工藝流程。 2 吸附劑的物理和化學(xué)穩(wěn)定性離，機(jī)械強(qiáng)度好，經(jīng)久耐用。2 容易再生，一般用水、 稀酸、稀堿或有機(jī)溶劑，如低級(jí)醇、囂酮幫成，而且分離出來(lái)的物質(zhì)灰分低。4 品 季巾多?？筛鶕?jù)不同要求改變吸附劑孔結(jié)構(gòu)或極性，因此可以吸附多種有機(jī)化合物。 4 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 5 使用方便，一般系小球狀，直徑在0 2 0 8 毫米之間，因此流體阻力較小，不象 粉狀使用不方便。6 脫色能力高，效果不亞于活性炭，如酚醛縮合樹(shù)脂。缺點(diǎn)是大 孔吸附樹(shù)脂價(jià)格昂貴，吸附效果易受流速、p h 和溶質(zhì)濃度影響。 大孔網(wǎng)狀吸附劑的解吸方法：1 常用的是低級(jí)醇、酮或其水溶液解析。如甲 醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、水等。所適用的溶劑應(yīng)符合兩種要求：一種是溶劑 應(yīng)能使大孔網(wǎng)狀吸附劑溶漲，這樣可減弱溶質(zhì)與吸附劑之間的吸附力，另一種是所 選用的溶劑應(yīng)容易溶解吸附物，因?yàn)榻馕鰰r(shí)不僅必須克服吸附力，而且當(dāng)溶劑分子 擴(kuò)散到吸附中心后，應(yīng)能使溶質(zhì)溶解。2 對(duì)弱酸性物質(zhì)可用堿來(lái)解吸；弱堿性物質(zhì)可 用酸來(lái)解吸；吸附系在高濃度鹽類(lèi)溶液中進(jìn)行時(shí)，則常常僅用水洗就能解吸下來(lái)；對(duì)于 易揮發(fā)溶質(zhì)可用熱水或蒸汽解吸。 近年來(lái)，國(guó)外應(yīng)用大孔吸附劑作為分離純化微生物藥物的報(bào)道不少，其中抗生 素的分離、提取、濃縮、純化方面幾乎包括目前己知抗生素的各種類(lèi)型化合物，主 要列出以下十幾種抗生素在生產(chǎn)過(guò)程中使用的大孔吸附劑( 見(jiàn)下表2 ) 。 表2 大孔吸附劑在抗生素分離純化上的應(yīng)用 t a b l e2 t h ea p p l i c a t i o no fm a c r o p o r o u sa d s o r b e n tr e s i no na n t i b i o t i c p r o d u c ti o n 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用大孔網(wǎng)狀吸附劑分離純化各類(lèi)微生物代謝物的方式方法，大 致可歸納為如下幾點(diǎn)：1 發(fā)酵終止時(shí)直接加入吸附劑。2 同一種吸附劑反復(fù)兩次使 用，以達(dá)到純化目的。3 用稀醇或稀酮洗去雜質(zhì)，再用濃醇或濃酮洗脫。4 改變p h 值 洗脫。5 以稀醇洗去雜質(zhì)，再換酮或酯洗脫。6 梯度洗脫。6 大孔網(wǎng)狀吸附劑與氧 化鋁a c l 2 或硅膠柱層析連用純化。這為微生物制藥和從重組微生物發(fā)酵液中分離、 提取、濃縮、純化等方面提供了極重要的手段。 1 2 4 沉淀法 沉淀法則利用了某些抗生素能和某些酸、堿或鹽類(lèi)形成不溶性的鹽或復(fù)合物而 沉淀，且此沉淀在改變條件后，又可以使沉淀物重新溶解的特性。利用這個(gè)原理來(lái) 進(jìn)行抗生素的提取操作，稱(chēng)為沉淀法。對(duì)于堿性和兩性的抗生素可以用不同種類(lèi)的 酸作為沉淀劑，使其沉淀下來(lái)；酸性抗生素可以和有機(jī)堿形成鹽而沉淀出；多肽類(lèi)抗生 素則可以用鹽析法使溶解度降低而沉淀。沉淀下來(lái)的抗生素可用水或稀酸溶液溶解 后，再用有機(jī)溶劑提取，然后經(jīng)過(guò)濃縮或用另外的溶液使抗生素結(jié)晶出來(lái)，即可得 到較純的抗生素純品。 1 3 抗生素的分離純化新技術(shù)進(jìn)展 1 3 1 雙水相技術(shù)在抗生素分離純化的應(yīng)用 雙水相系統(tǒng)是指某些高聚物之間或高聚物與無(wú)機(jī)鹽之間在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热?6 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 解形成互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)。通過(guò)溶質(zhì)在相間的分配系數(shù)的差異而進(jìn)行 萃取的方法即為雙水相萃取。最常見(jiàn)的系統(tǒng)是聚乙二醇( p e g ) 葡聚糖( d e x ) 水和 p e g 磷酸鹽水系統(tǒng)。雙水相技術(shù)作為液液萃取中重要的純化技術(shù)被廣泛的用于生 物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的下游工程中【1 9 】。 根據(jù)傳統(tǒng)的雙水相技術(shù)的理論，只有大分子才能由于界面張力等因素造成兩相 之間的不對(duì)稱(chēng)分配，小分子在雙水相中的分配系數(shù)接近于l 。但近幾年來(lái)，雙水相技 術(shù)在小分子如氨基酸、抗生素的分離中的應(yīng)用研究日益活躍，不僅打破了傳統(tǒng)理論 限制，而且為微生物發(fā)酵全醪液的直接分離提供了更有利的手段。目前雙水相萃取 在生物小分子分離中的應(yīng)用研究文獻(xiàn)數(shù)量很少，而且研究時(shí)間短，但已有的成果表 明雙水相技術(shù)在生物小分子中的應(yīng)用不僅可行而且在理論上也有別于生物大分子在 雙水相系統(tǒng)中分配行為。 雙水相萃取法的特點(diǎn)是能保留產(chǎn)物的活性，整個(gè)操作可以連續(xù)化，在除去細(xì)胞 或碎片時(shí)，還可以純化蛋白質(zhì)2 5 倍，與傳統(tǒng)的過(guò)濾法或離心法去除細(xì)胞碎片相比， 無(wú)論在收率上還是成本上都優(yōu)越的多，與傳統(tǒng)的鹽析或者沉淀法相比也有很大優(yōu)勢(shì)， 如以b 半乳糖甘酶為例，用沉淀法和雙水相純化的結(jié)果比較見(jiàn)表1 1 表3 且半乳糖甘酶不同純化方法的比較 t a b l e3 t h ec o n t r a s to fd i f f e r e n tm e t h o d so fp u r i f i c a t i o nb - s e m i l a c t o s e 近年來(lái)，很多研究關(guān)于小分子生物活性物質(zhì)的親和雙水相萃取的研究，如對(duì)頭 孢霉素、紅霉素、氨基酸等取得了很大進(jìn)展，大大的擴(kuò)展了應(yīng)用范疇并提高了選擇 性，使雙水相萃取技術(shù)具有更廣闊的應(yīng)用前景。 用雙水相法提取泰洛星是一個(gè)比較成功的例子【2 6 1 ，泰洛星發(fā)酵液是一個(gè)復(fù)雜的 多相體系，且發(fā)酵液呈黏稠的流體態(tài)，即使在經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，過(guò)濾仍很困難，產(chǎn)品 損失嚴(yán)重。采用雙水相萃取法從未過(guò)濾的全發(fā)酵液中萃取取泰洛星，大概過(guò)程如下， 首先發(fā)酵液經(jīng)過(guò)預(yù)處理后加入1 4 p e g 4 0 0 0 和2 0 n a 2 h p 0 4 ，然后離心分相，用p e g 相調(diào)p h 8 9 ，接下來(lái)用乙酸乙酯萃取，最后真空蒸發(fā)結(jié)晶。此法省去了發(fā)酵液的過(guò)濾， 將3 次調(diào)節(jié)p h 改為只需調(diào)節(jié)1 次，使泰洛星失活的可能性大大降低，減少了溶劑的用 量，縮短了工藝流程。泰洛星是弱堿性物質(zhì)，p h 直接影響其疏水性和帶電性，因此 選取中度聚合的p e g 4 0 0 0 為成相高聚物。加入n a 2 腫0 4 后系統(tǒng)p h 偏堿性，泰洛星的 7 華串農(nóng)盈大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)氆論文 分配系數(shù)較大。p e g 和無(wú)機(jī)鹽濃度均產(chǎn)生正效應(yīng)。雖然高濃度的p e g 能夠增大分配 系數(shù)，但同樣增大了高聚相的黏度，使提取變得困難。通過(guò)均勻設(shè)計(jì)選擇最終體系。 正因?yàn)橹T多優(yōu)點(diǎn)的存在使雙水相技術(shù)豹應(yīng)用前景非常廣闊。當(dāng)然，雙永相萃取 也存在著某些缺點(diǎn)制約著其大規(guī)模應(yīng)用 ；| 蛩發(fā)展，例如某些離聚物的價(jià)格高，常常需 要高濃度的鹽才能進(jìn)行有效的分離，因此難以應(yīng)用于無(wú)法使用離鹽濃度的親和分離 過(guò)程。在使用雙水相技術(shù)純化生物大分子時(shí)與一般色譜法相比，分離度及純化倍數(shù) 不高，這也是雙水相萃取需要改進(jìn)的地方。經(jīng)過(guò)前人多年的研究，已經(jīng)在雙水相的 基礎(chǔ)上形成了雙水相親和分配、雙水相萃取同膜技術(shù)結(jié)合以及液體交換劑等。 1 ：3 2 膜技術(shù)在抗生素分離純化的應(yīng)用 膜分離的實(shí)質(zhì)是物質(zhì)通過(guò)膜的傳遞速度不同，依靠膜的選擇性將液體中的組分 進(jìn)行分離。由于傳遞機(jī)理和推動(dòng)力可以是多種多樣的，如濃度差，壓力差，電位差， 溫度差等，膜分離過(guò)程也可分為多種【柏】，重要的膜分離過(guò)程于表1 3 。滲透是一個(gè)擴(kuò) 散過(guò)程，在滲透中只有溶劑產(chǎn)生流動(dòng)，如果同時(shí)產(chǎn)生溶質(zhì)的流動(dòng)，則稱(chēng)為透析。氣 體透過(guò)系利用微孔或無(wú)孔的膜進(jìn)行氣體分離。滲透、氣體透過(guò)等在工業(yè)上應(yīng)用很少。 表4 各種膜分離過(guò)程籬麥 過(guò)程透過(guò)物質(zhì)推動(dòng)力截留物質(zhì) 膜分離與傳統(tǒng)豹抗生素提煉工藝相比具有很多優(yōu)點(diǎn)，大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，一 次性投資，維護(hù)，操作簡(jiǎn)單，運(yùn)行費(fèi)用低，節(jié)省資源；運(yùn)行無(wú)相變化不破壞產(chǎn)品的 結(jié)構(gòu)，分離效率高，提高了產(chǎn)品的收率和質(zhì)量；不需要溶劑或溶劑用量大大減少， 因此廢水也更容易處理【4 】。此外可在常溫下連續(xù)操作，可直接放大，可專(zhuān)一配膜等 特點(diǎn)。用于抗生素分離和純化中的膜分離技術(shù)主要涉及微濾、超濾、納濾等液膜分 離和反滲透等。 大多數(shù)抗生素的分子量在3 0 0 1 2 0 0 范圍內(nèi)，而通常超濾膜的截留分子量為 1 0 0 0 3 0 0 0 之聞，因此超濾能用予發(fā)酵液的過(guò)濾鞠細(xì)胞收集?？股啬芡高^(guò)超濾膜， 8 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 而蛋白質(zhì)、多肽、多糖等雜質(zhì)等被截留，這對(duì)后續(xù)操作是很有利的。m i l l i p o r e 公司 用截留分子量1 0 0 0 的膜，以卷式超濾器進(jìn)行頭孢霉素發(fā)酵濾液的試驗(yàn)表明，不僅透 過(guò)液中蛋白質(zhì)等大分子含量較低，而且可除去紅棕色色素。發(fā)酵液中的色素通常為 低分子量物質(zhì)，可能與蛋自質(zhì)結(jié)合在一起，因而能被截黧。 納濾( n a n o f i l t r a t i o n ，筒稱(chēng)x f ) 膜及其相關(guān)過(guò)程的出現(xiàn)大大地促進(jìn)了膜技術(shù)在 液體分離領(lǐng)域的應(yīng)用。早期的具有納濾性質(zhì)的膜名稱(chēng)并不統(tǒng)一，7 0 年代以色列 d e s a l i n a t i o ne n g i n e e r i n g 公司將介于反滲透與超濾之間的膜分離稱(chēng)為“雜化過(guò)濾 ( h y b r i f i l t r a t i o n ) ”。美國(guó)f i l m - t e c h 公司根據(jù)相應(yīng)膜的截留分子量膜孔徑尺寸大約 為一至幾個(gè)納米的特征，把這種膜技術(shù)稱(chēng)之為納濾。納濾分離過(guò)程無(wú)任何化學(xué)反應(yīng)， 無(wú)需加熱，無(wú)相轉(zhuǎn)變，不破壞生物活性，適用于相對(duì)分予質(zhì)量1 0 0 0 以下的物質(zhì)。絕 大部分藥物的相對(duì)分子質(zhì)量都在這個(gè)范圍內(nèi)，顯納濾技術(shù)節(jié)能，環(huán)境友好，因囂越 來(lái)越多的被用到制藥工業(yè)的各種分離、精制和濃縮過(guò)程中。 抗生素的相對(duì)分子質(zhì)量大都在3 0 0 1 2 0 0 范圍內(nèi)。其生產(chǎn)過(guò)程為先將發(fā)酵液澄 清、用選擇性溶劑萃取，再通過(guò)減壓蒸餾得到。納濾膜技術(shù)可以從兩個(gè)方面改進(jìn)抗 生索的濃縮和純化工藝：( 1 ) 用n f 膜濃縮未經(jīng)萃取的抗生素發(fā)酵濾液，除去水和無(wú) 機(jī)鹽，然后再萃取。這樣可以大幅度地提高設(shè)備的生產(chǎn)能力，并大大減少萃取劑的 用量。( 2 ) 用溶劑萃取抗生素詹，用耐溶荊納濾膜濃縮萃取液，透過(guò)的萃取劑可循環(huán) 使用。耀膜已成功地應(yīng)潮于紅霉素、金霉素、萬(wàn)古霉素和青霉素等多耪抗生素的濃 縮和純化過(guò)程。v b l 2 由發(fā)酵锝到，傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，產(chǎn)率低。納濾膜可應(yīng)用于 如下過(guò)程：用微濾替代傳統(tǒng)的過(guò)濾，經(jīng)微濾的發(fā)酵清液用n f 膜可濃縮1 0 倍以上， 從而大大減少了萃取劑用量，并提高了設(shè)備的生產(chǎn)能力。粗產(chǎn)品純化過(guò)程中所使用 的溶劑，也可以用n f 膜處理回收使用。 鹽酸林可霉素精制時(shí)，通常采用丙酮結(jié)晶工藝，結(jié)晶后的丙酮母液效價(jià)在2 0 0 0 u 臻羔左右，食鹽酸林可霉素6 ，對(duì)于這部分鹽酸林可霉素的回收一般采用低溫童 然沉降法，回收率大約在l 一2 ，剩余部分黧在回收丙酮后的殘?jiān)信诺袅松拧?。?多制藥廠試圖用反滲透膜和一般的納濾膜來(lái)濃縮回收鹽酸林可霉素，但未獲成功， 原因是鹽酸林可霉素丙酮母液中含有大量的丙酮，一般的反滲透膜及納濾膜無(wú)法抵 受有機(jī)溶劑的侵蝕。而h y d r o c h e m 公司提供的s e l r o t m 耐溶媒納濾膜由于其超乎尋 常的溶劑穩(wěn)定性使得母液回收獲得成功，總收率可達(dá)8 0 以上，結(jié)晶出的鹽酸林可 9 華中農(nóng)監(jiān)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 霉素符合c p 2 0 0 0 的要求，因此用耐有機(jī)溶媒的納濾膜從母液中回收鹽酸林可霉素是 一個(gè)切實(shí)可行的方法。 螺旋霉素( s 嘲是一種常用的抗生素藥物，目前，s p m 都是經(jīng)好氣培養(yǎng)、去除發(fā) 酵液中固體、調(diào)整過(guò)濾液的p h 值后，再經(jīng)有機(jī)溶媒萃取工藝裁成。該工藝存在有機(jī) 溶劑耗量大、s p m 得率低、排放的大量廢液嚴(yán)重污染環(huán)境等聞?lì)}。由于是3 種相對(duì) 分子質(zhì)量分別為8 3 0 、8 8 4 、8 9 8 的s p m 構(gòu)成的混合物，故采用陋膜會(huì)獲得很好的分 離效果。蔡邦肖選用自制的聚酰胺型n f 膜對(duì)s p m 發(fā)酵液進(jìn)行濃縮研究，采用全循環(huán) 操作方式嘲。結(jié)果表明，在進(jìn)料流量5 5 l h 、操作壓力1 5 m p a 條件下，采用納濾膜 濃縮s p m ，發(fā)酵液中的螺旋霉素幾乎全部被截留，膜的滲透通量可高達(dá)3 0 l h ，滲透 液的吸光率幾乎為零，大大提高了濃縮倍數(shù)，得率高，滲透通量高。但由于發(fā)酵液 中含有較高濃度的低相對(duì)分子質(zhì)量蛋自質(zhì)、無(wú)祝鹽等，這些物質(zhì)對(duì)膜表面會(huì)產(chǎn)生嚴(yán) 重的污染是導(dǎo)致納濾滲透通量降低的主要原因。圭此可見(jiàn)，s p m 發(fā)酵液預(yù)處理過(guò)程 設(shè)計(jì)微濾膜后的超濾膜工藝中，去除大分子，然后離心分離去除溶解的固形物包括 大部分無(wú)機(jī)鹽是十分必要的。而在納濾過(guò)程，設(shè)計(jì)高的料液流量、提高膜面流速以 及開(kāi)發(fā)清洗技術(shù)，這對(duì)于保持s p m 發(fā)酵液濃縮過(guò)程膜的滲透通量水平、提高濃縮倍 數(shù)是至關(guān)重要的。 另夕 ，陋膜還成功遣應(yīng)用于紅霉素、金霉素、萬(wàn)古霉索等多種抗生素的濃縮和 純優(yōu)過(guò)程。以上抗生素納濾膜法濃縮、純純的王藝大體相同，待濃縮的發(fā)酵母液加 入料罐中，料液經(jīng)過(guò)濾、加高壓壓入膜組件，濃縮液循環(huán)回料罐中，經(jīng)一定時(shí)聞循 環(huán)，直至達(dá)到規(guī)定的濃縮倍數(shù)。由此可見(jiàn)，由于納濾膜具有敏銳的截留能力、離的 分離效率，相對(duì)分子質(zhì)量截留區(qū)恰好介于超濾膜和反滲透膜之間，因而對(duì)低分子抗 生素類(lèi)產(chǎn)品的濃縮、分離純化有獨(dú)到之處。若采用耐溶劑、耐酸堿的納濾膜，則更 具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景，環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益兼收。 1 4 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的分離方法 已工業(yè)化生產(chǎn)的幾種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的分析技術(shù)比較成熟，參照它們的分析 手段可以對(duì)研發(fā)新型的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素提供一定的參考。同時(shí)可以參照已知道品 種的檢測(cè)方法盡快找到適宜的分析檢測(cè)條件和方法，便于改進(jìn)試驗(yàn)方法，優(yōu)化工藝 路線洶】。 主要分析方法包括：薄層層析、紙層析、氣穗色譜、h p l c 、毛細(xì)管電泳。這些技 1 0 華中農(nóng)娩大學(xué)2 0 0 8 耩碩攀位論文 術(shù)已經(jīng)用于從發(fā)酵液中分離和定量分析這些大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，以及用于臨床測(cè)量 這類(lèi)抗生素在生物體內(nèi)的情況，包括血液，血漿，血清，尿液和組織液。同時(shí)也用 到了其它筋檢測(cè)手段，包括生物盤(pán)顯影、紫外分光度測(cè)定、熒光法檢測(cè)、龜化學(xué)檢 測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、質(zhì)譜技術(shù)等u h p l c 分析大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的難點(diǎn)在于；在偏酸性的條件下，親脂的堿性化 舍物和色譜柱的硅醇基相互作用，導(dǎo)致色譜峰拖尾，而偏堿性條件雖然可以抑制拖 尾，但是普通色譜柱填料在偏堿性條件下不穩(wěn)定。由于色譜填料技術(shù)的發(fā)展，上述 矛盾已經(jīng)得到解決。目前，可以選擇各類(lèi)硅醇基反應(yīng)活性低，p h 耐受離的色譜柱。 對(duì)于普通色譜柱，通過(guò)適當(dāng)處理，如將色譜柱封入含甲醇的酸性流動(dòng)相，置1 2 0 溫 度下老化，祛除填料中的金屬雜凄，這樣也可以適當(dāng)抑制色譜峰拖尾的現(xiàn)象；檢 測(cè)靈敏度低。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素通常紫外區(qū)僅具有末端吸收，故紫處檢測(cè)通常選擇 2 1 0 n m 一- - 2 3 0 n m 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，采用更低的檢測(cè)波長(zhǎng)理論上可提高靈敏度，由于受流 動(dòng)相、儀器狀態(tài)等限制，有時(shí)信噪比并不能得到明顯的改善，達(dá)不到預(yù)期效果。為 此有文獻(xiàn)報(bào)道，采用熒光檢測(cè)器、庫(kù)侖( 電量) 檢測(cè)器檢測(cè)法或者采用氣相色譜與 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，提高對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素檢測(cè)的靈敏度。 1 4 1 紅霉素類(lèi)抗生素的分析方法 紅霉素由放線菌屬的紅霉素鏈霉菌產(chǎn)生，紅霉素a ( e a ) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)是紅霉素家 族的基本結(jié)構(gòu)。紅霉素的產(chǎn)品中含有許多微量的雜質(zhì)，包括一些紅霉素的鹽和酯的 衍生物，和紅霉素的代謝物及其它類(lèi)似物等。 1 4 1 17 l c 和p c 方法 謦前有很多研究剩用t l c 幫咒方法對(duì)紅霉素及其相關(guān)化合物進(jìn)行分析的條件。利 用各種有機(jī)試劑的混合液在硅膠薄層板上對(duì)紅霉素進(jìn)行展囂，用5 0 的硫酸水溶液顯 色，還可以用1 0 的硫酸加入1 的硫酸锫和2 5 的鋁酸作為顯色劑n 2 3 可以通過(guò)t l c 方 法對(duì)紅霉素的甲醇溶液進(jìn)行半制備n 3 3 e s t e r b o o k 和h e r s e y 利用生物自顯影的方法在 t l c 上對(duì)紅霉素進(jìn)行分離n 鍆。k i b w a g e 利用k i e s e l g e lg f 2 5 ：板分離紅霉素混合物，顯 色劑為對(duì)甲氧基苯甲醛：硫酸：乙醇= 1 ：l ：9 。他還提供了各種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在此 條件下的r f 值秘鞋。類(lèi)似i 褥t l c 方法還用予半定量分析鼠的尿液和糞便中的紅霉素及其 代謝物。c a c h e t 等利用k i e s e l g e l 6 0 f 2 馘板分離獸藥中的紅霉素，昱色荊為4 一甲氧基 苯甲醛：硫酸：乙醇= l ：l ：9 1 叭。 華串農(nóng)鹽大學(xué)2 8 屆碩士學(xué)位論文 1 4 1 2 肝l c 方法洶】 h p 是一種被廣泛采用的紅霉豢及相關(guān)化含物的分析方法，可以對(duì)各種不同的 基震進(jìn)行定量分析，包括各種原料藥、藥物制裁幫生物樣晶等。 因秀紅霉素簽結(jié)梅孛缺乏發(fā)色蒸霆，新以需要較低翁紫井檢測(cè)波長(zhǎng)，一般檢測(cè) 紅霉素及程關(guān)純合耪的紫外波長(zhǎng)定在21 5 r a n ，悉且在分柝前必須進(jìn)行柱前預(yù)處理以去 除干擾雜質(zhì)。k i y o s h it s u j i ( 1 9 7 8 ) 等人利用反楣柱，相似的流動(dòng)相，鞘有不凰的有 機(jī)相和醋酸銨緩沖液( 相應(yīng)的p h 為6 2 ，7 o ) ，對(duì)紅霉素及其衍生物進(jìn)行分離，紫外 檢測(cè)波長(zhǎng)為2 1 5 n m ，為了縮短分析時(shí)間提高柱溫到7 0 n 酊。g i u li a n op e ll e g a t t a 建 立的色譜系統(tǒng)用于分析發(fā)酵液中的e a ，醯，e c ，和其它立體異構(gòu)體以及降解產(chǎn)物，h p l c 方法也用于e e s c 片荊中麴紅霉素檢測(cè)。 鍘各囂p 比( p r e p a r a t i v eh p 方法剝震折巍測(cè)定法獻(xiàn)發(fā)酵殘?jiān)鼘彿蛛x紅霉素 及其柱關(guān)物質(zhì)。這些化合物隨囂尾分析型反槌柱( a n a l y t i c a l r e v e r s e d - p h a s e c o l u m n ) 在4 0 0 和2 1 5 n m 下進(jìn)行分析。利用p a r t i s i lo d s 柱從紅霉素的原料藥中分離e ， 還用于研究紅霉素降解產(chǎn)物，兩者的流動(dòng)相稍有不同，p h 值由6 。5 調(diào)整為4 o ，可以 成功分離出e a ，a e ，e a e e ，p s e a e e 等物質(zhì)。s t u b b s 和k a n f e 在e e s 的片劑和懸濁液穩(wěn)定性 指示試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，e e s 在甲醇中不穩(wěn)定，在乙睛中也有類(lèi)似的現(xiàn)象。后來(lái)又用類(lèi)似的 h p l c 方法證實(shí)了紅霉素及其酯類(lèi)純合物在甲醇和乙蒲中存在的不穩(wěn)定的現(xiàn)象瀾。暖 囂方法熬之不冀毪子的切換技術(shù)，剝用反檑桂翮乙騎一磷酸鹽緩沖滾，球6 5 - t m a ( 零 b a ) 一水的流動(dòng)相可以實(shí)現(xiàn)矬，醛，聰，匪，e f ，p s e a e e ，e ae e 的分離。c a c h e t 等 優(yōu)化了紅霉素及其相關(guān)物質(zhì)的h p l c 系統(tǒng)條件。作者研究t p h 值對(duì)e a e e ，e b ，a ea ，e a ， e d ，e c ，d m e e a 的k 值的影響。當(dāng)p h 值豳6 o 升為7 5 時(shí)，對(duì)于e a e e 的影響顯著，對(duì)于e b 的影響次之，對(duì)于其它組分的影響較弱。流動(dòng)相中加入季銨鹽，如t 姒和t b a 可以改 善峰的形狀，減小傈留時(shí)閹。 1 4 2 其它大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素分離分析方法 ( 1 ) 螺旋攥素( s p i r a m y e i n ) 。螺旋霉素f l l s t r e p t o m y c e s am b o f a c i e n ：產(chǎn)生，主要由曼種 主要的緊密相關(guān)的物質(zhì)和其它一些次要物質(zhì)組成。螺旋霉素i ( si ) 是主要物質(zhì)，占混 合物的6 3 ，螺旋霉素i i 和m ( s h 和s i n ) 各占2 4 和1 3 。這一系列的化合物都有一 個(gè)重6 元囂內(nèi)酯環(huán)。其它種類(lèi)的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素可以直接由發(fā)酵液分離得到，而螺 旋霉素豹色譜分離劉是把主要組分分離毒來(lái)，因此傳統(tǒng)靜微生物試驗(yàn)方法就沒(méi)有了 1 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 0 8 屆碩士學(xué)位論文 選擇性和靈敏性。建立直接由發(fā)酵液分離螺旋霉素的具有選擇性的h p l c 方法，以及 能夠分析生物樣品中的螺旋霉素的方法。這些方法有用普通柱的，有用反相柱的， 檢測(cè)方法是2 3 0 r i m 下的u v 檢測(cè)，因?yàn)槁菪顾氐膬?nèi)酯環(huán)上有一個(gè)共軛雙鍵。m o u r o t ( 1 9