（生物物理學(xué)專業(yè)論文）兩種不同細(xì)胞顆粒分泌機(jī)制的初步研究.pdf

華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 真核細(xì)胞一般通過囊泡( v e s i c l e ) 完成生物分子的跨膜運(yùn)輸，且細(xì)胞內(nèi)不同囊泡 肩負(fù)不同物質(zhì)的運(yùn)輸任務(wù)。我們成功的在p c i 2 細(xì)胞中用熒光蛋白標(biāo)記了兩類囊泡， 并研究了它們在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的動力學(xué)特性及分子機(jī)制。 雖然很多細(xì)胞是通過囊泡運(yùn)輸各種物質(zhì)的，但在有些細(xì)胞中，如自然殺傷( n a t u r a l k i l l e r ，n k ) 細(xì)胞，卻是通過分泌溶酶體( s e c r e t o r yl y s o s o m e ) 運(yùn)輸各種生物分子的。 自然殺傷細(xì)胞對癌細(xì)胞、病毒、胞內(nèi)寄生菌和老化變異細(xì)胞都具有極強(qiáng)的清除能力， 對其分泌機(jī)制的研究將有助于攻克某些人類疾病。目前我們已經(jīng)成功的對自然殺傷 細(xì)胞中分泌溶酶體的分泌調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了初步研究，同時(shí)對其生成途徑有了一定的 了解。 1 采用全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y , t i r f m ) 在p c i 2 細(xì)胞中研究致密核心大囊泡( 1 a r g ed e n s e c o r e dv e s i c l e s ，l d c v s ) 和 類突觸小囊泡( s y n a p f i c v e s i c l e l i k em i c r o v e s i c l e s ，s l m v s ) 的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌機(jī)制差異。 我們用紅色熒光蛋白2 ( d i s c o s o m as p r e d f l u o r e s c e n t p r o t e i n v a r i a n t 2 ，d s r e d 2 ) 與神 經(jīng)肽y ( n e u r o p e p t i d eyn p y ) 融合標(biāo)記大囊泡，用綠色熒光蛋白( e n h a n c e dg r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e g f p ) 與囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)載體( v e s i c l e a c e t y l c h o l i n et r a n s p o r t e r , v a c h t ) 融合標(biāo)記小囊泡。結(jié)果顯示在5 r a m 外鈣環(huán)境下，兩種囊泡動力學(xué)特征沒有 顯著差異，同時(shí)在膜下s l m v s 的數(shù)目遠(yuǎn)多于l d c v s 。 2 用f m l 4 3 染色發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞在1 0 0 n v l 的p m a 作用5 m i n 后就會出現(xiàn) 分泌現(xiàn)象。使用光學(xué)切片技術(shù)發(fā)現(xiàn)吖啶橙( a c r i d i n eo r a n g e ，a o ) 標(biāo)記的自然殺傷細(xì) 胞在內(nèi)皮細(xì)胞活化后或者在p m a 刺激后其內(nèi)部的分泌溶酶體數(shù)量會大量增加，這種 現(xiàn)象會被蛋自激酶c ( p r o t e i n k i n a s e c ，p k c ) 的抑制劑g 6 6 9 8 3 阻斷，同時(shí)用b r e f e l d i n a ( b f a ) 破壞高爾基體不能阻礙分泌溶酶體的增加，從自然殺傷細(xì)胞的三維重組模 型得到的分泌溶酶體的分布情況進(jìn)一步證實(shí)了以上現(xiàn)象。以上證據(jù)說明分泌溶酶體 的產(chǎn)生有蛋白激酶c 信號通路的參與而且其來源不是高爾基體。 關(guān)鍵詞：分泌；類突觸小囊泡；致密核心大囊泡；全內(nèi)反射熒光顯微鏡；分泌溶酶 體，蛋白激酶c 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t n o m m l l y , v e s i c l e sa r eu s e d t ot r a n s p o r tc a r g om o l e c u l e si ne u k a r y o t i cc e l l s d i f f e r e n t t y p e so fc a r g om o l e c u l e sh a v ed i f f e r e n tt r a f f i c k i n gm e c h a n i s m i nt h i sp a p e r , w eh a v e s u c c e s s f u l l yl a b e l e dt w od i f f e r e n tk i n d so fv e s i c l e sw i t hf l u o r e s c e n tp r o t e i nt os t u d yt h e d y n a m i c s ， m o l e c u l a rm e c h a n i s mo f t h e i r t r a f f i c k i n gi np c i 2 c e l l s a l t h o u g hv e s i c l e sa r eu s e di nm a n yc e l l st ot r a n s p o r tc a r g om o l e c u l e s ，s o m ec e l l s , 、_ s u c ha sn a t u r a lk i l l e r k ) c e l l s ，u s es e c r e t o r yl y s o s o m e s n kc e l l sa r ea b l et ok i l lc a n c e r c e l l ，v i r e s ，p a r a s i t i c a lb a c t e r i ai nc e l l sa n da g i n go rm u t a n tc e l l s t oc l a d f yt h em e c h a n i s m o ft h es e c r e t i o no fn kc e l l si s h e l p f u lf o ru st ot r e a ts o m eh u m a nd i s e a s e s w eh a v e s t u d i e dt h es e c r e t i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo ft h es e c r e t o t yl y s o s o m e si nn k c e l l s m e a n w h i l e ，t h e i rb i o g e n e s i sw a s s t u d i e d 1 t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ( t i r f m ) w a se m p l o y e dt o s t u d y t h ed i f f e r e n c ei n t r a f f i c k i n g a n ds e c r e t i o nb e t w e e n l a r g e d e n s e c o r e dv e s i c l e s ( l d c v s ) a n ds y n a p t i cv e s i c l e - l i k em i c r o v e s i c l e s ( s l m v s ) i np c i 2c e l l s t ov i s u a l i z e d i f f e l ；e n tv e s i c l e s ，w es p e c i f i c a l l yl a b e l e dl d c v s b yf u s i n gn e u r o p e p t i d ey ( n p y ) w i t h d i s c o s o m as p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i nv a r i a n t2 ( d s r e d 2 ) a n ds l m v sb yf u s i n gt h e v e s i c l e a c e t y l c h o l i n et r a n s p o r t e r ( v a c h t ) w i t he n h a n c e dg r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ( e g f p ) t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nd y n a m i c sf o rt h e s e t w ok i n d so fv e s i c l e su n d e rt h e5 m me x t r a c e l l u l a rc a l c i u mc o n d i t i o n s a n dm o r es l m v s w e r el o c a t e dw i t h i nt h es u b p l a s m a l e m m a la r e at h a nl d c v s 2 s e c r e t i o nw a sf o u n di nf m l - 4 31 a b e l e dn kc e l l sa f t e r5 m i no fs t i m u l a t i o nb y 1 0 0 n mp m a b y o p t i c a ls e c t i o n i n gt e c h n o l o g y , t h es i g n i f i c a n ti n c r e a s eo f t h en u m b e ro f s e c r e t o r yl y s o s o m e sc a nb ef o u n di na c r i d i n eo r a n g e ( a o ) l a b e l e dn kc e i l sa f t e rt h e a c t i r a t i o no f p o r c i n ee n d o t h e l i a lc e l l so rt h es t i m u l a t i o no fp m a g 6 6 9 8 3 a ni n h i b i t o ro f p r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) ，c a nb l o c kt h i sk i n do fi n c r e a s e ，b u tb r e f e l d i na ( b f a ) w h i c hc a n b r e a kd o w ng o l g ic a nn o t t h ec h a n g eo ft h en u m b e ro f s e c r e t o r yl y s o s o m e sw a sf u r t h e r c o n f i r m e db yt h e3 - dr e c o n s t r u c t i o no f t h en k c e l l s ，w h i c hs h o w e dt h ed i s t r i b u t i o no ft h e s e c r e t o r yl y s o s o m e s a l lo ft h e s es u g g e s t e dt h a ts e c r e t o r yl y s o s o m e sw e r en o tg e n e r a t e d f r o mg o l g ia n d t h e y w e r e r e g u l a t e db yp k cs i g n a lp a t h w a y k e ) rw o r d s ：s e c r e t i o n ，s l m v s ，l d c v s ，t i r f m ，s e c r e t o r yl y s o s o m e ，p k c i i 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得 的研究成果。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他 個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集 體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名：餌彩 日期： 訓(xùn)牛年r 月7 曰 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有 權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和 借閱。本人授權(quán)華中科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù) 庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 保密口，在年解密后適用本授權(quán)書。 本論文屬于 不保密自。 ( 請?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“4 ”) 學(xué)位論文作者簽名：名年釔 e t 期：緲( 庫f 月7 日 指導(dǎo)教師簽名： 日期：y # 年，月7 日 本研究課題得到國家9 7 3 基金g 1 9 9 9 0 5 4 0 0 0 、 2 0 0 1 c c a 0 4 1 0 0 和國家自然科學(xué)基金n o ：3 0 0 2 5 0 2 3 ， 3 0 0 0 0 0 6 2 ，3 0 1 3 0 2 3 0 資助，同時(shí)還得到h a r a l dj e a n s s o n s s t i f t e l s es a m th a r a l do c hg r e t aj e a n s s o n ss t i f t e l s e 基金資 助。 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 緒論 1 1 分泌囊泡與分泌溶酶體 1 1 1 分泌囊泡 分泌作用是指真核細(xì)胞中含有待分泌物的包被小泡與質(zhì)膜融合，從而將內(nèi)含物 排出胞外的過程。在組成型分泌活動中，分泌作用是自發(fā)進(jìn)行的，但是在調(diào)節(jié)型的 細(xì)胞中，分泌作用必需有信號的觸發(fā)。根據(jù)目前研究結(jié)果，分泌過程可大體分成以 下幾個(gè)主要步驟：轉(zhuǎn)運(yùn)、定向、捆綁、錨定、融合、分泌，每一步驟在不同組織與 細(xì)胞中可略有不同，在同一細(xì)胞的不同步驟也可能有不同的異構(gòu)體參與，在所有步 驟中以膜融合過程最為關(guān)鍵，研究也最多。 在神經(jīng)元細(xì)胞中有兩種類型囊泡，突觸小囊泡和致密核心大囊泡。氨基酸類神 經(jīng)遞質(zhì)例如谷氨酸、甘氨酸和y 丁氨酸及典型的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和兒茶酚胺都貯 存在突觸小囊泡( s m a l ls y n a p t i cv e s i c l e s ，s s v s ) 中【1 1 2 】，而肽類神經(jīng)遞質(zhì)則貯存在 大囊泡中，因?yàn)橛兄旅艿碾娮又行?，故被稱為致密核心大囊洲3 “】。雖然兩種囊泡 有一些共同性質(zhì)，如它們都對鈣敏感，它們的分泌都受v 和t - s n a r e s 介導(dǎo)【5 】 但 是它們的來源、位置和調(diào)控機(jī)制都是不同的。l d c v s 產(chǎn)生于反式高爾基體，以調(diào)控 分泌途徑分泌，s s v s 的膜以組成途徑分泌和回收【6 。s s v s 從活性區(qū)分泌，而l d c v s 從胞體和突觸都可釋放”。大小囊泡需接受不同的刺激然后釋放，以完成不同的神經(jīng) 功能【38 、外。 為了更好的了解神經(jīng)和內(nèi)分泌的功能，我們必須了解大小囊泡的分泌機(jī)制。雖 然對囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的分子機(jī)制做了大量研究工作，但是s s v s 和l d c v s 轉(zhuǎn)運(yùn)和分 泌調(diào)控機(jī)制的差別卻很少有人研究。比較兩種分泌機(jī)制的特性是為了揭示不同的物 質(zhì)是如何通過不同途徑轉(zhuǎn)運(yùn)和不同的鈣機(jī)制進(jìn)行調(diào)控的。 n i n o m i y a 等曾經(jīng)記錄到持續(xù)2 0 m s 的s s v s 快釋放過程和l d c v s 的慢釋放過程 【l 們。但是這一假說卻和h a l l e r 和x u 在1 9 9 8 年記錄到的單胺類在嗜鉻細(xì)胞中的快釋 放過程相矛盾1 1 12 1 。這就提出了一個(gè)問題：是否同種類型囊泡的不同狀態(tài)或者不 同種囊泡的分泌具有多種動力學(xué)分泌機(jī)制。現(xiàn)在膜電容法不能區(qū)分兩種類型囊泡的 一一 1 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 分泌，電流分析法也只能記錄到小部分的分泌。為了回答上面提出的問題，我們 采用了熒光全反射法來觀察不同類型囊泡的分泌。目前，全內(nèi)反射熒光顯微鏡還只 能用于單種熒光染料的激發(fā)，不能用于同時(shí)觀察兩個(gè)以上的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。本項(xiàng)目將采 用一種新型的兩路激光全內(nèi)反射裝置，使同時(shí)動態(tài)觀測兩種細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)成為可能。 p c i 2 細(xì)胞源于腎上腺嗜鉻細(xì)胞的瘤細(xì)胞，是較常用的研究分泌和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的模型 細(xì)胞。 p c i 2 細(xì)胞能合成兒茶酚胺并將其貯存在l d c v s 中，這些l d c v s 有許多性質(zhì)與 神經(jīng)元的l d c v s j ：n 同，在鈣離子的刺激下兒茶酚胺通過細(xì)胞外排作用釋放。這些 l d c v s 在很多方面與s s v s 存在差別。l d c v s 比s s v s 要大的多，并且生化性質(zhì)也有很 大的差別。例如，在細(xì)胞進(jìn)行外排作用后，s s v s 會在釋放點(diǎn)通過胞吞作用被細(xì)胞攝 取，在神經(jīng)末梢處再次裝入典型的神經(jīng)遞質(zhì)。與此相反，l d c v s 則不會在釋放點(diǎn)進(jìn) 行再回收利用。那么s s v s 與囊泡的分泌機(jī)制是否有什么不同呢? 其實(shí)在p c i 2 細(xì)胞 中，除了可以合成兒茶酚胺以外，還可以合成乙酰膽堿，并將其貯存在一類小泡中， 即類突觸小囊泡，它與突觸小囊泡在形態(tài)及生化性質(zhì)上都非常相似。因?yàn)楫?dāng)用神經(jīng) 生長因子n g f 處理p c i 2 細(xì)胞時(shí)，p c i 2 細(xì)胞會具有神經(jīng)元的表現(xiàn)型。因此，人們廣泛 地將這一細(xì)胞系作為研究神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化，及神經(jīng)細(xì)胞的信號傳導(dǎo)的模型， 由于p c i 2 細(xì)胞上存在著l d c v s ，同時(shí)也存在s l m v s l l 3 】，細(xì)胞來源可靠，便于分子生 物學(xué)操作，因此p c i 2 細(xì)胞可以作為大小囊泡分泌機(jī)制的比較研究的模型。 m i n t h 等于1 9 8 6 年克隆得到人神經(jīng)肽y 基因【l ，n p y 是一種含3 6 個(gè)氨基酸的單鏈 多肽，屬胰多肽家族。在細(xì)胞中人n p y 首先表達(dá)成9 7 個(gè)氨基酸妁n p y 蛋白原前體，剪 切掉2 8 個(gè)氨基酸信號肽后成n p y 蛋白原，最后被蛋白酶剪切成n p y c f l a n k i n g 多 肽( c f l a n k i n gp e p t i d eo f n p y ，c p o n ，6 8 9 7 a a ) 和成熟的n p y ( 2 9 6 4 ) 。 x 射線晶體結(jié)構(gòu)圖像提示, n p y 的三維空間結(jié)構(gòu)有兩個(gè)相互平行的螺旋區(qū)，兩個(gè)螺旋之 間以疏水鍵相連，以維持n p y 分子的三級結(jié)構(gòu)。n p y 分予的n 端和c 端各有一個(gè)酪氨 酸和酪氨酰氨殘基。c 端的?；瘜 p y 的生物活性至關(guān)重要。n 端的酪氨酸殘基 參與穩(wěn)定n p y 三級結(jié)構(gòu)和n p y 與受體的結(jié)合，冊0 除n 端的酪氨酸殘基將使n p y 與受 體的親和力大為降低。n p y 廣泛分布于哺乳動物的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。l a n g 等將 n p y 在p c i 2 細(xì)胞中表達(dá)，證實(shí)了h p n p y e g f p 與多巴胺1 3 羥化酶共存，說明c p o n 一一一 2 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 一e g f p 與n p y 一樣都位于l d c v s ，并且應(yīng)用t i r f m 進(jìn)行n p y 標(biāo)記的l d c v s 動力學(xué)研 究【”1 。 r a n d 等二j ：1 9 9 3 年克隆了囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體基因 強(qiáng) ，乙酰膽堿( a c h ) 在軸突 末梢的胞漿內(nèi)合成后，被v a c h t 運(yùn)送到突觸小泡中儲存 1 7 2 1 。v a c h t 的定位限制在膽 堿能神經(jīng)元，特另咀是其末梢小泡的膜上及周圍的軸漿中。s a n g y o u n g 研究表明小腸 有大量的v a c h t 的免疫反應(yīng)的神經(jīng)終末出現(xiàn)于肌問神經(jīng)叢和粘膜下神經(jīng)叢及外層 的肌肉中，并認(rèn)為v a c h t 為目前最可靠的乙酰膽堿存在及其量多少的標(biāo)志物 2 2 】。分子 生物學(xué)和免疫組化研究已經(jīng)證明v a c h t 主要定位：j t ：s l m v s 2 3 1 ，v a r o q u i 等人證明 v a c h t 的n 端主要是a c h 的結(jié)合位點(diǎn)，將人的v a c h t 的n 端換成囊泡單胺類轉(zhuǎn)運(yùn)載體 ( v e s i c l em o n o a m i n et r a n s p o r t e r ，v m a t 2 ) 的n 端，其結(jié)合a c h 親和力降低了7 倍， v a r o q u i 同年也證明了其定位信號位于v a c h t 胞質(zhì)部分e 端尾巴，使得v a c h t 能定位 于s l m v s l 2 02 4 1 。 圖1 1 大鼠v a c h t 氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：v a c h t 有1 2 個(gè)跨膜區(qū)，在n 端 有兩個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)，在c 端有一個(gè)蛋白激酶c 的位點(diǎn)，紅色代表所有囊泡轉(zhuǎn) 運(yùn)體的保守位點(diǎn)，藍(lán)色代表所有v a c h t 的保守位點(diǎn)，黑色代表所有v a c h t 唯一的 膜內(nèi)保守氨基酸。 本研究通過e g f p 與v a c h t 融合標(biāo)記s l m v s ，用n p y 與d s r e d 2 融合標(biāo)記 3 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 l d c v s ，以p c i 2 細(xì)胞為標(biāo)本，在同一個(gè)活細(xì)胞中分析研究l d c v s 年1 1 s l m v s 的轉(zhuǎn)運(yùn)、 分泌和胞吞的活動規(guī)律、分子機(jī)制和調(diào)控途徑。 1 2 分泌溶酶體 對于很多細(xì)胞類型而言，其所儲存分泌產(chǎn)物的受調(diào)控分泌是十分重要的。與一 些將分泌產(chǎn)物儲存在某些特異的分泌顆粒中的專職分泌細(xì)胞不同的是，有些細(xì)胞將 它們的分泌蛋白儲存在一個(gè)被稱為分泌溶酶體的雙功能細(xì)胞器中。從功能上講，分 泌溶酶體扮演著胞內(nèi)降解和分泌的雙重角色。最近的研究表明，擁有分泌溶酶體的 細(xì)胞具有與眾不同的分選與分泌途徑。由于人們發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞器與多種遺傳疾病有 關(guān)，分泌溶酶體的研究重要性空前突出起來。這些疾病通常是由于免疫功能，或者 色素沉著功能被削減而產(chǎn)生的。而這兩個(gè)功能通常都與分泌溶酶體有著緊密聯(lián)系2 ”。 分泌溶酶體作為一種特化的溶酶體形式仍然保有溶酶體的一些基本特征：如酸 性的內(nèi)環(huán)境并且含有一些相關(guān)的降解蛋自。但是分泌溶酶體的雙重功能使得它不但 具有常規(guī)溶酶體的老化蛋白降解功能，還被細(xì)胞用來存放新合成的分泌蛋白，并能 夠進(jìn)行受調(diào)控的分泌，因此又跟常規(guī)溶酶體區(qū)分開來。 只有少數(shù)細(xì)胞類型含有分泌溶酶體。例如自然殺傷細(xì)胞通過分泌儲存在分泌溶 酶體中的細(xì)胞溶解蛋白來識別并破壞受感染的或是腫瘤化的細(xì)胞【2 6 2 7 1 。7 0 年代初 n c i 的研究人員在研究t 細(xì)胞對靶細(xì)胞的特異殺傷時(shí)發(fā)現(xiàn)正常對照小鼠的脾細(xì)胞可 以象免疫小鼠的脾細(xì)胞一樣殺傷某些腫瘤細(xì)胞，繼而發(fā)現(xiàn)正常人外周血淋巴細(xì)胞也可 以天然殺傷某些癌細(xì)胞。這些細(xì)胞的殺傷功能不需要預(yù)先免疫或致敏，故取名為自然 殺傷細(xì)胞。并且在以后的研究中人們發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞不僅對癌細(xì)胞，對病毒，胞內(nèi)寄 生菌和老化變異細(xì)胞都具有極強(qiáng)的清除能力。自然殺傷細(xì)胞主要分布于外周血和髀 臟，主要功能為參與細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫、抗病毒感染、免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，此外， 自然殺傷細(xì)胞亦參與移植排斥反應(yīng)、自身免疫病和超敏反應(yīng)的發(fā)生。正是由于自然 殺傷細(xì)胞在對抗人體疾病中扮演著如此重要的角色，對其分泌特性的研究也就有著 重大的意義。 人們已經(jīng)在黑素細(xì)胞和血小板中發(fā)現(xiàn)了常規(guī)溶酶體，這說明在某些細(xì)胞中，常 規(guī)溶酶體和分泌溶酶體是可以共存的【2 8 1 。然而在自然殺傷細(xì)胞和c t l s 細(xì)胞中，人 一 4 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 們只發(fā)現(xiàn)分泌溶酶體的存在，因此這兩種細(xì)胞為我們提供了研究分泌溶酶體的良好 模型。 分泌溶酶體的生成途徑尚不清楚，由于普通分泌囊泡是從高爾基體出芽生成， 而溶酶體是從次級內(nèi)涵體演變而來，因而人們認(rèn)為分泌溶酶體是從高爾基體或者次 級內(nèi)涵體中生成的。圖1 2 給出了目前所知道的分泌溶酶體的生成途徑。對分泌溶酶 體生成機(jī)制的研究有著極其重要的理論和實(shí)際意義，本文通過b f a 破壞高爾基體的 功能，研究此時(shí)分泌溶酶體的生成情況，從而知道高爾基體在其生成過程中所起的 作用。 圖1 2 分泌溶酶體分選通路 已有報(bào)道指出自然殺傷細(xì)胞的分泌途徑中有蛋自激酶c 信號通路的參與f 2 9 。捌。 實(shí)際上，蛋白激酶c 的激活劑p m a 能夠引起自然殺傷細(xì)胞的大量分泌，而p k c 的 抑制劑卻可以抑制分泌的發(fā)生【32 1 。最近的研究也表明自然殺傷細(xì)胞對k 5 6 2 這種癌細(xì) 一一 s 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞系的殺傷作用完全由蛋白激酶c 信號通路調(diào)控，而不受其它通路影響p3 1 。雖然已 有很多證據(jù)證明蛋白激酶c 在自然殺傷細(xì)胞中起重要作用，但其對分泌溶酶體的實(shí) 際影響尚不得而知一。因此，在本研究中，我們應(yīng)用光學(xué)切片技術(shù)研究了p k c 信號通 路在分泌溶酶體生成過程中起到的作用。 成熟的分8 c 5 镕酶體同樣經(jīng)過了生物合成和降解運(yùn)輸，包括一些使細(xì)胞器正常運(yùn) 作的合成蛋白，如水解酶和分泌蛋白。他們通過特異的分選途徑從反面高爾基網(wǎng)到 達(dá)分泌溶酶體。在培養(yǎng)狀態(tài)中，靜止的c t l s 細(xì)胞不表現(xiàn)出分泌溶酶體的存在，通過 t 細(xì)胞受體刺激以后他們才表達(dá)出達(dá)到可以察覺的水平的分泌溶酶體蛋白成分。這說 明分泌溶酶體的出現(xiàn)和成熟與該細(xì)胞的殺傷功能有著密切關(guān)系【3 4 】。 6 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 p c i 2 細(xì)胞中兩種囊泡的標(biāo)記及分泌機(jī)制差異的初步研究 2 1 試驗(yàn)材料和方法 2 1 1 試驗(yàn)材料 2 1 1 1 實(shí)驗(yàn)儀器 全內(nèi)反射顯微鏡( t i l l ，o l y p m u s ，m g ) 快速凝膠成像分析系統(tǒng)( v i l b e r l o u r m a t ) 高速冷凍離心機(jī)( s i g m a ) 精密電子天平( m e t t l e r ) 電泳儀( b i o r a d ) h q 4 5 a i i 恒溫?fù)u床( 國產(chǎn)) 電熱恒溫水浴鍋( 國產(chǎn)) 紫外分光光度計(jì)( t h e r m o ) c 0 2 培養(yǎng)箱( f o r m a ) 低速離心機(jī)( b e c k m a nc s 一6 r ) 滅菌鍋( 國產(chǎn)) 超凈臺( h o l t e nl a m i n a i rh b2 4 4 8 k ) 培養(yǎng)箱( 國產(chǎn)) 2 1 1 2 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒 p c i 2 細(xì)胞( a t c c ) 大腸桿菌菌株t o p 0 1 0 ( i n v i t r o g e n ) p e g f p - n 1 ( c l o n t e c h ) p e g f p c1 ( c l o m e c h ) p d s r e d 2 - - n 1 ( c l o n t e c h ) 2 1 1 3 試劑 限制性內(nèi)切酶：e c o ri 、b a m hi ( n e we n g l a n db i o l a b s ，n e b l 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 其它工具酶：p f ud n a 聚合酶( s t r a t a g e n e ) t 4 d n a 連接酶( n e b ) d n a 分子量標(biāo)記：d n al a d d e rm i x ( m b i ) 試劑盒：p c r 回收試劑盒( q i a g e n ) 膠回收試劑盒( q i a g e n ) 其它id n t p ( 1 0 m ma m s h a m ) 高糖d m e m ( g i b c o ) 馬血清( g i b c o ) 胎牛血清( g i b c o ) g 4 1 8 ( g i b c o ) 酵母粉( m e r c k ) 蛋白胨( m e r c k ) 瓊脂粉( m e r c k ) 其他試劑均購于s i g m a 2 1 1 4 溶液與培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)時(shí)的細(xì)胞外液為1 3 5m mn i c l ，2m mk c l ，5m mc a c l 2 ，2m mm g c l 2 2 0 m mg l u c o s e ，1 0m m h e p e s ，p h7 2 。 加樣液為7 7m mn a c l ，6 0m mk c l ，5m mc a c l 2 ，2m mm g c t 2 ，2 0m mg l u c o s e ， 1 0 m m h e p e s ，p h7 2 。 p c i 2 細(xì)胞培養(yǎng)基為8 5 高糖d m e m ，1 0 馬血清，5 胎牛血清。 2 1 2 實(shí)驗(yàn)原理與方法 2 1 2 1p c i 2 細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)可分為兩大類：原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞指的是直接 從動物身上獲得經(jīng)分離后平板培養(yǎng)的細(xì)胞。大多數(shù)分化的細(xì)胞都不能無限的繼續(xù)生 長分裂，因此大多數(shù)原代細(xì)胞都不能長期存活。傳代細(xì)胞己適于在培養(yǎng)基中生長， 而且能在離體外生長繁殖很多年。與原代細(xì)胞相比傳代細(xì)胞來源于一個(gè)單細(xì)胞，其 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 細(xì)胞物質(zhì)有更好的同源性，又可無限的生長。然而細(xì)胞可以在培養(yǎng)基中無限繁殖的 現(xiàn)象，說明這種細(xì)胞已丟失了一些正常細(xì)胞的分化性質(zhì)更接近瘤細(xì)胞。 在神經(jīng)學(xué)的研究中p c i 2 細(xì)胞得到了廣泛的應(yīng)用。這種細(xì)胞系是由g r e e n e 和 t i s c h l e r 在1 9 7 6 年發(fā)現(xiàn)的，它來源于被輻射小鼠身上的可移植的腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞。 2 0 多年來，研究者們用這種傳代細(xì)胞在神經(jīng)生物學(xué)方面取得了突破性的成績。當(dāng)培 養(yǎng)基中加入動物血清時(shí)，p c i 2 細(xì)胞形態(tài)變圓邊緣發(fā)亮以高密度增殖。這些條件下， p c i 2 細(xì)胞表現(xiàn)了許多與未成熟的神經(jīng)脊細(xì)胞相關(guān)的性質(zhì)，這些神經(jīng)脊細(xì)胞最終會分 化為腎上腺嗜鉻細(xì)胞或者交感神經(jīng)元。當(dāng)細(xì)胞在涂有p o l y l l y s i n e 的平板上生長 時(shí)p o l y l y s 會起到連接底物的作用，使細(xì)胞的增殖停止在存在特定營養(yǎng)物質(zhì)的情況下 開始細(xì)胞分化。這些營養(yǎng)物包括激素、糖皮質(zhì)激素或其它的化學(xué)物。 p c i 2 細(xì)胞培養(yǎng)p c i 2 細(xì)胞接種于d m e m 培養(yǎng)液中，含1 0 馬血清，5 胎牛血 清，1 5 0 r a g m | g e n t a m y c i n ，培養(yǎng)基配好后必須測其滲透壓，一般動物細(xì)胞培養(yǎng)基的滲 透壓應(yīng)維持在2 6 0 - - 3 2 0m o s m k g 之間，對于d m e m 培養(yǎng)基滲透壓一般在2 9 0 m o s m k g 左右。滲透壓太高或太低都不利于細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為3 7 、5 c 0 2 飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 至1 j 3 天換液，待單層培養(yǎng)細(xì)胞生長至6 0 8 0 匯合后，胰 酶p e d t a 消化傳代。將消化后的細(xì)胞離心后計(jì)數(shù)，按每：t l 5 1 0 4 接種于2 4 孔板，每孔 中預(yù)先放置p o l y l l y s i n e 涂層蓋玻片，在含完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 4 d , 時(shí)。 穩(wěn)定細(xì)胞系轉(zhuǎn)染兩天后用含8 0 0m g m lg 4 1 8 的完全培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染的p c i 2 細(xì) 胞，第一周每2 天換一次液，第2 周后每3 天換液，3 周后用含2 0 0m g m l 的完全培養(yǎng)基 培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的p c i 2 細(xì)胞。 2 1 2 2 熒光蛋白技術(shù) 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白是g f p 的一個(gè)紅移突變體 3 5 - 3 8 】，在哺乳動物細(xì)胞中有高的 表達(dá)量，能激發(fā)出更強(qiáng)的熒光( 4 8 8m 有最大光吸收、最大發(fā)射峰為5 0 7r i m ) 。e g f p 有2 個(gè)氨基酸替代f 6 4 l 和$ 6 5 t ”1 ，還根據(jù)人的密碼子偏好性突變了1 9 0 多個(gè)堿基 1 4 0 。 - 紅色熒光蛋白( d i s c o s o m as p r e df l u o r e s c e n tp r o t e i n ，d s r e d ) 是從d i s c o s o m a s p 分離得到的一種2 8 k d 的熒光蛋白【4 ”，和以前熒光蛋白相比，對極端p h 值和光漂白 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論丈 作用都有極好的抗性，但也存在一些缺點(diǎn)，如強(qiáng)的四聚體作用和成熟慢。而快速成 熟，可溶的蛋白質(zhì)可以降低對宿主細(xì)胞的毒性。d s r e d 2 是d s r e d 的突變體，具有成 熟快和較低的非特異性聚合能力等特性，d s r e d 2 有一系列根據(jù)人密碼子偏好性的無 聲突變【4 2 】，有6 個(gè)氨基酸替代，其中a 1 0 5v ，1 1 6 1 t 和s 1 9 7 a 是為了在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中 快速表達(dá)，r 2 a ，k 5 e 及k 9 t 是防止蛋白質(zhì)聚合體的形成【4 3 】。 由于g f p ( 及其衍生基因) 和d s r e d 等作報(bào)告基因可直接將基因表達(dá)的時(shí)間和空 間聯(lián)系起來，對研究基因表達(dá)的定位是最有效的手段。將g f p 基因與目的基因構(gòu)建成 嵌合基因，其表達(dá)產(chǎn)物重組蛋白是帶有熒光標(biāo)記。用這種方法可以很方便地研究目的 基因的表達(dá)、定位和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。 標(biāo)記對象：質(zhì)膜上的受體【4 4 】和離子通道 ”1 、囊泡 4 6 和s n a r e 相關(guān)蛋白【4 7 1 、細(xì) 胞骨架【4 8 等。 應(yīng)用：膜融合、受體胞吞與循環(huán)或降解、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)空間分布、蛋白 質(zhì)相互作用【4 9 1 等。本研究中所用到的p e g f p - n i c 1 和p d s r e d 2 - - n 1 是c l o n t e c h 公 司專門為將g f p 和d s r e d 基因與目的基因構(gòu)建成嵌合基因，用于研究目的基因的表達(dá)、 定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的真核表達(dá)載體。本文所用質(zhì)粒載體均由夏勝博士構(gòu)建，得到的載體有 p e g f p - - n 1 c 1 一v a c h t 、p e g f p n 1 c l n p y 、p d s r e d 2 - - n 1 c 1 一v a c h t 、 p d s r e d 2 - - n 1 c 1 一n p y 。 2 1 2 3 轉(zhuǎn)染 應(yīng)用電穿孔和脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染p c i 2 細(xì)胞。 電穿孔法，由于核酸自身并不能進(jìn)入細(xì)胞，故它們需要幫助來跨越細(xì)胞邊界的 物理障礙，到達(dá)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。許多類型的細(xì)胞在電流的刺激下會可逆地 使膜去穩(wěn)定并誘導(dǎo)水分子通道或膜孔的蹶時(shí)形成，使核酸分子能夠進(jìn)入。這種方法 就是電穿孔法，它能迅速、簡單、有效的將核酸導(dǎo)入各種細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母菌、 植物細(xì)胞及大量的哺乳動物細(xì)胞系。與其它常用的導(dǎo)入外源物質(zhì)的方法相比，電穿 孔具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，不必象顯微注射那樣用到實(shí)驗(yàn)玻璃針，不需要技術(shù)培訓(xùn)， 可以一次對成百萬的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。第二，與用化學(xué)物質(zhì)或病毒法進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)相比， 電穿孔幾乎沒有生物或化學(xué)副作用。第三，電穿孑l 是一個(gè)物理方法，較少依賴細(xì)胞 1 0 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 類型，因而應(yīng)用廣泛。實(shí)際上，對大多數(shù)細(xì)胞類型，用電穿孔基因的轉(zhuǎn)移效率比化 學(xué)方法高得多。 當(dāng)膜電壓從生理值0 1 上升到0 5 一i 0v 時(shí)就可以觸發(fā)膜結(jié)構(gòu)的改變。電穿孔的 刺激作用能使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化產(chǎn)生暫時(shí)的疏水孔，孔的直徑在2n l t l 與數(shù)納米之間不 等。當(dāng)跨膜電壓上升時(shí)許多大的疏水孔會轉(zhuǎn)變成親水性的孔，因?yàn)樾纬赏瑯拥目姿?需的能量減小了。而且維持大的親水性孔的外周所需的能量也比疏水性孔的要低。 因此親水孔的存在時(shí)間更長并且與細(xì)胞骨架的連接也會使其更穩(wěn)定。這種能長時(shí)間 存在的代謝孔的形成保證了在跨膜電壓恢復(fù)到低電位后小離子和分子進(jìn)入或離開細(xì) 胞。對于分子穿過親水孔的詳細(xì)機(jī)理仍不知道，可能包括了電泳、電滲、融合及胞 吞作用。將細(xì)胞保持在零攝氏度可延遲孔的隨機(jī)關(guān)閉。當(dāng)孔維持在開放狀態(tài)時(shí)，進(jìn) 入細(xì)胞的d n a 的量可達(dá)0 5p g 。1 5 0 k b 的d n a 可以輕易的通過孔，所以核酸的大小 似乎并不是一個(gè)阻抗因素。核酸可直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而不暴露在胞吞體和溶酶體的酸 性環(huán)境中。這條路線也解釋了為什么用電穿孑l 法轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞的核酸的突變率 會比用磷酸鈣共沉淀法或d b 址一葡聚糖復(fù)合物的要低。 一般說來，在較高的電場強(qiáng)度下有5 0 至7 0 的細(xì)胞會被殺死。這種致死作用 不是因?yàn)榧訜峄螂娊猓才c電流密度和能量輸入無關(guān)，致死強(qiáng)度隨著不同的細(xì)胞類 型而變化。但是細(xì)胞的死亡與電場強(qiáng)度及處理時(shí)間有關(guān)。殺死細(xì)胞的晟可能的原因 就是細(xì)胞膜的破壞，這會導(dǎo)致細(xì)胞迅速的失去離子平衡以及細(xì)胞內(nèi)容物外流。 影響電穿孔效率的三個(gè)重要因素：時(shí)間t ，電場強(qiáng)度，、及脈沖形狀。市場上出售 的大多數(shù)電穿孔儀都是用電容器放電來產(chǎn)生可控制的脈沖，時(shí)間t 是一個(gè)常數(shù)，大 小等于電壓降到峰值的3 7 時(shí)所需的時(shí)間。當(dāng)電容直接對兩電極間的樣品放電時(shí)， 電極間的電壓值迅速上升到峰值( v 。) 且依照下列方程在時(shí)間t 內(nèi)下降。 v t = v 。e e f ( t j t ( 以秒記) 等于電阻r ( 以歐姆記) 與電容c ( 以法拉弟記) 的乘積。 f r c 因此可根據(jù)廠家的指導(dǎo)來控制電容器或改變培養(yǎng)基的離子強(qiáng)度從而改變時(shí)間t 。 從這個(gè)等式可以知道( 1 ) 大電容器需要更多的時(shí)間來對已知電阻的培養(yǎng)基放電( 2 ) 當(dāng)培 l l 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 養(yǎng)基的電阻升高時(shí)給定大小的電容器放電的速度會越來越慢。 電場強(qiáng)度e 的大小與提供的電壓v 成正比，與兩電極間的距離d 成反比，距離 d 通常由脈沖通過的樣品池的尺寸決定。 e 2 f ( v ，d ) 大多數(shù)廠家都提供了三種尺寸的樣品池，電極間的距離分別為o 1c m ，0 2c m 及0 4 e r a o 當(dāng)用1 0 0 0 v 的電壓對這些樣品池放電時(shí)，0 1g i l l 的樣品池的e 。為1 0 0 0 0 v c m 0 2 c m 的樣品池的e 。為5 0 0 0v c m ，0 4 c m 的樣品池的e 。為2 5 0 0v c m 。 脈沖的形狀由電穿孔儀決定。大多數(shù)市售的儀器產(chǎn)生的波形都呈指數(shù)式衰減， 由電容器放電時(shí)產(chǎn)生。 除此之外，電穿孔前，電穿孔時(shí)及電穿孔后的溫度，核酸的濃度和構(gòu)象，細(xì)胞 的生長狀態(tài)都影響著電穿孑l 的效率。通常電穿孔前細(xì)胞都要在0 預(yù)冷，電穿孔后 置于0 ( 使膜上的孔維持在開放狀態(tài)) 然后再涂布在溫暖的培養(yǎng)基上。線形d n a 適用于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化，環(huán)狀的d n a 適用于瞬時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。d n a 的濃度最好在1 g m l 至8 0i _ t g m l 之間。當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)期的中期分裂活躍時(shí)，可得到最好的結(jié)果【4 3 l 。 收獲細(xì)胞，5 0 0 轉(zhuǎn)分鐘離心，棄上清培養(yǎng)基加入無菌p h 7 4 的p b s 重懸細(xì)胞， 再離心5 0 0 轉(zhuǎn)分鐘，棄上清加入預(yù)冷的無菌p b s 重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度為1 0 7 個(gè)m t 左右。加8 0 0 m 細(xì)胞懸液于4 m m 預(yù)冷的小池中另加入3 3 9 9 質(zhì)粒，冰浴2 分鐘。本 實(shí)驗(yàn)中電壓和電容的設(shè)置參考了大量的文獻(xiàn)。在這些文獻(xiàn)中大多數(shù)電容都設(shè)置為9 7 5 u f ，電壓設(shè)置為3 6 0v 。電擊后將小池置冰上2 分鐘，加lm l 預(yù)冷的培養(yǎng)基清洗電 擊池，轉(zhuǎn)于培養(yǎng)瓶中，然后加4m l 培養(yǎng)基，3 7 培養(yǎng)4 小時(shí)，用p b s 清洗兩次，然 后加5m 1 預(yù)熱的培養(yǎng)基3 7 培養(yǎng)。 e f f e c t e n et r a n s f e c t i o nr e a g e n t 是一種n o n - l i p o s o m a l 的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒， e n h a n c e r 緩沖液首先濃縮d n a 分子，然后e f f e c t e n er e a g e n t 將d n a 包裹到陽離子 脂質(zhì)體中，使d n a 能有效的轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞( 圖2 5 ) 。具有簡單快速、不需去 除轉(zhuǎn)染溶液、不需無血清條件和高效低毒的特點(diǎn)。 1 2 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 下 圖2 1e f f e c t e n e t r a n s f e c t i o nr e a g e n t 轉(zhuǎn)染原理示意圖。首先帶正電荷的 e n h a n c e r 包裹帶負(fù)電荷的d n a 分子，使其成中性顆粒，然后脂質(zhì)雙層包 裹中性顆粒成脂質(zhì)體。 2 肛g 純化的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在1 0c m 培養(yǎng)皿的p c i 2 細(xì)胞，具體操作過程如 1 、 在1 0c m 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長到4 0 7 0 的密度時(shí)，即在轉(zhuǎn) 染前一天換l om l 完全培養(yǎng)基，3 7 。c5 c 0 2 培養(yǎng)。 2 、加2 g 質(zhì)粒d n a ( 經(jīng)q 1 a g e n m i d ip l a s m i d k i t s 純化) 到3 0 0g l e c 緩 沖液中，混勻，然后加1 6g le n h a n c e r 緩沖液，振蕩混勻，在室溫下放置5 分 鐘。質(zhì)粒d n a 的質(zhì)量對轉(zhuǎn)染的效率和對細(xì)胞的毒性都非常重要。 3 、 加6 0g le f f e c t e n et r a n s f e c t i o nr e a g e n 到d n a e n h a n c e r 混和液中，振蕩 混勻，在室溫下放置1 0 分鐘。 4 、 吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用1 0m l p b s 清洗細(xì)胞，然后加入7m 1 完全培養(yǎng)基。 5 、 加3m 1 完全培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)染溶液中混勻，然后緩慢將轉(zhuǎn)染溶液滴入到培養(yǎng) 皿中，緩慢晃動培養(yǎng)皿使其與培養(yǎng)基充分混勻。 華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 6 、 將培養(yǎng)皿放入3 7 5 c 0 2 培養(yǎng)培養(yǎng)箱