（細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)論文）d半乳糖誘導(dǎo)生物體衰老與細(xì)胞衰老模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 d 一半乳糖誘導(dǎo)生物體衰老與細(xì)胞衰老模型的實(shí)驗(yàn) 研究 細(xì)胞生物學(xué)專業(yè) 研究生邢玉芝指導(dǎo)教師胡火珍 摘 研究目的本研究擬通過對(duì)自由基的檢測(cè)及細(xì)胞、生物體的衰老生物學(xué)改 變相關(guān)性的研究，探討d 一半乳糖( d g a l a t o s e ，d g a l ) 誘導(dǎo)后的自由基損 傷，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 衰老、生物體衰 老三者之間的相互關(guān)系，以期能夠揭示在衰老過程中，自由基引起生物體 衰老的細(xì)胞學(xué)機(jī)理，試圖在生物體及細(xì)胞水平上建立一個(gè)良好的老化模 型，為認(rèn)識(shí)衰老和最終找到推遲衰老的方法提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 研究方法 1 小鼠衰老模型的建立：取昆明種小鼠4 0 只，稱重，隨機(jī)分成2 組，每組2 0 只分對(duì)照組、造模組；對(duì)照組每天給予生理鹽水0 3m l 頸背部皮下 注射，造模組給予5 d g a l0 3m l 頸背部皮下注射。連續(xù)給藥6 0d 。 2 小鼠衰老指標(biāo)的檢測(cè)：觀察兩組小鼠的體征及行為學(xué)變化，檢測(cè)大腦 組織內(nèi)、血清內(nèi)s o d 及m d a 含量的變化，檢測(cè)皮膚s o d 、m d a 及 羥脯氨酸含量變化。 3 m s c s 衰老模型的建立：取2 月齡s d 大鼠m s c s 分離培養(yǎng)至第3 代， 置于含8 9 幾o(hù) - g a l 的培養(yǎng)液中再傳至第3 代作為誘導(dǎo)組，而在原培 養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至第6 代的為對(duì)照組。 4 m s c s 衰老指標(biāo)的檢測(cè)：通過光鏡、透射電鏡觀察兩組m s c s 形態(tài)和 結(jié)構(gòu)變化，繪制兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行b 一半乳糖苷酶染色，流 式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布變化和單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)d n a 損傷方 法檢測(cè)其衰老后的生物學(xué)行為變化，檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)s o d 及m d a 的 ， 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 含量變化。 研究結(jié)果 1 小鼠衰老：( 1 ) 體征及行為的變化：造模前兩組動(dòng)物反應(yīng)良好，毛發(fā) 光滑，飲食正常，行動(dòng)敏捷。造模組小鼠頸背部皮下注射d g a l 后4 周后部分小鼠體重開始減輕，行動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)干枯發(fā)黃、 缺乏光澤，雙頰脫毛明顯，尾部出現(xiàn)色素斑點(diǎn)沉著并逐漸加重，嗜睡。 ( 2 ) 皮膚改變：造模組較之對(duì)照組皮膚彈性降低。m d a 明顯升 高。s o d 、羥脯氨酸含量減少。( 3 ) 對(duì)自由基的作用的影響：造模組小 鼠腦組織內(nèi)、血清內(nèi)s o d 含量降低及m d a 含量升高。 2 m s c s 衰老：( 1 ) 誘導(dǎo)組m s c s 鏡下呈典型的衰老細(xì)胞形態(tài)，增殖速 度減慢；對(duì)照組m s c s 形態(tài)均勻，長(zhǎng)勢(shì)良好。( 2 ) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)表 明加入d - g a l 誘導(dǎo)后9 0 m s c s 停留在g o g l 期，而s 期和g 2 m 期 m s c s 近于消失，并隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)趨勢(shì)越明顯；對(duì)照組m s c s 各期 比例正常。( 3 ) 誘導(dǎo)組約8 0 呈b 半乳糖苷酶活性陽(yáng)性染色，對(duì)照 組染色為陰性。( 4 ) 單細(xì)胞凝膠電泳示誘導(dǎo)組m s c sd n a 有拖尾現(xiàn) 象，對(duì)照組m s c s 無d n a 損傷。( 5 ) 對(duì)自由基的作用的：誘導(dǎo)組m s c s 內(nèi)s o d 含量降低、m d a 含量升高 研究結(jié)論d ：a l 能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠衰老，對(duì)s d 大鼠m s c s 的老化具有 誘導(dǎo)作用，初步推斷8 白最適濃度，為研究衰老的機(jī)制及抗衰老提供了 研究提供了一個(gè)較為理想的研究平臺(tái) 關(guān)鍵詞d 半乳糖：自由基；生物體衰老；骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞衰老 4 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 s t u d i e so na n i 蚣la g i n ga n dc e l ls e n e s c e n c e m o d e li n d u c e db yd g a i 。a c t o s e m a y o r c e i l - b i o l o g y c n a d t l a t es t u d e n t ：x i n gy u z h i s u p e r v i s o r ：p r o f h uh u o - z h e n a b s t r a c t o b j e c t i v e o u rs t u d yf o c u s e do nr e s e a r c ht h ec o r r e l a t i o na m o n gt h e o x i d a t i v ed a m a g e s t e mc e l ls e n e s c e n ea n da n i m a la g i n g b ym e 越u 磚t h e q u a n t i t yo ff r e er a d i c a l ，m o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a lc h a n g e so fa n i m a la n d c e i lm o d e l w ew a n tt oe x p l a i n st h a td - g a l a e t o s ei n d u c i n gs u b a c u wa g i n g m o i l s em o d e li sr e l a t e dt oc a u s et h eo x i d a t i v es t r e s sd a m a g e s ，a n dw a n tt o p r o v i d e sag o o dm o d e lo fa n i m a la g i n ga n ds t e mc e l l s s e n e s c e n e i v e a n d r e f e r e n c e sf o rf l l l - t h e rr e s e a r c hi na g i n g m e t h o d s 1 d - g a li n d u c e da g i n ga n i m a lm o d e l ：t h e3 - w c e k - o l dm i c ew e f ed i v i d e d i n t ot w og r o u p sa tr a n d o m ，t w e n t yi ne a c hg r o u p n o r m a lc o n t r o lg r o u p w a sg i v e ns a l i n e ( 0 3 m 1 ) e v e r yd a y ，d g a lg r o u pw a sg i v e n5 d - g a l a e t o s e ( 0 3 h a ) e v e r yd a y s a l i n ew a t e ra n dd g a l a c t o s ew 讎g i v e n b yi n t r a p e r i t o n e di n j e c t i o n ，a n dt h e yw e f cf e dw i t hf e e ds t u f f s a l i n e w a t e ra n dd g a i a c t o 辯w e mg i v e nf o r8w e e k s a f t e ro n ew e e k 蛐) p p e dt h e i n j e c t i w ec o u e c t e da l lt i s s u e s 2 t h ed e t e c t i o no fa g i n gs i g n s ：w eo b s e r v e dt h ec o n s t i t u t i o n a la n da e t i o a c h a n g e so fe a c hg r o u p 。a n dm e a s u r e dt h ea c t i v i t i e so fs o da n dm d a i n s e r u mts k i na n dt i s s u e sw i t hb i o c h e m i s ym e t h o d s 3 d g a li n d u c e dc e l l u rs e n e s c e n c em o d e l ：m s c si n d e n t i f i e d w e i ef e l li n t o 5 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 t w ot e a m s ：c o m p a r i s o nw e r et h c3r dg e n e r a t i o ni nd m e m - f 1 2m e d i u m w i t h o u td - g a l a c t o s e ，a n dt h ei n d u c e m e n tw e r ec u l t u r e di nd m e m - f 1 2 m e d i u mc o n t a i n i n g8g ld g a l a t o s ea f t e r3g e n e r a t i o n 4 t h ed e t e c t i o no fs e n e s c e n c i v es i g n s ：o p t i c a la n de l e c t r o n i cm i c r o s c o p e ， 蛔i n gg r o w t hc u r v e ，f l o wc y t o m e t e r ，s i n g a lc e l lg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d f l - g a l a c t o s ed y ew e r eu s e dt oi d e n t i f yt h ei n f l u e n c e so fc h a r a c t e r i s t i c m o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a l m a r k e r s o f m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s i n d u c t e db yd m e m f 1 2m e d i u mc o n t a i n i n g8 9 ld - g a l a t o s e w e m e a s u r e dt h ea c t i v i t i e so fs o da n dm d ao fe a c hg r o u pc e l lw i t h b i o c h e m i s t r ym e t h o d s r e s u l t s 1 a n i m a la g i n g ：t h en o r m a lc o n t r o lh a dm a n ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sf r o m t h em o d e lg r o u pi nc o n s t i t u t i o n a la n da c t i o n e g ：t h em o d e lg r o u p b e c a m e ，a c t i o ns l a c ka n dl a g g i n g , l e s so ft h ew c i g h t h a i rs c o c ha n dl e s s l u s t e ra n dh a dm o r es l e e p s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm d ac o n t e n t so f n o r m a lc o n t r o lg r o u p ，d e c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a t i nd - g a l g r o u p ，a n dt h ea c t i v i t yo fs o di n c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a ti n d - g a lg r o u p 2 c e l ls e n e s o e n c e ：a f t e rt r e a t m e n tw i t hd - g a l a t o s e ，m e s e n c h y m a ls t e m c e l l sd i s p l a y e dm o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a lc h a n g e so fc e l ls e n e s c e n c e w i t ht h es e n e s c e n c t i v ec h a r a c t e r i s t i cm o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ；8 0p e r c e n t s o fc e l l sa r ex - g a ld y em a s c u l i n e ，s i n g a lc e l lg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w d n ad a m n i f i c a t i o n f l o wc y t o m e t e rs h o w s9 0p e rc e l l ss t a yi ng o ，g 1 ，b u t sa n dg e md i s a p p e r da l m o s t w h i l et h ec o m p a r i s o nh a sn o tt h e s e s e n e s c e n c i v ep h e n o m e n a t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tm d ac o n t e n t so f n o r m a lc o n t r o lg r o u p ，d e c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a ti nd g n l g r o u p , a n dt h ea c t i v i t yo fs o di n c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a ti n d g a lg r o u p g o n clu sio n sd - - g a l a t o s ec a ni n d u c t e dm i c ea n dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s 6 嬰型奎蘭塑主蘭竺堡苧 s e n e s c e n c e ，a n d8 9 nw a st h eb e s t t h u st h i ss t u d yp r o v i d e sag o o dm o d e lo fr a t a g i n ga n ds t e mc e l l ss e n e s c e n c i v e t h e s es t u d i e sw i l ld om u c ht ot h e m a n u f a c t u r eo ft h ed r u g sa n de v a l u a t i o no fm e a s u r e st or e s i s ta g i n g , k e yw o r d s ：d - g a l a c t o s e ；m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ：c e l ls e n e s c e n c e ； a n i m a la g i n g 7 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 引言 近年來，我國(guó)逐步進(jìn)入老齡化社會(huì)“1 ，有效地維護(hù)老年人的健康，防 治衰老相關(guān)性疾病成為人們普遍關(guān)注的社會(huì)問題。因此，研究衰老發(fā)生機(jī) 制及延緩衰老圓進(jìn)程，也成為當(dāng)今學(xué)術(shù)界倍受重視的領(lǐng)域。在衰老的研究 中，合適的衰老動(dòng)物模型對(duì)于深入研究衰老機(jī)制，篩選、研制抗衰老藥物 具有重要意義。 研究發(fā)現(xiàn)“”連續(xù)給動(dòng)物注射臚半乳糖能誘導(dǎo)出許多衰老生物學(xué)改 變，甚至是衰老的特異性酶的改變。在體內(nèi)d 半乳糖受半乳糖合成酶的作 用，可氧化產(chǎn)生大量自由基，如0 2 和h2 0 z 等活性氧，從而引起脂質(zhì)過 氧化作用的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷跚；同時(shí)過氧化脂質(zhì)( 1 e o ) 的分解 終產(chǎn)物如m d a 可與d n a 或r n a 及蛋白質(zhì)和磷脂的有關(guān)物質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞 膜成分改變、功能障礙，促進(jìn)衰老舊； 細(xì)胞作為生命活動(dòng)的基本單位，細(xì)胞老化是機(jī)體衰老的核心，通過細(xì) 胞衰老的研究可了解衰老的某些規(guī)律，以往的研究多是對(duì)二倍體成纖維細(xì) 胞的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)干祖細(xì)胞是介導(dǎo)組織修復(fù)和 更新的主要細(xì)胞群體，在生物體內(nèi)，干，祖細(xì)胞數(shù)量和功能隨齡下降，這是生 物體衰老的原因之一目前的研究顯示，m s c 的終末分化有可能跨越胚層界 限，超越傳統(tǒng)意義上的分化為中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞，而向?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化， 如分化為心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，有著廣泛的l 臨床應(yīng)用前景。而且體外擴(kuò) 增實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)m s c s 生長(zhǎng)性狀穩(wěn)定，1 、3 、5 代細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)曲線和貼壁 率無顯著差異；體外擴(kuò)增容易、接種存活率高、適應(yīng)能力強(qiáng)及增殖速度快， 所以利用d r 半乳糖誘導(dǎo)m s c s 作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透哂衛(wèi) 臨床研究意義和 穩(wěn)定性。 所以本研究擬通過對(duì)自由基的檢測(cè)與觀察體內(nèi)外衰老生物學(xué)特性改 變，探討自由基損傷、d 一半乳糖致衰老小鼠模型、d 卜一半乳耱致m s c s 衰老 模型三者的相互關(guān)系，以期能夠揭示衰老過程中，自由基引起生物體衰老 的細(xì)胞學(xué)機(jī)理，并試圖在生物體及于細(xì)胞水平建立一個(gè)良好的老化模型， 為認(rèn)識(shí)衰老和最終找到推遲衰老的方法提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 b 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 材料與方法 2 1 材料 2 1 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2 - 3 周昆明小鼠4 0 只，雌雄各半 2 月齡雄性s d 大鼠3 只 均購(gòu)自四川大學(xué)華西校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 2 1 2 主要試劑 d m 跚f 1 2 培養(yǎng)基、m t t 、胰酶均購(gòu)自美國(guó)g i b c o 公司， 小牛血清購(gòu)自成都生物制品有限公司， d m s o 分析純購(gòu)自成都化學(xué)試劑廠， x - g a l ( s i g m a ，美國(guó)) ， p e r c o l l 分離液( l0 7 3g m l ，p h a m a e i a ，美國(guó)) ， d - 半乳糖購(gòu)自上海伯奧生物技術(shù)有限公司) ， 低熔點(diǎn)瓊脂糖和正常熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自英國(guó)o x o i d 公司， 超氧化物歧化酶( s o d ) 測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所， 丙二醛( m o a ) 測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所 2 1 3 主要實(shí)驗(yàn)溶液和緩沖液的配置 紲照堡差旦巫抗的配置方法： 一般市售青霉素8 0 萬u 瓶，溶于4 m l ，每1 0 0 0 m l 培養(yǎng)液加0 5 m l ，終濃 度為1 0 0u m e ；一般市售鏈霉素1 0 0 萬u 瓶，溶于5 m l ，每1 0 0 0 m l 培養(yǎng) 液加0 5 m l ，終濃度為1 0 0u l n l ! 墼壘拯緩?fù)?1 0 貯存液組分為；1 0 8 9t r i s 堿，5 5 9 硼酸，4 0 m l0 5 me d t ap h 8 0 ， 加水至1 l 1 工作液濃度為：8 9 m mi r i s 堿，8 9 m m 硼酸，2 i i l me d t a ；使用前將貯存 液稀釋1 0 倍即可 9 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 湟化乙錠【墜墼2 溶液 1 0 x 貯存液濃度為1 0 m g m l ，在2 0 m l 水中溶解o 2 9e t b r ，混勻后4 避 光保存，由于e t b r 是誘變劑，要小心操作 1 x l 作液濃度為1 p g 肛l ，使用前將貯存液稀釋1 0 倍即可 薹= 鯉! 鎏色違厘醋酸= 里醛固定潼配制 x - g a l 染色液：1 0 0r e t o o l 【，磷酸鈉( p h7 3 ) ，1 3n n o l l 氯化鎂。3m m o l l 鐵氰化鉀，3 砸i l o l l 亞鐵氰化鉀，1m g m lx - g a l ；以上經(jīng)0 4 5m 的膜過 濾。 固定液：甲醛1 0 l i l l ，冰醋酸3 d ，生理鹽水加至1 0 0 m l 。 2 i 4 主要儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱( m c o1 5 a c ) 為s a n y o z 司產(chǎn)品 倒置顯微鏡為重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品 酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀惠普公司 u v - 7 5 0 4 紫外可見分光光度計(jì)上海欣茂儀器有限公司 恒溫水浴箱深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司 普通離心機(jī)上海手術(shù)器械廠 勻漿器上海醫(yī)療器械廠 2 2 技術(shù)路線 2 2 1d 一半乳糖致昆明小鼠衰老的模型的構(gòu)建及檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組一造模一自由基檢測(cè)生物體衰老生物學(xué)特征 2 2 2d - 半乳糖i 變m s c s 擬衰老模型的構(gòu)建及檢測(cè) 細(xì)胞的分離培養(yǎng)一造模一自由基檢澍細(xì)胞衰老生物學(xué)特征觀察 2 3 實(shí)驗(yàn)方法 2 3 1d 一半乳糖誘導(dǎo)昆明小鼠衰老模型的構(gòu)建1 5 7 期 2 3 1 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 取昆明種小9 4 0 只，稱重，隨機(jī)分成2 組，每組2 0 只分空白對(duì)照組、造模 組。 空白對(duì)照組每天給予生理鹽水0 3m l 頸背部皮下注射，造模組給予5 d - 半乳糖0 3m l 頸背部皮下注射。連續(xù)給藥6 0 d 。 自由取食，飲用自來水。室溫保持在( 2 0 1 ) ，自然光照下飼養(yǎng)。 2 3 1 2 衰老指標(biāo)檢測(cè) 2 3 1 2 1 血清s o d 及m d a 的測(cè)定 于末次注射藥物2h 后，從眶下及心臟采血2 0 m l 。 血液立即離心( 3 5 0 0 r m i n ) 1 0m i n ，吸取上清液作s o d 及m d a 含 量檢測(cè) ( s o d 檢測(cè)試劑盒、m d a 檢測(cè)試劑盒) 。 紫外分光光度儀測(cè)定造模組和對(duì)照組小鼠血清的吸光度值。 2 3 1 2 2 大腦s o d 活性測(cè)定 采血后迅速斷頭，取出雙側(cè)皮層，用冰冷生理鹽水漂洗，除去血液， 濾紙吸干，稱重，放入小燒杯，冰浴。 生理鹽水：組織按9 ：1 的比例，先加總量的2 ，3 生理鹽水于小燒杯、剪碎、 倒入勻漿器，另1 3 生理鹽水沖洗小燒杯后倒入勻漿器，手工勻漿。 取勻漿液，普通離心機(jī)3 0 0 0 r l m i n 離心1 5m i l l 。 取1 0 的組織勻漿上清再用生理鹽水按l ：9 稀釋成l 組織勻漿。 采用黃嘌呤氧化酶法( s o d 檢測(cè)試劑盒) ，予波長(zhǎng)5 5 0 r i m 處分別測(cè)定造模 組和對(duì)照組小鼠大腦組織勻漿液的吸光度值。 2 3 1 2 3 大腦m d a 含量測(cè)定 小鼠大腦組織蛋白勻漿和定量方法同上 采用1 1 3 a 比色法( m d a 檢測(cè)試劑盒) ，于波長(zhǎng)5 3 2 n m 處分別測(cè)定造模組和 對(duì)照組小鼠大腦組織勻漿液的吸光度值。 2 3 1 2 4 皮膚衰老的觀察 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 取背部皮膚，去除皮下脂肪及結(jié)締組織分兩部分， 第一部分取皮膚組織塊1 0 0m g 經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水漂洗。擬作皮膚組織 勻漿用，測(cè)定勻漿中超氧化物歧化酶( s o d ) 、過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛 d 囝a ) 第二部分取皮膚組織后，l ：i 丙酮一乙醚脫脂。切碎晾干，精密稱取2 0 0 m e ，作羥脯氨酸含量的測(cè)定。 2 3 2d - 半乳糖誘導(dǎo)m s c s 擬衰老模型的構(gòu)建” 2 3 2 1m s c s 的體外分離培養(yǎng) s d 大鼠斷頸處死后無菌操作，取雙側(cè)殷骨和脛骨，剔除周圍肌肉組織， 剪去兩骺端； 抽取5m l 無血清冷d m e m f 1 2 培養(yǎng)基( 含青霉素、鏈霉素各1 0 0u m 1 ) 沖洗骨髓腔，吹打制成單細(xì)胞懸液，注入含有5m lp e r c o l l 分離液離 心管中，離心半徑8c m ，20 0 0r m i n 離心2 0m i n ； 收集離心液界面上乳白色云霧狀的細(xì)胞層，先后以p b s 和d m e m 漂洗； 用含1 5 d 、牛血清d m e m f 1 2 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞； 計(jì)數(shù)3 5 1 0 5 個(gè)m l 后即接種于培養(yǎng)瓶中，置于3 7 、5 c 0 ：飽和濕 度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)； 分別于2 4 、7 2h 半換液，以后每3 天全量換液1 次。倒置相差顯微鏡 下觀察細(xì)胞培養(yǎng)全過程； 1 3d 后細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底8 0 時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以i ) 1 0 。個(gè)m l 終濃度傳 代，取傳至第6 代細(xì)胞為對(duì)照組。 2 3 2 2m n 檢測(cè)細(xì)胞活力 取第三代m s c s 按lx1 0 5 個(gè)m l 接種于9 6 孔板，在3 7 5 c o ：的飽和 水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)接近融合狀態(tài)時(shí)，換含不同濃度d - g a l 為0 、4 、8 、1 2 、1 6g l l1 0 0 斗l 培養(yǎng)液， 等體積p b s 作空白對(duì)照組，每組做5 個(gè)平行樣品， 1 2 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 7 2h 后吸去培養(yǎng)液，p b s 洗滌2 次，每孔加入m t u r ( 5m g m 1 ) 2 0 i ll ， 繼續(xù)培養(yǎng)4h ，棄上清，加入1 5 0pld m s o 振蕩1 0m i n ， 用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定5 7 0 舢的吸光度( 彳) 值 根據(jù)細(xì)胞存活率= 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞一空白對(duì)照對(duì)照組細(xì)胞一空白對(duì)照1 0 0 計(jì)算細(xì)胞活力。 2 3 2 3m s c s 衰老模型的建立 取第三代m s c s 改換在含8g ld - g a l d m i ! m - f 1 2 培養(yǎng)液培養(yǎng)， 繼續(xù)培養(yǎng)再傳至第3 代，即為d - g a l 誘導(dǎo)的大鼠m s c s 衰老模型，作為誘 導(dǎo)組。 2 3 2 4 細(xì)胞周期分析 將對(duì)照組改換于含8g ld - g a l d m e m - f 1 2 培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 分別用0 2 5 胰酶消化對(duì)照組及培養(yǎng)i 、2 、3 及4d 的m s c s ，每個(gè)樣本收 集約l 1 0 個(gè)m s c s ，p b s 洗2 次后懸浮于o 5m lp b s 中，充分吹散混勻。 將細(xì)胞懸液加k sm l7 0 冷乙醇中，4 c 固定過夜。 離心半徑8c m , l2 0 0r r a i n 離一b l om i n ，棄乙醇，冷p b s 洗2 次后懸浮于 0 5m l p b s h b ，加入碘化丙啶im l ( 終濃度為5 0m g m 1 ) 室溫避光反應(yīng)3 0m i n 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 2 3 2 5 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取對(duì)照組和誘導(dǎo)組m s c s ，分別以1 1 0 個(gè)m l 細(xì)胞懸液接種于2 4 孔培 養(yǎng)板： 當(dāng)單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)8 0 融合時(shí)，每2 4h 消化收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。苔 盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，每組計(jì)數(shù)3 孔，計(jì)算均值： 共記數(shù)7d ，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 2 3 2 6x g a l 染色 將對(duì)照組和誘導(dǎo)組m s c s 分別接種于6 孔扳，調(diào)整細(xì)胞密度為2 5 1 0 個(gè) 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 m l ； 待長(zhǎng)成單層后，吸凈培養(yǎng)液，加入lm l 醋酸甲醛固定液： 室溫固定3 0r a i n ； 吸凈固定液，p b s 洗滌3 次，每次3m i n ； 吸凈p b s ，每孔加入lm lx - g a l 染色液； 3 7 孵育4 6h ，保鮮膜封住6 孔板防止蒸發(fā)； 直至大部分m s c s 變藍(lán)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。 2 3 2 7 單細(xì)胞凝膠電泳觀察【l l l 用細(xì)玻璃條在普通載玻片上自制約1 5 1 5 c m 2 的微電泳槽； 鋪膠：1 層為正常熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠層，作為底層；2 層分別為對(duì)照組和 誘導(dǎo)組m s c s 懸液與低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠混合后的凝膠層；3 層為低熔點(diǎn)的 瓊脂糖凝膠覆蓋層； 裂解：將微電泳槽置于新鮮配制的中性裂解液中，4 冰箱中裂解1 5 h ： 解旋：取出微電泳槽，用雙蒸水漂洗去掉多余的鹽分，置于提前加入0 5 t b e 電泳液的水平電泳儀中解旋2 0 r a i n ； 電泳：在2 0 v ，2 0 0 m a 電泳條件下電泳2 0 m i r a 染色和觀察：2 地g m l 溴化乙錠( e b ) 染色。雙蒸水漂洗，去掉多余染液， 在熒光顯微鏡下觀察，并用數(shù)碼相機(jī)攝取圖像。 2 3 2 8 透射電鏡觀察 分別取兩組m s c s 培養(yǎng)液4m l 以離心半徑8c m , 12 0 0r m i n 離，h i 0m i n ： 棄上清，加入0 3 戊二醛固定液，4 c 靜置3 0m i n ： 再以離心半徑3 c m , 1 20 0 0r m i n 離一0 1 5m i n ： 棄上清，加入3 戊二醛固定液，固定6 0m i n ； 經(jīng)脫水、包埋、超薄切片后透射電鏡下觀察。 2 3 2 9 自由基測(cè)定 采用黃嘌呤氧化酶法( s o d 檢測(cè)試劑盒) ，于波長(zhǎng)5 5 0 1 l m 處分別測(cè)定各實(shí) 1 4 四川大學(xué)硬士學(xué)位論文 驗(yàn)組和對(duì)照組m s c s 內(nèi)的吸光度值； 采用t b a 比色法( m d a 檢測(cè)試劑盒) ，于波長(zhǎng)5 3 2 n m 處分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組 和對(duì)照組m s c s 內(nèi)的吸光度值。 2 3 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用s p s s l 0 0 軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。組問 比較t 檢驗(yàn)，以，值 0 0 5 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3 結(jié)果 3 1d 一半乳糖誘導(dǎo)生物體衰老模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3 1 1d - 半乳糖對(duì)造模組小鼠的體征及行為學(xué)變化 造模前兩組動(dòng)物反應(yīng)良好，毛發(fā)光滑，飲食正常，行動(dòng)敏捷。造模組 小鼠頸背皮下注射d 一半乳糖后1 月余部分小鼠體重開始減輕，行動(dòng)緩慢， 反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)于枯發(fā)黃、缺乏光澤，雙頰脫毛明顯，尾部出現(xiàn)色素斑點(diǎn) 沉著并逐漸加重，嗜睡。對(duì)照組無明顯變化。 3 1 2d - 半乳糖對(duì)造模組小鼠血清及大腦組織自由基含量變化 造模組與空白對(duì)照組比，大腦及血清中m d a 明顯升高，而s o d 含量降低 ( p o 0 5 ) ，提示造模成功。( 見表1 ) 衰l 大腦組織及血清中s o d 和m d a 的含量變化 注：與對(duì)照組比較。p o 0 5 腳o 3 1 3d 一半乳糖對(duì)造模組小鼠皮膚組織中抗氧化指標(biāo)的影響 造模組與對(duì)照組比。皮膚d p m d a 明顯升高( p 0 0 5 ) 。s o d 、羥脯氨酸 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 含量減少( p 0 0 5 ) ，提示造模成功。( 見表2 ) 衰2 皮膚組織中s o d m d a 及羥脯氨酸含量的含量變化 注：與對(duì)照組比較，p o 0 5 , , i - - - 2 0 3 2d 一半乳糖誘導(dǎo)m s c s 擬衰老模型制作 3 2 1m s c s 體外分離培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的m s c s 于2 4h 后開始貼壁，細(xì)胞伸展成梭形、橢圓形或多角 形；4 8h 有細(xì)胞集落形成，貼壁細(xì)胞增多；4d 呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)； 1 0d 細(xì)胞集落不斷擴(kuò)大而融合成單層( 圖1 ) 。傳代m s c s 生長(zhǎng)較原代快，7 d 即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征，隨代數(shù)增加m s c s 得到純化，梭形細(xì)胞占9 0 以上( 圖2 ) 。誘導(dǎo)組m s c s 形態(tài)及排列不規(guī)則， 體積較大，胞漿區(qū)域增大，漿核的比例增加，胞漿中可見較多顆粒或空泡 ( 圖3 ) 。 圖1 原代培養(yǎng)的m s c si 0d 1 0 0圖1 原代培養(yǎng)的m s c s1 3dx1 0 0 1 6 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖2 傳至第5 代的m s c s 1 0 0 圖3 誘導(dǎo)組m s c 8x 2 0 0 3 2 2 肼檢測(cè)細(xì)胞活力 0 、4 、8 、1 2 和1 6g l 各組吸光度( a ) 值分別為：0 2 4 1 、0 2 3 0 、0 2 0 1 、 0 1 3 6 、0 0 9 2 ，空白對(duì)照組為0 0 3 9 ；各組存活率分別為：9 6 7 0 o 0 4 、 8 4 4 0 0 0 2 、4 7 8 0 0 0 4 、2 6 4 0 0 0 3 及2 1 2 0 0 0 2 ，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p 0 0 5 ) 。根據(jù)存活率選用8 9 r , d - g a l 建立m s c s 的衰老模型。 表3m t t 檢測(cè)各組吸光度a 值結(jié)果l n = 5 ，x - + 8 ) 竺! 生望墾室皂塾曼! 芝! 芝! 芝! ! 蘭! ! ! ! 光度值0 0 3 9 0 2 4 10 2 3 00 2 010 。1 3 6 0 0 9 2 與對(duì)照組比較p 值 y o u n g a c t i v es t e mc e l l 夠a p e p c t i cs t e mc e l lj * o j da c t i v es t e mc e l l 圖1 伴隨著生物體衰老，干細(xì)胞的功能潛能下降年輕的千細(xì)胞總體細(xì)胞很少具有凋亡細(xì)咆 的特點(diǎn)，它由大量的靜止細(xì)胞和活動(dòng)細(xì)胞組成，這些細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力和分化潛能 這些年輕的干細(xì)胞分化為淋巴和髓樣系統(tǒng)( a ) 由于細(xì)胞損傷的積累，衰老的干細(xì)胞總體會(huì)表現(xiàn)出 很高的捅亡率，在這些千細(xì)胞內(nèi)只有少量的靜止細(xì)胞，而且活動(dòng)的干細(xì)胞的分化能力也是受到 限制的( ”當(dāng)機(jī)體育遺血的需求老的干細(xì)胞總體，它們的凋亡宰增加。靜止期的細(xì)胞也不能成 功的完成激活的過程，導(dǎo)致靜止期干細(xì)胞的不足活動(dòng)的干細(xì)胞分化受到限制，分化的細(xì)胞數(shù)目 也是減少的，這就導(dǎo)致機(jī)體的修復(fù)變得緩慢( c ) 比如研究者們認(rèn)為“，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并不具有永生性“干”細(xì) 胞的特征，表現(xiàn)出最終的壽命。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠終生存在，隨著年 齡地增加，細(xì)胞的數(shù)量和增值，分化能力下降。所以這類細(xì)胞是要衰老的， 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 只是衰老進(jìn)程緩慢例 5 細(xì)胞衰老的研究模型 在衰老的研究中，合適的衰老動(dòng)物模型對(duì)于深入研究衰老機(jī)制，篩選、 研制抗衰老藥物具有重要意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者設(shè)計(jì)衰老動(dòng)物模型有很多 種，c h r i s t o p h e r 等人在1 9 7 9 年首先提出了半乳糖性白內(nèi)障發(fā)生機(jī)理，是新 陳代謝異常在晶體方面產(chǎn)生的病理變化。隨后，國(guó)內(nèi)學(xué)者利用大劑量d _ 半乳糖造成動(dòng)物的糖代謝障礙，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)代謝和脂類代謝，致使動(dòng) 物不僅出現(xiàn)老年性白內(nèi)障，而且還出現(xiàn)晶體病變以外的其它組織、細(xì)胞一 系列退行性變化，也符合人類自然衰老時(shí)所出現(xiàn)的癥狀d 半乳糖所致的 體外衰老模型是我國(guó)學(xué)者基于衰老的代謝學(xué)說而復(fù)制成功的，該模型是在 一定的時(shí)間內(nèi)給動(dòng)物連續(xù)注射d _ 半乳耱，使其細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在 醛糖還原酶催化下，還原成半乳糖醇，后者不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積 在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終 機(jī)體衰老嘲 自由基引起的細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)中生物膜的主 要成分是極性脂質(zhì)和膜蛋白質(zhì)。由于極性脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸具有易與 f r 結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)極易發(fā)生過氧化反應(yīng)呻1 。線粒體是細(xì)胞的氧化中 心和功能基地，為細(xì)胞提供細(xì)胞的生物合成、運(yùn)輸活動(dòng)、信息傳遞等生理 活動(dòng)所需的能量。線粒體損傷、酶功能的不足可使a d p 轉(zhuǎn)化為a t p 的過程受 限，造成能量的生成不足，嚴(yán)重影響細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，降低細(xì)胞的活 力線粒體除了進(jìn)行氧化反應(yīng)以外，還有攝取和積聚c a 2 , 調(diào)節(jié)胞漿內(nèi)游離 c a 2 + 濃度的作用呻1 。線粒體的損傷和a t p 供應(yīng)不足等因素可使鈣泵失活， 大量釋放細(xì)胞內(nèi)結(jié)合鈣，鈣離子增加，加重細(xì)胞內(nèi)鈣的超載。細(xì)胞內(nèi)鈣超載 可引起一系列該依賴性酶的失控。如一氧化氮合成酶，進(jìn)一步加劇自由基 反應(yīng)，抑制細(xì)胞的能量代謝”1 ，加重細(xì)胞的損傷，引起細(xì)胞的衰老。這一 造模機(jī)理己在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用，并得到了證實(shí) 由上面的細(xì)胞類型介紹。可知干細(xì)胞是具有增殖、自我更新，多分化 潛能的一類特殊細(xì)胞，在個(gè)體發(fā)育中，起著維持成體組織器官的完整性方 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 面起著關(guān)鍵的作用。干細(xì)胞的功能和數(shù)量是維持人體器官生長(zhǎng)和新陳代謝 的源泉?jiǎng)恿?，也是機(jī)體修復(fù)衰老退行性病變最重要，是決定生命衰老的關(guān) 鍵因素。近年來的研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的壽命是有一定限度的，當(dāng)其增殖的群 體達(dá)到一定限度時(shí)，便進(jìn)入一個(gè)不可逆的生長(zhǎng)阻滯階段，他們認(rèn)為這就稱 為干細(xì)胞衰老，m s c s 等成體干細(xì)胞也不例外干細(xì)胞的衰老表現(xiàn)在細(xì)胞數(shù) 量上減少，質(zhì)量( 增殖、自我更新能力，分化潛能) 降低。而質(zhì)量上的變 化更重要，這涉及自我更新潛能，發(fā)育分化潛能以及與細(xì)胞外信號(hào)之間的 相互作用等。體外培養(yǎng)條件下的干細(xì)胞仍可以繼續(xù)分裂增殖，所以在細(xì)胞 水平上。通過外界刺激干細(xì)胞導(dǎo)致的衰老作衰老模型，便具有增殖穩(wěn)定性、 指標(biāo)檢鍘明確性，所以干細(xì)胞是較好的細(xì)胞衰老模型。 6 細(xì)胞衰老的機(jī)理 隨著老年醫(yī)學(xué)引入分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)理論與技術(shù)，衰老機(jī)理的 研究開始從整體水平發(fā)展到了分子水平脅。捌近半個(gè)世紀(jì)以來，已經(jīng)提出 了一系列衰老學(xué)說，印大中等隨剮總結(jié)重要的衰老學(xué)說主要有：整體水平的 衰老學(xué)說、器官水平的衰老學(xué)說、細(xì)胞水平的衰老學(xué)說和分子水平的衰老 學(xué)說等。 其中細(xì)胞水平的衰老學(xué)說有：細(xì)胞膜衰老學(xué)說、體細(xì)胞突變衰老學(xué)說、 線粒體損傷衰老學(xué)說慨“、溶酶體( 脂褐素) 衰老學(xué)說、細(xì)胞分裂極限學(xué)說 ( 程控學(xué)說) 口釘；分子水平的衰老學(xué)說有：端粒縮短學(xué)說洶。制、基因修飾衰 老學(xué)說m “1 、d n a 修復(fù)缺陷衰老學(xué)說慨”、自由基衰老學(xué)說啪“研、氧化 衰老學(xué)說洶1 ，非酶糖基化衰老學(xué)說【州、羰基毒化衰老學(xué)說“”和微量元素 衰老學(xué)說等等。近幾十年來，先后提出過多種假說，試圖來解釋衰老的本 質(zhì)和機(jī)理，有不少的學(xué)說和假說已被普遍公認(rèn)和接受。未來人們對(duì)衰老的 分子機(jī)制的研究將進(jìn)一步深入。我們下面就目前的研究介紹如下： 6 1 錯(cuò)誤成災(zāi)學(xué)說 1 9 7 3 9 0 r g e l e 提了細(xì)胞大分子合成錯(cuò)誤成災(zāi)說f 4 2 1 意思是說，細(xì) 胞里的核酸和蛋白質(zhì)在生物合成中如果由于某些原因而發(fā)生差錯(cuò)，這差 四川大爭(zhēng)碩士學(xué)位論文 錯(cuò)會(huì)得到累積而迅速擴(kuò)大，引起代謝功能大幅度降低，造成衰老。對(duì)這 個(gè)假說可以進(jìn)一步說明如下：在細(xì)胞里核酸造出蛋白質(zhì)( 酶) ，因?yàn)榈鞍?質(zhì)是用核酸分子傲樣板合成的；蛋白質(zhì)造出核酸，因?yàn)楹怂岬暮铣尚枰?酶，例如聚合酶的協(xié)助。酶是蛋白質(zhì)，所以核酸和蛋白質(zhì)在合成中形成 一種循環(huán)，相互聯(lián)系，相互協(xié)作，相互制約如果在一次循環(huán)中，出現(xiàn) 一個(gè)錯(cuò)誤，這錯(cuò)誤會(huì)在下一次循環(huán)中得到擴(kuò)大。這樣，錯(cuò)誤在幾次循環(huán) 中會(huì)很快擴(kuò)大而成災(zāi)，使細(xì)胞功能大大降低，造成衰老。最近，在人工 培養(yǎng)的人的成纖維細(xì)胞工作的基礎(chǔ)上，從上述細(xì)胞中提取d n a 聚合酶， 利用這種酶進(jìn)行d n a 復(fù)制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述成纖維細(xì)胞經(jīng)過4 0 次到5 6 次的繼續(xù)培養(yǎng)，其d n a 聚合酶的活性顯著地降低了，大約降低到只有正 常細(xì)胞的1 5 活性。從此以后，這些細(xì)胞就迅速衰老而死亡了。 研究者還做了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)，他們從年老的( 即經(jīng)過很多次繼代培養(yǎng) 的) 和年輕的( 只經(jīng)過若干次繼代培養(yǎng)的) 上述成纖維細(xì)胞分別提i 黜d n a 聚合酶，用人工合成d n a 參j 子作樣板，進(jìn)行離體d n a 復(fù)制實(shí)驗(yàn)，得到一 些有趣的結(jié)果，人工合成的d n a 分子有意搞成只含堿基腺嘌呤( a ) 和胸腺 嘧啶c i ) ，而不含有胞嘧啶( c ) 和鳥嘌呤( g ) ，按照核酸分子堿基配對(duì)的原理， 在d n a 合成中，a 只能和t 配對(duì)，t 只能和a 配對(duì)因此在上述離體實(shí)驗(yàn)中， 如果d n a 聚合酶能忠實(shí)執(zhí)行任務(wù)，那么所含成的d n a 分子中就不能含有c 或g 的堿基如果所提出的d n a 聚合酶在幫助合成d n a 分子中，用了一個(gè) c 或一個(gè)g 去合成d n a ，就算是一次錯(cuò)誤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從經(jīng)過5 6 次繼 代培養(yǎng)的上述衰老細(xì)胞中提取出來的d n a 聚合酶，在合成d n a 分子中， 比從年輕細(xì)胞中取出來的d n a 聚合酶要多犯好幾次錯(cuò)誤。這表示衰老細(xì) 胞中的d n a 聚合酶大概在成分上有一些改變，不能忠實(shí)地進(jìn)行工作，累 積的錯(cuò)誤多。 6 2 外部干擾學(xué)說 此說認(rèn)為細(xì)胞衰老既不是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)差錯(cuò)，也不是由蛋白質(zhì)異常引 起，而是由外源性干擾造成的1 例如，自由基受外源性干擾，就會(huì)引起 衰老。自由基是失去電子的分子。在體內(nèi)，它是由空氣污染、輻射以及正 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文 常代謝過程中產(chǎn)生的它們對(duì)許多生物功能非常重要，認(rèn)為沒有自由基 的生物就不能生存自由基與其它分子作用得到電子，其中一些隨機(jī)作用， 對(duì)細(xì)胞和機(jī)體組織十分有害。這些效應(yīng)的積累便導(dǎo)致了人體的衰老自由 基是衰老的根源。衰老的原因9 9 是由此造成的自由基造成的變化或作 用的積累不斷增加，引起了衰老，這種自由基可能專門破壞細(xì)胞合成和修 復(fù)d n a 的能力，尤其是在線粒體內(nèi)。 6 3 發(fā)育程序衰老學(xué)說 某一物種的衰老表征的共同性表明，衰老受到潛在的基因控制。一個(gè) 典型的與衰老相關(guān)的基因途徑的例子來自于線蟲。線蟲孵化后，幼蟲經(jīng)過4 個(gè)階段直接發(fā)育為成蟲，或者進(jìn)入一個(gè)稱為持久態(tài)( d a u e r ) 的休眠狀態(tài)。處 于這種狀態(tài)的幼蟲在環(huán)境適宜的情況下可繼續(xù)發(fā)育為成蟲。持久態(tài)的幼蟲 能生存6 個(gè)月之久，而正常發(fā)育的成蟲壽命僅有數(shù)周。參與這種發(fā)育決定的 許多基因已被克隆。根據(jù)持久態(tài)形成基因( d a u e